石小霞，褚可成，陳志梅，薛林貴

（蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅蘭州730070）

固定化細胞技術及其應用

石小霞，褚可成，陳志梅，薛林貴*

（蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅蘭州730070）

介紹了細胞固定化的方法、常用細胞固定化載體海藻酸鈉和聚乙烯醇的研究，綜述了固定化細胞技術在工業(yè)、環(huán)境中的應用，并對其發(fā)展前景進行展望。

固定化細胞，方法，載體，應用

固定化細胞是指細胞受到物理化學等因素被約束或限制在一定的空間范圍內，但細胞仍保留催化活性并具有能被反復或連續(xù)使用的活力［1］，1959年，Hattori和Furusaka首次應用樹脂吸附法吸附E.coli，實現(xiàn)了細胞固定化；20世紀70年代固定化細胞技術在固定化酶基礎上逐步發(fā)展形成，與酶固定化相比較，其具有以下優(yōu)點：a.無需進行酶的分離提??；b.酶的穩(wěn)定性高；c.可進行細胞酶體系的多步酶反應等。因此，固定化細胞技術比固定化酶技術發(fā)展更迅速，應用更廣泛。細胞固定化具有細胞密度大、可增殖、縮短發(fā)酵周期、發(fā)酵穩(wěn)定性好、可實現(xiàn)反復使用、有利于產品的分離提取等特點，在連續(xù)反應中占有明顯的優(yōu)勢，主要被應用于工業(yè)、農業(yè)、醫(yī)學、化學分析、環(huán)境保護、能源開發(fā)等領域。但細胞固定化也有其缺點：易產生副產物；細胞質膜與其他質膜的存在使傳質難度增加；細胞自溶導致產物濃度下降等制約了它的應用。合適的固定化載體的選擇是細胞固定化的關鍵［2］，目前對固定化細胞的研究頗多，國內外學者對載體性能也進行大量的深入研究。本文就細胞固定化方法與載體的選擇、細胞固定化及其應用和發(fā)展前景進行綜述。

1 細胞固定化方法

細胞固定化方法的分類就有很多種［3］，目前國內外還沒有統(tǒng)一的分類標準。如成慶利［4］等人根據有無外加載體，將細胞固定化分為有載體固定化和無載體固定化，崔建濤等［5］對有載體固定化細胞和無載體固定化細胞的研究應用進一步作了詳細敘述。在細胞固定化方法上基本上與固定化酶技術相似，常用的細胞固定方法有吸附法、包埋法、交聯(lián)法、共價結合法、絮凝法以及多種固定化法聯(lián)用等，其中以吸附法和包埋法最為常見。

1.1 包埋法

包埋法是指將細胞定位于凝膠網格內或聚合物半透膜微膠囊中，形成的結構可以防止細胞滲漏，但允許底物進入、產物擴散出。具有細胞容量大、條件溫和、操作簡便、酶活力高、回收率高、固定化細胞球的強度高等優(yōu)點，是固定化細胞中應用最多的方法。其缺點是擴散阻力大、不適合催化大分子底物與產物的轉化。常用的載體有卡拉膠、聚乙烯醇、瓊脂、明膠及海藻膠等。

1.2 共價結合法

依靠細胞表面上功能團和固相支持物表面的反應基團之間形成化學共價鍵連接，從而成為固定化細胞。該方法具有細胞與載體結合緊密、不易脫落等優(yōu)點，但是反應劇烈、條件難控制、細胞活性損失大、制備較難。

1.3 交聯(lián)法

該方法主要是通過多功能試劑與細胞表面的基團（巰基、羥基、氨基等）發(fā)生化學反應形成共價鍵，實現(xiàn)細胞的固定化。該方法的突出特點是細胞與載體結合緊密，但化學反應劇烈，使細胞活性大大降低，制備麻煩，故交聯(lián)法的實際應用很少。戊二醛、甲苯二異氰酸酯、雙偶氮聯(lián)苯等是最常用的交聯(lián)劑。

1.4 吸附法

吸附法是細胞與載體間通過物理吸附或離子作用結合將細胞固定在載體上的方法。該方法操作簡單，對細胞的影響小，但是吸附力小、細胞易脫落。常用的吸附劑主要有硅藻土、多孔陶瓷、中空纖維、金屬絲網等，其廣泛應用于廢水處理中。

表1 各種細胞固定化方法的特征比較

2 固定化細胞載體的研究現(xiàn)狀

目前，固定化技術所使用的載體材料主要分為三大類：有機高分子材料、無機載體和復合載體［6］。有機高分子材料分為天然高分子載體如海藻酸鈉、明膠、卡拉膠等，一般對生物無毒性、傳質性能好、但強度低、壽命短、在厭氧環(huán)境下易被降解；另外一種是合成高分子載體，常見的有聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等，合成高分子載體強度大，但傳質性能差。無機載體有活性炭、硅藻土、砂粒、多孔陶珠、高嶺土、沸石等，主要是利用吸附和電荷效應將細胞固定住，具有機械強度大、無毒害、不易被降解、制備容易等特點。高分子載體和無機載體各有優(yōu)缺點，將其二者結合互補可形成復合載體。

理想的載體材料的選擇應具備：a.機械強度高、穩(wěn)定性能好、常溫易成型；b.對微生物低毒害、不易被微生物降解；c.具有多孔性、傳質快；d.沒有特異性吸附、有適合引入配基的官能團；e.壽命長、價格低廉等特點［7］。目前研究和應用比較廣的細胞固定化載體主要有海藻酸鈉和聚乙烯醇。

2.1 海藻酸鈉

海藻酸鈉是由d－甘露糖醛酸和L－古羅糖醛酸通過1，4鍵連接組成，具有無毒、來源豐富、價格低廉，并且操作簡便、條件溫和、適用于固定活細胞和敏感細胞等優(yōu)點，是一種廣泛應用的固定化介質。利用海藻酸鈉與鈣離子交聯(lián)形成不溶于水的凝膠，將細胞固定在凝膠小球中。

李娜等［8］對不同濃度的海藻酸鈉與不同濃度的氯化鈣反應包埋啤酒酵母細胞的條件進行了研究，發(fā)現(xiàn)用2%海藻酸鈉與4%氯化鈣制得的固定化細胞發(fā)酵性能和機械強度均最佳。

海藻酸鈉濃度對固定化細胞發(fā)酵具有重要影響，一般濃度越大凝膠性能越好，但是最適濃度的確定要根據具體實驗來選擇［9］。呂紅線［10］研究發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉濃度分別為1%、2%、3%、4%固定化細胞，L－乳酸發(fā)酵水平均低于游離細胞發(fā)酵水平，并且隨著海藻酸鈉濃度的增加而減少；1%濃度的海藻酸鈉制得的固定化細胞強度小、易破壁、穩(wěn)定性差；4%濃度穩(wěn)定性好，硬度過強，形成的膠珠直徑大，不利于生長；適當?shù)暮Ｔ逅徕c濃度可以確保發(fā)酵高產量、使固定化細胞穩(wěn)定性與活性都比較高。綜合考慮使用2%濃度的海藻酸鈉，選擇凝膠直徑2.5～3.0mm適用于發(fā)酵產酸。

宋慧一等［11］采用2種不同的方法針對海藻酸鈣凝膠在多價陰離子或高濃度電解質容易不穩(wěn)定，鈣離子易脫落，凝膠變軟等進行改性。方法分別為：a.添加法：在海藻酸鈉溶液中添加一定比例的Al2O3、MgO、CaCO3和SiO2，結果表明，MgO添加到固定化細胞中的效果最好，可以明顯增加固定化細胞的強度。進一步研究發(fā)現(xiàn)MgO質量分數(shù)為1%時，固定化強度最大。b.置換法：將固定化細胞在一定的置換溶液中置換 18h，置換物選用 ZnSO4、CuSO4、MnSO4、FeSO4、Al（NO3）3和AlCl3，發(fā)現(xiàn)Al（NO3）3效果最好，Al3+將海藻酸鈣置換出來，減少了磷酸鹽對固定化細胞的破壞。采用添加1%的Al（NO3）3可以獲得最長的壽命，酒精產率增加0.9%。

宋威［12］等采用明膠、瓊脂以及聚乙烯醇分別與海藻酸鈉混合制備成3種載體固定桔青霉細胞，通過對載體各項性能的研究結果發(fā)現(xiàn)，復合載體的包埋效果、傳質性能以及強度都明顯強于海藻酸鈉單載體包埋，產酶效果也明顯提高。海藻酸鈉與聚乙烯醇比例為1∶2時，載體機械強度、化學穩(wěn)定性、使用壽命長、重復性較好以及產酶能力好，具有很強的工業(yè)應用價值。

2.2 聚乙烯醇（PVA）

聚乙烯醇（Polyvinyl Alcohol，簡稱PVA）是一種人工合成的有機多聚體凝膠，作為包埋載體有機械強度高，化學性能穩(wěn)定、對微生物無毒、抗微生物分解能力強、價格低廉和使用壽命長等優(yōu)點［13］。近年來國內外進行了大量的研究。

目前，研究的聚乙烯醇細胞固定方法有三種：聚乙烯醇－硼酸交聯(lián)法，聚乙烯醇冷凍法以及聚乙烯醇與其他載體形成的復合載體固定法。利用聚乙烯醇和卡拉膠固定耶羅維亞酵母生產λ－癸內酯，聚乙烯醇80g/L、卡拉膠5g/L時，固定化細胞發(fā)酵能力提高了40%［14］。陳功等［13］分別研究了利用PAV冷凍法和PVA－H3BO3交聯(lián)固定法發(fā)酵酒精的性能，方法為：a.PVA冷凍法：8%PVA水浴至40℃與35℃菌液按10∶1比例混合，在－10℃條件下冷凍12h后室溫解凍30min，在相同條件下冷凍，最后取出室溫解凍，用生理鹽水沖洗，制成凝膠。b.PVA－H3BO3法：將加熱溶于水冷卻的10%聚乙烯醇與菌液按10∶1比例混合，用與無菌注射器滴入飽和硼酸液中交聯(lián)24h，交聯(lián)好顆粒用無菌水沖洗，浸泡數(shù)小時。將制成的載體放入發(fā)酵液發(fā)酵，結果表明，PVA－H3BO3適用于單批量發(fā)酵，PVA冷凍法多次連續(xù)發(fā)酵性能良好，并且乙醇產量良好，適用于連續(xù)發(fā)酵。

在固定化細胞技術中常采用聚乙烯醇作為包埋介質，但是聚乙烯醇固定化顆粒吸水性強，時間長了易碎。為了改進它的耐用性，就要改進水溶膨脹性［15］，海藻酸鈉與其共固定化可以有效彌補，利用海藻酸鈉與PVA共固定化細菌進行脫硫，發(fā)現(xiàn)小球強度增加，降解率提高，重復脫硫的能力也比游離細胞有很大提高［16］。李華子［15］等分別采用延時包埋法和加入化學藥劑法對聚乙烯醇－硼酸進行了改進，結果表明，延時包埋法處理和加入單體丙烯酸胺與交聯(lián)劑N，N′－亞甲基雙丙烯酰胺化學藥劑法使水溶性得到了改善，固定化細胞使用壽命增長。

2.3 其他載體

殼聚糖可以通過包埋、吸附等達到固定細胞的目的，是優(yōu)良的固定化細胞載體。以戊二醛為交聯(lián)劑，將殼聚糖球交聯(lián)引入醛基制備固定化酵母細胞殼聚糖球，得到的苯乙酮酸轉化率和D－扁桃酸的e.e值高于游離酵母細胞，且有操作和貯存穩(wěn)定性［17］；泡沫陶瓷作為細胞固定化載體研究很少，但是其性能完全達到固定化載體的要求，它作為細胞固定化材料是可行的；張?zhí)m等［18］采用廉價的陶土為材料，采用有機泡沫浸漬工藝對此進行了性能開發(fā)研究。聚氨酯泡沫在固定化培養(yǎng)盤基網柄菌［19］和固定化產脂肪酶粗狀假絲酵母細胞［2］的研究表明，這是一種性能優(yōu)良的載體，適合工業(yè)化使用。其他載體如膜載體、新型光交聯(lián)聚氨酯［20］等也得到廣泛的研究與應用。

3 固定化細胞的應用

固定化細胞的優(yōu)越性使其廣泛應用于醫(yī)藥、食品、輕工業(yè)、化工、環(huán)保、能源等領域，顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿?。以下主要介紹固定化細胞在工業(yè)和環(huán)保中的應用。

3.1 工業(yè)上的應用

固定化細胞研究與應用目前還處于研究階段，高性能固定載體的選擇與研發(fā)、固定化細胞性能與生產條件的研究、生物反應器的研發(fā)還有待發(fā)展，因此，大規(guī)模生產應用受到限制。但是，世界各國把固定化細胞研究的成果應用于生產已產生了很大的經濟價值。目前在生產酒精、啤酒、氨基酸、果葡萄糖漿、L－蘋果酸、抗生素等取得了初步的成果。固定化細胞用于發(fā)酵酒精的研究始于1976年，目前在工業(yè)生產中最成熟、最深入，常用海藻酸鈉、活性炭、纖維素、中空纖維等載體進行固定化發(fā)酵。陸兆新［21］等研究發(fā)現(xiàn)采用輻射聚合手段用HEA－GMA單體聚合固定酵母細胞，酒精產量是游離細胞的3倍；熊亞［22］等采用海藻酸鈉固定法對固定化酵母菌與游離酵母菌產酒精的酒度、酸度、發(fā)酵液糖度進行測定，結果表明，固定化酵母發(fā)酵產酒精的性能均好于游離酵母發(fā)酵。葡萄酒及果酒采用固定化發(fā)酵［23］質量和風味明顯改善提高。

3.2 環(huán)境保護方面的應用

近年來環(huán)境問題日益嚴峻，迫切需要一種高效、快速、二次污染小的廢水、廢氣處理方法。分離、篩選出優(yōu)勢菌種加以固定，增強了細胞對有毒或高滲物質的承受能力和降解能力，細胞固定技術得到了廣泛應用，可用于處理氨氮廢水、難降解的有機廢水、含BOD物質廢水、重金屬廢水、有色廢水、廢氣［24］等。難降解的有機廢水經人工固定化生物活性炭濾池對油類的去除率達到90%，COD去除率也高達80%，比未固定的活性炭濾池的處理效果好［25］。李海英等［26］用PVA包埋對氯代芳香類有機化合物具有高效降解的菌群，停留時間為2.3h時，對造紙漂白廢水去除率可穩(wěn)定在65%～82%。氧化亞鐵硫桿菌脫硫是一種有效的生物脫硫法，用聚胺樹脂泡沫、砂粒、硅石、焦炭等吸附法或海藻酸鈉、角叉菜膠等包埋法都能顯著提高氧化亞鐵硫桿菌的氧化活性［27］。

4 展望

固定化細胞技術因其優(yōu)點受到廣泛的關注，在應用中顯示了明顯的優(yōu)勢，但是目前不夠成熟，還處于研究探索階段。固定化方法的改進、尋求更新更適合于固定化的載體材料、優(yōu)良菌種選育、高效固定化生物反應器的研制、多細胞固定化生產的研究等是實現(xiàn)固定化細胞技術大規(guī)模應用的重要途徑，隨著生物、材料等技術的不斷發(fā)展進步，固定化細胞技術研究將會有更進一步的發(fā)展，獲得更廣泛的應用。

［1］陸志號.固定化細胞技術及其應用［M］.寧夏：寧夏人民出版社，1990：1.

［2］歐陽軍梅，段學輝，傅奇，等.聚氨酯泡沫固定產脂肪酶粗壯假絲酵母（Candida valida T2）細胞的研究［J］.生物加工過程，2008，6（6）：52－57.

［3］Karel S F，Libicki S B，Robertson C R.Chem Eng Sci［J］，1985，40（8）：1－321.

［4］成慶利，滑冰.固定化細胞研究進展［J］.河南教育學院學報：自然科學版，2003，12（2）：53－54.

［5］崔建濤，李建新，等.細胞固定化技術的研究進展［J］.農產品加工，2007（1）：24－26.

［6］全水清，傅凌艷.固定化技術載體PVA的比較研究［J］.江西化工，2007（1）：6－8.

［7］劉蕾，李杰.生物固定化技術中的包埋材料［J］.凈水技術，2005，24（1）：40－41.

［8］李娜，李樹立，郭忠鵬.固定化酵母細胞發(fā)酵啤酒的初步研究［J］.中國釀造，2007（9）：18－21.

［9］王秀娟，張坤生，等.海藻酸鈉凝膠特性的研究［J］.食品添加劑，2008，29（2）：259－262.

［10］呂紅線，林建強.固定化細胞生產乳酸的研究［J］.中國釀造，2008（11）：52－54.

［11］宋惠一，趙昊璐，等.酵母細胞酒精發(fā)酵固定化載體的改進［J］.食品工業(yè)科技，2008，29（2）：134－136.

［12］宋威，張芹，李歡慶，等.復合載體固定化細胞發(fā)酵生產核酸酶P1的對比研究［J］.河南工業(yè)大學學報，2008，29（3）：51－54.

［13］陳功，王聯(lián)結.不同方法制備PVA載體進行固定化細胞發(fā)酵酒精的研究［J］.食品科學，2007，28（6）：249－251.

［14］林芳，張偉國.固定化耶羅維亞酵母發(fā)酵生產λ－癸內酯［J］.生物技術，2008，18（5）：66－69.

［15］李華子，王建龍，文湘華，等.聚乙烯醇－硼酸固定化方法的改進［J］.環(huán)境科學研究，2002，15（5）：25－27.

［16］陳慶森.聚乙烯醇和海藻酸鹽共固定化冰核活性細菌－黃單胞菌TS206的研究［J］.微生物學報，2003，43（4）：492－497.

［17］李桂銀，黃可龍，等.殼聚糖球固定化酵母細胞的研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2007，7（7）：981－984.

［18］張?zhí)m，何洪泉，等.細胞固定化載體泡沫陶瓷的制備［J］.山東陶瓷，2004，27（6）：3－6.

［19］梁興超，盧英華，等.聚氨酯泡沫半固定化培養(yǎng)盤基網柄菌［J］.生物加工過程，2007，5（2）：52－56.

［20］賈德民，魏秀萍.新型光交聯(lián)聚氨酯固定化細胞載體的研究［J］.高分子材料與工程，1990（3）：32－38.

［21］陸兆新.輻射聚合物固定化酵母［J］.輻射研究與輻射工業(yè)學報，1993，11（1）：44－48.

［22］熊亞.固定化酵母菌與游離酵母菌產酒精作用的比較研究［J］.西南學院學報，2008，22（2）：45－48.

［23］王思新，焦中高.固定化細胞技術在葡萄酒及果酒發(fā)酵國的應用［C］.中國食品科學技術學會東方食品國際會論文集，2001：388－390.

［24］曹桂萍，黃兵，等.固定化細胞技術及其在廢氣治理中的應用［J］.貴州環(huán)保科技，2004，8（4）：11－15.

［25］姚宏，孫向東，等.難降解有機廢水回收中固定化技術研究［J］.哈爾濱工業(yè)大學學報，2003，35（12）：1471－1473.

［26］李海英，李小明.固定化微生物處理造紙漂白廢水［J］.工業(yè)用水與廢水，2001，32（5）：19－22.

［27］李志章，羊依金.生物脫硫中氧化亞鐵硫桿菌固定化技術的研究［J］.微生物學通報，2006，33（6）：57－61.

Cells immobilization technique and its application

SHI Xiao－xia，CHU Ke－cheng，CHEN Zhi－mei，XUE Lin－gui*
（School of Chemical and Biological Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070，China）

In this paper，the methods of immobilized cells and research on the common immobilized carriers of sodium alginate and PVA were introduced，meanwhile overview of application of immobilized cell technology in the industry and the environment，including prospect of its development prospects.

cell immobilization；methods；carrier；application

TS201.1

A

1002－0306（2010）12－0380－04

2009－11－11 *通訊聯(lián)系人

石小霞（1985－），女，研究生，研究方向：微生物生理生化。

甘肅省科技支撐計劃項目（090NKCA079）；國家自然科學基金項目（30870384）。