王 威,王聯(lián)結(jié)

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,陜西西安 710021)

陽離子抗菌肽分子設(shè)計的研究現(xiàn)狀

王 威,王聯(lián)結(jié)＊

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,陜西西安 710021)

隨著傳統(tǒng)抗生素的大量使用,許多病原微生物對抗生素產(chǎn)生了耐藥性。不斷尋找新一代的抗菌藥物已經(jīng)成為制藥科研工作者的共有目標(biāo)。陽離子抗菌肽具有相對分子量小、抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好和抗菌機理獨特等優(yōu)點,有望成為新一代的抗菌藥物。最大限度地提高其活性和穩(wěn)定性、降低毒性和成本,是抗菌肽新藥開發(fā)的首要問題。用分子設(shè)計手段改造抗菌肽已成為解決這一問題的關(guān)鍵。國內(nèi)外的研究者在抗菌肽的分子設(shè)計方面做出了大量的努力,本文對抗菌肽的人工設(shè)計方法進行綜述,分析了各種設(shè)計方法的優(yōu)缺點,同時對抗菌肽分子設(shè)計的發(fā)展前景進行了展望。

抗菌肽,兩親α-螺旋,分子設(shè)計

1 抗菌肽人工設(shè)計的原則

1.1 陽離子性和兩親性原則

陽離子抗菌肽在序列和結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出多樣性,但其分子設(shè)計都有兩個共同的要求,即陽離子性和兩親性[3]。前者決定其能否選擇性地與顯負(fù)電性的細(xì)菌細(xì)胞膜外表面相互吸引,而不與呈中性的真核生物細(xì)胞膜外表面產(chǎn)生相互作用,這也就是它們對哺乳動物細(xì)胞沒有毒害作用的主要原因[4];后者決定其能否有效插入細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi),形成疏水通道。但是這也有例外,例如:來源于成熟雄魚精巢精細(xì)胞的魚精蛋白,由于序列中精氨酸含量在 60%以上,其二級結(jié)構(gòu)并不呈現(xiàn)兩親α-螺旋和兩親β-折疊結(jié)構(gòu),因此在魚精蛋白序列的改造過程中應(yīng)更多考慮其抗菌肽機理。實際上,陽離子抗菌肽并不要求嚴(yán)格的一級和二級結(jié)構(gòu),不同序列類型也可形成具有兩親性的結(jié)構(gòu)而與細(xì)胞膜結(jié)合[5]。

1.2 結(jié)構(gòu)簡化原則

在保證抗菌活性前提下,應(yīng)盡量簡化陽離子抗菌肽的序列和結(jié)構(gòu),一方面易于進行合成降低成本,另外一方面也有助于闡明單一因素改變對活性的影響。例如,序列當(dāng)中避免出現(xiàn) Cys,以防合成序列形成二硫鍵而影響抗菌肽的兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)[6]。

2 陽離子抗菌肽的設(shè)計方法

陽離子抗菌肽分子設(shè)計是指基于結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系,通過一系列生物信息學(xué)方法,實現(xiàn)對天然陽離子抗菌肽的定向改造或全新設(shè)計,獲得更加符合需要的非天然序列,并闡明其活性機制,供進一步開發(fā)利用。在陽離子抗菌肽設(shè)計的過程中,生物信息學(xué)起到了極其重要的作用。眾多的生物軟件和網(wǎng)絡(luò)在線工具給科研工作者提供了極大的方便。利用 NCB I的 ClustalX程序和網(wǎng)絡(luò)在線工具 http:// bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.h tml,以 Fasta格式輸入多個抗菌肽分子序列,序列比對得到抗菌肽分子的一級保守序列;利用生物軟件DNAstar、Vector NTI Advance、ANTHEPROT和網(wǎng)絡(luò)工具 http:// alexander.compbio.ucsf.edu/～nomi/nnpredict.h tml進行序列的二級結(jié)構(gòu)分析;利用 ANTHEPROT軟件的Hydrophobicity計算出該肽段親水和疏水位點,用HelicalWheel獲得三維螺旋輪結(jié)構(gòu),并分析螺旋兩側(cè)和整體的親水和疏水狀態(tài);Ras Mol和 Vector NTI Advance等軟件能夠繪出多肽的三維結(jié)構(gòu)供研究者參考。

到目前為止,國內(nèi)外學(xué)者使用不同的設(shè)計方法對陽離子抗菌肽進行序列的改造,總結(jié)起來可以分為四種:基于抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能的設(shè)計方法、基于抗菌肽抗菌機理的設(shè)計方法、抗菌肽氨基酸殘基側(cè)鏈的化學(xué)修飾和其他設(shè)計方法。

2.1 基于抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能的設(shè)計方法

抗菌肽種類繁多,結(jié)構(gòu)上以三種類型為主:形成α-螺旋的抗菌肽;含 Cys形成二硫鍵的抗菌肽;富含1～2種氨基酸的抗菌肽,例如富含 Pro和 His[7]?？咕牡慕Y(jié)構(gòu)功能研究以及分子設(shè)計,目前大部分集中于兩親α-螺旋抗菌肽,原因在于α-螺旋抗菌肽分布最廣,數(shù)量最多,并具有廣譜抗性;該類抗菌肽長度短(<40個殘基),易于化學(xué)合成;線性結(jié)構(gòu)簡單,易于通過圓二色譜分析和多維核磁共振進行結(jié)構(gòu)測定[6]?；谝陨咸攸c,兩親α-螺旋抗菌肽已成為分子設(shè)計的首選對象。因此,在眾多的抗菌肽分子設(shè)計方法中,以天然序列為模板,維持抗菌肽兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)不變,取得了很大的成就。

2.1.1 殘基替換 殘基替換就是替換天然序列中的一個或多個氨基酸殘基。Song Yub Shin[8]等人將天然的α-螺旋抗菌肽 K6L6W(K WKKLLKKLLKLLNH2)的Leu6替換成 Pro(K WKKLPKKLLKLL-NH2),殘基替換后的 K6L6W表現(xiàn)出的抗菌活性可以和蜂毒肽相媲美,然而其溶血活性遠(yuǎn)低于蜂毒肽。同時證明了 Pro出現(xiàn)在兩親α-螺旋抗菌肽中,對抗菌肽的選擇性毒性起到了完美的效果。Sawai[9]等在保留兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)的前提下進行單殘基突變,用 Gly取代抗菌肽 Ovispirin-1(KNLRR II RKII H IIKKYG)第 10位的 Ile,結(jié)果克服了對紅細(xì)胞的溶血活性,并提高了抗菌活性。Yanga[10]等研究了富含 Arg和 Pro的抗菌肽 Tritrpticin,他們將抗菌肽序列中 Arg替換為 Lys,發(fā)現(xiàn)雖然兩者的構(gòu)象沒有顯著的差別,但替換后的抗菌肽活性提高了 2倍而且溶血活性大大降低。

國內(nèi)的葛曉東[11]等人將 LL-37的 Glu16、Asp27和Glu36用 Gln、Asn、Gln所替換,在不改變 LL-37兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)的前提下,增加了序列的凈電荷,實驗證明,替換后序列的抗菌活性有所增加,同時降低了LL-37的溶血活性。

2.1.2 截取天然抗菌肽的部分序列 眾所周知,人源性的LL-37及 GKE兩個抗菌肽就是很好的例子。人類唯一的 Cathelicidin Gene所編碼的蛋白質(zhì)為hCAP18(human cationic ant imicrobial protein 18),其中 hCAP18104-140為長度 37個氨基酸的多肽 LL-37[11],具有接近完美的兩親α-螺旋結(jié)構(gòu),具有抗菌活性同時具有溶血活性。Thorgerdur Sigurdardottir[12]等人截取LL-37的不同部分,分別命名為LLG、GKE、FKR,這三個序列都具有正電性和兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果表明,LL-3714-34的 GKE有著與 LL-37相同甚至更好的抗菌活性,同時 GKE的溶血活性較LL-37低。

2.1.3 序列模板法 Tossi[13]等人收集了 85條來自于昆蟲、青蛙和哺乳動物的能形成兩親α-螺旋抗菌肽。通過對N-末端的 20個氨基酸殘基進行序列比對和統(tǒng)計每個位點氨基酸殘基出現(xiàn)的概率,得出序列模板:Ghhp+hxpxh+phh+xhhxh(G:Gly,h:疏水性氨基酸,+:堿性氨基酸,p:極性的或帶電荷的氨基酸,x:不確定的氨基酸)。Tossi等設(shè)計出帶 7個正電荷的抗菌肽 PGAa(G ILSKLFKALKKAAKHAAKANH2)。PhD程序預(yù)測該序列能形成兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)。抑菌實驗表明,PGAa不僅具有對 G+和 G-細(xì)菌的抑菌活性,而且表現(xiàn)出對實驗中的真菌具有抑菌活性。Tiozzo[14]等以 Tossi等人收集的能形成兩親-α螺旋的抗菌肽的序列模板為基礎(chǔ),設(shè)計出類似于哺乳動物中抗菌肽 Cathelicidin家族的新型肽 PGYa (GLLRRLRDFLKKIGEK FKKIGY-NH2)。同時,參考昆蟲和兩棲動物中抗菌肽的特征,設(shè)計出類似物PGAa(G ILSKLGKALKKAAKHAAKA-NH2)。通過抑菌實驗,發(fā)現(xiàn) PGYa對 G-和 G+細(xì)菌均有抗性,而PGAa則表現(xiàn)對真菌假絲酵母有抗性。

2.1.4 組合化學(xué)庫方法 Sung Yu Hong[15]等人通過統(tǒng)計分析,采用在兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)頻率較大,對結(jié)構(gòu)貢獻重要的 7種氨基酸 (Lys、Leu、Val、Phe、Ser、Gln和 Pro)作為原料,化學(xué)合成了各種組合的十肽類似物,并從中篩選出 K LS2(KK VVFKFKFK-NH2)。K LS2對細(xì)菌具有廣譜抗菌性,且沒有溶血性。

2.1.5 螺旋輪方法 螺旋輪方法就是設(shè)計疏水性和親水性氨基酸殘基交替出現(xiàn)在一條序列里,以期形成兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)。Fernandez[16]等利用螺旋輪方法,得到僅有8個殘基的α螺旋肽鏈(K QQRWLWLW)具有強抑菌作用。

2.2 基于抗菌肽抗菌機理的設(shè)計方法

Yechiel Shai[17]和 Ziv Oren[17]基于地毯式抗菌機理和抗菌肽形成低聚物的特性,設(shè)計了一系列的新型抗菌肽(分子中既有 D-氨基酸,也有L-氨基酸),這種方法為未來抗菌肽的分子設(shè)計提供了一個新的突破口。南京工業(yè)大學(xué)的陳菲[18]等人根據(jù)顆粒溶素(granulysin)的抗菌機理,維持天然序列α-螺旋結(jié)構(gòu)不變的情況下,Asp43替換為 Thr以減小片段的負(fù)電荷;Asn47替換為Arg以增加片段的正電荷和親水性; Tyr52替換為 Phe以增加片段 C末端的疏水性。實驗證明,新肽在抗菌機理方面能更好的通過靜電作用擾亂 G+細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

表 1 抗菌肽設(shè)計方法的優(yōu)點與缺點比較

2.3 抗菌肽氨基酸殘基側(cè)鏈的化學(xué)修飾

2005年,Potter[19]等在研究魚精蛋白與細(xì)菌間靜電荷的相互作用時,用 1,2-cyclohexanedione部分修飾精氨酸的胍基,降低了魚精蛋白的正電荷。當(dāng)被修飾的精氨酸殘基數(shù)目少于 4個時,魚精蛋白對細(xì)菌的最低抑菌濃度 (M I C)值有所降低。Sangita Roy[20]等人化學(xué)合成了一個帶正電荷的二肽類似物,該兩親性物質(zhì)通過形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠而起到抗菌作用,研究者通過改變側(cè)鏈烷基的長度選擇抗菌活性最高的凝膠。日本東京大學(xué)[21](Tokyo university)的學(xué)者通過在魚精蛋白的一端添加非氨基酸組分,希望增加魚精蛋白的乳化能力。

2.4 其他設(shè)計方法

除了上述的設(shè)計方法以外,還有多種設(shè)計方法。例如:

a.D-型氨基酸替代相應(yīng)L-型氨基酸:D-型氨基酸的化學(xué)性質(zhì)和L-型氨基酸一樣,這樣就不會改變抗菌肽的陽離子性和兩親性,但是 D-型氨基酸的存在降低了蛋白酶對抗菌肽的水解作用。

b.使用約束氨基酸,這樣能夠克服多肽的固有柔性,同時把約束氨基酸引入生物活性肽的氨基酸序列,形成的局部約束以及約束由共價或非共價立體相互作用所決定的側(cè)鏈構(gòu)像[22]。

c.將兩條抗菌肽連接起來,希望集二者優(yōu)點于一身的雜合肽設(shè)計方法。例如抗菌肽 CecropinA抗細(xì)菌能力強,而抗菌肽Magainin抗真菌能力較強,能否各取所長并克服原有毒性呢?為實現(xiàn)這個設(shè)想, Shin[23]等將 CecropinA的 N端 8個殘基作頭, Magainin的N端 12個殘基作尾,合成得到了雜合鏈CecropinA(1～8)-magainin(1～12)(縮寫 CE-MA),發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出很強的抗細(xì)菌活性,且沒有溶血活性。

3 各種抗菌肽設(shè)計方法比較

對于不同來源和不同序列特征的抗菌肽,采取了不同的方法對其進行設(shè)計和改造,這些方法有著不同的優(yōu)缺點,各種設(shè)計方法的比較見表 1。

4 總結(jié)及展望

在陽離子抗菌肽的分子設(shè)計中,如何提高抗菌活性和選擇性毒性是最為關(guān)鍵的問題。結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究表明,影響抗菌肽抗菌活性和選擇性毒性的因素主要有 5個,即構(gòu)象(χ)、電荷 (Q)、兩親性(A)、疏水性 (H)和親疏水面的夾角 (θ)。這 5個因素之間相互依賴,改變其中一個因素就會對其他因素產(chǎn)生影響[24]。圖 1表示了它們之間的相互關(guān)系。在這 5個因素當(dāng)中,電荷和疏水性對抗菌肽的活性和選擇性毒性作用最為明顯。

圖 1 5個因素之間的相互關(guān)系

4.1 電荷

陽離子抗菌肽的電荷可直接影響其活性和選擇性毒性?？赏ㄟ^改變肽鏈長度、取代肽鏈中 Arg和Lys、C末端酰胺化和增加酸性氨基酸等方法合成模擬肽,并研究電荷對其活性的影響。Margitta Dathe[25]等人通過改變正電荷篩選抗菌活性和選擇性毒性最優(yōu)的 magainin抗菌肽的實驗證明,當(dāng)陽離子抗菌肽的電荷小于 +5時,抗菌活性隨正電荷增加而增加;當(dāng)電荷大于 +7時,增加正電荷對活性影響不大,但抗菌肽的溶血活性增加并且選擇性毒性降低。Helena Hujakka[26]的實驗也證明了電荷對抗菌肽活性的影響至關(guān)重要。實驗中的三種抗菌肽的比較見表2。

抑菌實驗表明,在 5～10μmol/L的濃度下,TA和TAd完全抑制金黃色葡萄球菌的生長,然而 T Ac沒有表現(xiàn)出任何的抗菌活性。10μmol/L的濃度下,Tad能夠完全抑制大腸桿菌的生長,就算濃度增加到20μmol/L,TA也沒表現(xiàn)出其對大腸桿菌的抗菌活性。

表2 TA、TAc和 TAd之間的比較

4.2 疏水性

抗菌肽的疏水性可以定義為抗菌肽序列中疏水性殘基所占的比例?？咕暮屑s 50%的疏水性氨基酸殘基,其活性是親水性殘基和疏水性殘基相互作用的結(jié)果。疏水性對抗菌肽活性的影響是通過改變肽鏈中Leu、Ile、Val數(shù)量進行測定的。研究發(fā)現(xiàn):增加分子的疏水性,抗菌肽的抗菌活性和對哺乳類動物細(xì)胞的毒性同時增加。這是由于疏水性殘基在抗菌肽插入細(xì)胞膜的過程中起到關(guān)鍵作用[27]。另外,由于疏水性殘基的存在,肽鏈在溶液中可以通過疏水作用形成多聚體,增加了對真核細(xì)胞膜的親和力。

未來的抗生素就是抗菌肽,因此對天然抗菌肽的序列進行設(shè)計和改造,使之具有更完美的抗菌活性、穩(wěn)定性和更低的溶血活性,是人們追求的目標(biāo)?？咕脑O(shè)計是一個相當(dāng)活躍的領(lǐng)域,多學(xué)科交叉在這里得到了充分體現(xiàn)。不同的研究者在設(shè)計不同抗菌肽的時候采用了不同的設(shè)計方法,雖然到目前為止,抗菌肽的設(shè)計取得了可喜可賀的成果,但是真正用于醫(yī)療和臨床的抗菌肽少之有少。主要原因有:對抗菌肽的抗菌機理研究主要是通過研究抗菌肽與脂質(zhì)體的相互作用得到的,因此抗菌肽的作用機理尚未完全研究清楚;多肽的合成周期較長,價格昂貴;多肽及蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象研究進展較慢。未來,抗菌肽的設(shè)計仍然是研究的重點。生物信息學(xué)繼續(xù)在這個過程中扮演著重要的角色,為抗菌肽的設(shè)計提供工具和數(shù)據(jù)庫。近年來由于結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展,相當(dāng)數(shù)量的抗菌肽的三維結(jié)構(gòu)被精確測定,使抗菌肽結(jié)構(gòu)功能關(guān)系以及分子設(shè)計得以在三維結(jié)構(gòu)上進行定性定量研究。相信在不久的將來,一定可以設(shè)計出理想的抗菌肽。

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Current status of molecular design of cation ic ant im icrobial peptides

WANGW ei,WANG L ian-jie＊
(College of Science and Engineering,ShaanxiUniversity of Science&Technology,Xi’an 710021,China)

As the w ide ly use of trad itiona l antib iotics,m any p a thogenic m ic roorganism s exis t d rug res is tance to a lm os t a ll the current antib iotics.So,it is the comm on ta rge t of resea rche rs to look for a new gene ra tion ant im ic rob ia l d rug.The ca tionic ant im ic rob ia lp ep tide is exp ec ted to be a new gene ra tion of ant im ic rob ia l d rug w ith refe rence to the ir low re la tive m olecula r m ass,b road ant im ic rob ia l sp ec trum,s tab ility and sp ec ia l ant im ic rob ia l m echanism.The firs t p rob lem of exp loiting new ant im ic rob ia l d rugs is to inc rease its ac tivity,s tab ility and dec rease its toxic ity as we ll as cos t.M olecula r des ign of ant im ic rob ia l p ep tides is the key to the p rob lem.Dom es tic and fore ign resea rche rs have m ade a lot of contributions in the m olecula r des ign of ant im ic rob ia lp ep tides.Now,it ta lks about a ll the m e thods in m olecula r des ign of ant im ic rob ia lp ep tides,as we ll as the advantages and d isadvantages of each m e thod.A t the sam e t im e,the deve lopm ent foreg round of m olecula r des ign is d iscussed.

ant im ic rob ia lp ep tide;amp hip a thicα-he lica l;m olecula r des ign

TS201.2

A

1002-0306(2010)01-0442-05

自弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來,抗生素一直是人類治療因病原微生物感染引起的疾病的有力武器,但是隨著“傳統(tǒng)抗生素”的大量使用,致病菌的耐藥性逐漸增強,“抗生素時代”正逐漸走到盡頭,目前最好的抗生素也逐漸失去效果,所以尋找新的抗菌藥物已成為備受關(guān)注的焦點[1]。陽離子抗菌肽 (cationic ant imicrobial peptides)是一類對抗外界病原體感染的肽類活性物質(zhì),具有相對分子量小、抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好和抗菌機理獨特等優(yōu)點[2]。但是天然的陽離子抗菌肽并非完美無缺,大部分天然抗菌肽存在抗菌活性不強、抗菌譜相對較窄、合成成本較高、部分抗菌肽對真核生物有一定的毒性、在具有對病原微生物高殺滅活性的同時往往伴隨著對真核生物的溶血作用和對蛋白酶敏感等不足。因此如何提高其抗菌活性、擴大抗菌譜、降低合成成本和最大程度降低其毒性成為其分子設(shè)計的目的,也是目前抗菌肽藥物開發(fā)的難點和希望所在。到目前為止,國內(nèi)外的學(xué)者在陽離子抗菌肽設(shè)計方面做出了大量的工作,同時也取得了很多可喜的成果。

2009-02-20 ＊通訊聯(lián)系人

王威(1985-),男,在讀碩士,研究方向:抗菌肽設(shè)計。