吳亞涼,寧正祥

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯的合成及抗氧化活性的研究

吳亞涼,寧正祥

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

以濃硫酸為溶劑和催化劑,采用直接酯化法合成反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯(VC酯),對其反應(yīng)條件進行優(yōu)化,合成產(chǎn)率可達 53.45%,并采用羥基自由基體系、超氧陰離子自由基體系、二苯苦味肼基自由基體系對VC酯、VC的抗氧化活性進行了比較。結(jié)果表明:在一定的濃度范圍內(nèi),兩者對·OH、O-2·和 DPPH·均有清除作用,并呈一定的量效關(guān)系。VC酯對·OH、O-2·和 DPPH·的清除能力均優(yōu)于VC,具有較好的自由基清除作用。

L-抗壞血酸,反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯,合成,抗氧化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-抗壞血酸、馬來酸酐、甲醇、濃硫酸(98%)、乙酸乙酯、30%過氧化氫、水楊酸、無水乙醇、硫酸亞鐵、Tris、鄰苯三酚、鹽酸 市售,國產(chǎn)分析純試劑;二苯苦味肼基自由基 (DPPH·) Sigma公司,分析純試劑;BHT 食品添加劑。

傅立葉變換紅外光譜儀德國 burker公司;紫外可見光光度計(TU-1810PC) 北京普析通用儀器公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (RE-52) 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司;循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;分光光度計 (721) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;pH計(pH-25型) 上海雷磁儀器廠;JB-2型恒溫磁力攪拌器 上海雷磁儀器廠新涇分廠;恒溫振蕩器(THZ-82) 金壇市富華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 富馬酸單甲酯的制備 馬來酸酐和精確等摩爾量的甲醇在密封環(huán)境中進行醇解反應(yīng)生成馬來酸單甲酯,然后在異構(gòu)化催化劑無水三氯化鋁存在的情況下異構(gòu)化生成富馬酸單甲酯。按張慶[3]等人的方法,將摩爾比為 1∶1的 19.60g馬來酸酐和 6.40g甲醇加入裝有冷凝管、攪拌器和溫度計的 250mL干燥的三口圓底燒瓶中,加熱至 45℃并攪拌至透明,然后升溫至 60℃反應(yīng) 2h。然后加入占體系 4%的氯化鋁,在 80℃條件下異構(gòu)化反應(yīng) 2.5h。用 75℃蒸餾水重結(jié)晶、冷卻、過濾,于真空干燥箱 55℃時干燥,得白色固體。

1.2.2 反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯的合成 采用直接酯化法[4],向 20mL濃硫酸中緩慢加入摩爾比為 1∶3的富馬酸單甲酯(0.015mol)和VC(0.045mol),室溫下攪拌 1h,待 VC完全溶解后,放入恒溫振蕩器中,25～26℃下反應(yīng) 28h。

反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)體系倒入快速攪拌的50g碎冰中,待冰塊完全溶化后,用 50mL乙酸乙酯萃取,分出乙酸乙酯層。水層再用 50mL乙酸乙酯萃取兩次。合并乙酸乙酯層,用無水 Na2SO4干燥過夜,在0.1MPa下 33～35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),蒸發(fā)至重量不再改變,得淡黃色物質(zhì)。

合成工藝路線如下:

以目標(biāo)產(chǎn)物的得率為指標(biāo),優(yōu)化影響合成反應(yīng)產(chǎn)率的主要因素 (反應(yīng)物配比、溫度、時間),并對產(chǎn)物進行紫外及紅外檢測。

1.2.3 反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯清除羥自由基 (·OH)活性研究[5]采用 Fenton反應(yīng)。利用H2O2與 Fe2+混合產(chǎn)生·OH,在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì),該物質(zhì)在 510nm處有最大吸收。向試管中依次加入 9mmol/L FeSO40.5mL、9mmol/L水楊酸-乙醇 0.5mL、不同濃度的試樣液4mL,最后加 8.8mmol/L H2O20.5mL啟動反應(yīng),37℃反應(yīng) 0.5h,在 510nm下測量各濃度的吸光度?？紤]到樣品本身的吸光值,以 9mmol/L FeSO40.5mL、9mmol/L水楊酸-乙醇 0.5mL、不同濃度樣品 4mL和0.5mL蒸餾水作為樣品的本底吸收值。空白對照不加試樣液,以蒸餾水補充體積。每個濃度做三個平行,取其平均值,同時與 VC、BHT比較清除能力。

式中:AO為空白對照液的吸光度;AX為加入樣品溶液后的吸光度;AXD為不加顯色劑 H2O2樣品溶液本底的吸光度。

1.2.4 反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯清除超氧陰離子(O2-·)活性研究[6]采用鄰苯三酚自氧化法測定抗氧化性。取 0.05mol/L Tis-HCl緩沖液 (pH= 8.2)4.5mL,置于 25℃水浴中預(yù)熱 20min,分別加入4.4mL各濃度試樣和 0.1mL 25mmol/L鄰苯三酚溶液(以 10mmol/L HCl配制),混勻后于 25℃水浴中反應(yīng)5min,加 1mL 8mol/L HCl終止反應(yīng),于 299nm處測定吸光度。對照管不加鄰苯三酚溶液,測其試樣的本底吸收值。空白管不加試樣溶液,用 4.4mL蒸餾水補充體積,每個濃度試樣做三個平行,取其平均值,同時與 VC、BHT比較清除能力。

其中:AO、A1、A2分別代表空白、樣品及其對照的吸光度。

1.2.5 反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯清除DPPH·活性研究[7]準確稱取 20mg DPPH,用無水乙醇定容于 250mL容量瓶中,得到濃度為 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液,在 0～4℃下避光保存。分別吸取不同濃度的樣品的乙醇溶液 2mL,加入 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液2mL,搖勻后,在室溫,黑暗處放置30min。以無水乙醇調(diào)零,測定 517nm處的吸光值A(chǔ)1。同時,測定樣品溶液 2.0mL與乙醇 2.0mL混合液在 517nm處的吸光值 A2,再測定 2.0mL DPPH溶液與 2.0mL乙醇在517nm處的吸光值A(chǔ)0。同一測定重復(fù) 3次,同時與 VC、BHT比較清除能力。

其中:AO、A1、A2分別代表空白、樣品及其對照的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物性狀及結(jié)構(gòu)鑒定

產(chǎn)物為淡黃色固體,微溶于水,易溶于乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑,不溶于乙醚。

圖 1 富馬酸單甲酯、VC、產(chǎn)物的紫外掃描圖譜

圖1為產(chǎn)物的紫外可見吸收光譜圖,曲線1為富馬酸單甲酯的吸收光譜,其在 212nm處有強吸收峰,這是由于富馬酸單甲酯含有碳碳共軛雙鍵,曲線 2為VC的吸收光譜,VC具有環(huán)狀結(jié)構(gòu),在 260nm附近有強吸收,曲線 3為產(chǎn)物的吸收光譜,經(jīng)過純化過的產(chǎn)物在這兩波長附近仍具有強吸收峰,由此初步認定為目標(biāo)產(chǎn)物。

圖 2為產(chǎn)物的紅外吸收光譜圖,其特征吸收峰如下:酯類的特征吸收峰為位于1715cm-1的 C=O伸縮振動吸收帶及 1174cm-1為 -C-O-C-吸收峰; 650cm-1為 =CH的吸收峰,1433cm-1為 CH2與 CH3的變形振動吸收蜂,1687cm-1為 C=C的吸收峰, 3084cm-1為產(chǎn)物分子中未參加反應(yīng)的-OH的伸縮振動吸收帶。結(jié)合產(chǎn)物的溶解特性,確認所得物質(zhì)為產(chǎn)物。

圖 2 產(chǎn)物的紅外吸收光譜圖

2.2 反應(yīng)條件對反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯得率的影響

在L-抗壞血酸的四個羥基中,較易被酯化的是6-位的伯醇羥基,但若反應(yīng)條件控制不當(dāng),L-抗壞血酸的其他的羥基也有可能被酯化,而本實驗的目標(biāo)產(chǎn)物是為L-抗壞血酸的 6-位有機酸酯。因此,為了避免副反應(yīng)的發(fā)生,得到高產(chǎn)率的目標(biāo)產(chǎn)物,必須對反應(yīng)的物料比、溫度及時間進行研究。

2.2.1 物料比對反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯得率的影響 本反應(yīng)為可逆反應(yīng),增大某一反應(yīng)原料的用量都有利于反應(yīng)向正方向進行。VC價格低廉,所以采用VC過量。以 98%的硫酸為溶媒,VC與富馬酸單甲酯不同摩爾比,在 25～26℃下,反應(yīng) 28h,考察反應(yīng)收率,結(jié)果如圖 3。

圖 3 物料配比對VC酯產(chǎn)率的影響

由圖 3可以看出,當(dāng)VC與富馬酸單甲酯的摩爾比在 1.2～2.5范圍內(nèi)時,隨著 VC用量的增加,反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯的產(chǎn)率隨之提高,但再提高VC的比例,產(chǎn)率無明顯提高趨勢,因此,,考慮經(jīng)濟成本,為了獲得高產(chǎn)率,VC與富馬酸單甲酯的摩爾比為 3較為合適。

2.2.2 反應(yīng)溫度、時間對反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯得率的影響 酯化反應(yīng)為可逆反應(yīng),只有在一定的溫度條件下,才能逾越反應(yīng)的活化能壘,向正方向反應(yīng),得到高產(chǎn)率。反應(yīng)溫度過低時,底物分子很難逾越反應(yīng)的活化能壘,反應(yīng)緩慢,反應(yīng)時間較長,酯化產(chǎn)率低。反之,若反應(yīng)溫度過高,會造成較多的副反應(yīng),且VC的耐熱性較差,高溫下易氧化,因此反應(yīng)溫度也不能太高。

以 98%的硫酸為溶媒,VC與富馬酸單甲酯的摩爾比為 3,考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間對產(chǎn)率的影響,結(jié)果如圖4。

圖 4 反應(yīng)溫度、時間對VC酯產(chǎn)率的影響

由圖 4可以看出,當(dāng)反應(yīng)時間在 16～28h范圍內(nèi),各溫度下的酯化產(chǎn)率均隨著反應(yīng)時間的延長而提高,當(dāng)反應(yīng)時間為 28h,各溫度的酯化產(chǎn)率均為最高,當(dāng)反應(yīng)時間從 28 h增加到 40h,產(chǎn)率下降,且產(chǎn)物的色澤變差。因此,反應(yīng)的最佳時間為 28h。

溫度不宜太過高也不宜太低,當(dāng)反應(yīng)時間為28h,反應(yīng)溫度為 25℃時,酯化產(chǎn)率達到最高,為53.45%;當(dāng)反應(yīng)溫度高于 25℃,反應(yīng)的選擇性會降低,生成顯著量的 5-位酯和 5,6-位二酯等副產(chǎn)物。此外,過高的溫度會導(dǎo)致 VC被氧化,造成較多的副反應(yīng),使產(chǎn)率降低,且濃硫酸的炭化作用使產(chǎn)品色澤變差。因此,反應(yīng)的最佳溫度為 25℃。

2.3 反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯抗氧化活性的研究

2.3.1 清除羥自由基(·OH)活性研究 根據(jù) Fenton方法產(chǎn)生·OH自由基的模型[8],H2O2與亞鐵離子反應(yīng)生成·OH自由基,該反應(yīng)為:H2O2+Fe2+→OH-+·OH+Fe3+,自由基一般存活時間比較短而且具有較高活性,而水楊酸能有效地捕捉·OH自由基且產(chǎn)生有色產(chǎn)物,該有色物質(zhì)在 510nm處有最大的吸收,若向體系中加入自由基清除基,體系在最大吸收波長處吸收減弱,由此可以測算所加入的物質(zhì)對自由基的清除率。I C50值表示清除 50%自由基時所需抗氧化劑的量,是衡量其抗氧化效果的有效指標(biāo)。

由圖 5可見,隨著各試樣液濃度的增加,各試樣對羥基自由基的清除能力均呈上升趨勢,清除率與濃度成量效關(guān)系。清除能力大小依次為:VC酯 > BHT>VC。VC酯、BHT、VC清除·OH的 I C50值分別為 0.14、0.17、0.31mg/mL。

由圖 6可以看出,在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi),VC酯、BHT、VC清除·的 I C50值分別為 0.21、0.24、 0 1 2 9 m g／m L，且清除率隨著濃度的增大而增大。特別是當(dāng)VC酯的質(zhì)量濃度達到 0.11mg/mL后,其清除·能力優(yōu)于 BHT。這說明,VC酯對·有良好的清除作用。

圖5 VC、VC酯、BHT對·OH的清除能力

圖 6 VC、VC酯、BHT對O-2·的清除能力

2.3.3 清除 DPPH·活性研究 二苯苦味肼基(DPPH·)是一種穩(wěn)定的自由基,其乙醇溶液呈深紫色,在可見光區(qū) 517nm處有最大吸收峰。當(dāng)向含有DPPH·的溶液體系加入自由基清除劑時,其中的孤電子被配對形成另一穩(wěn)定的化合物,溶液顏色由深變淺,反應(yīng)體系在 517nm處的吸光度值將變小,吸光度值變小的程度與自由基被清除程度呈定量關(guān)系[9],據(jù)此可檢測自由基被消除的情況,實驗結(jié)果如圖 7所示。

圖 7 VC、VC酯、BHT對DPPH·的清除能力

由圖7可見,各試樣對自由基均具有清除DPPH·作用,清除能力大小依次為:VC酯 >BHT>VC。各試樣在一定濃度范圍內(nèi),清除能力與濃度成量效關(guān)系,且各試樣均表現(xiàn)了相似的變化趨勢,即達到最大清除率后,清除率將不再隨濃度的增加而增強。VC酯、BHT、VC清 除 DPPH·的 I C50值分別為 0.20、0.30、0.49mg/mL。

3 結(jié)論

3.1 采用直接酯化法,以 L-抗壞血酸、馬來酸酐為原料,濃硫酸作為催化劑及溶劑,合成反丁烯二酸-6 -L-抗壞血酸甲酯。其最優(yōu)反應(yīng)條件為 VC與富馬酸單甲酯的摩爾比為 3,反應(yīng)溫度為 25℃,反應(yīng)時間為 28h,在此反應(yīng)條件下,產(chǎn)率高達 53.45%。

3.2 反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯的抗氧化性能表明,其對·OH、O-2·和DPPH·均具有良好的清除作用,在一定濃度范圍內(nèi),其清除效果與 VC酯濃度成正相關(guān),且其清除效果優(yōu)于VC,清除·OH、O-2·和DPPH·的 I C50值分別為 0.14、0.21、0.20mg/mL,是一種良好的抗氧化劑。本文通過對 VC進行化學(xué)改性,擴展了其在應(yīng)用過程的穩(wěn)定性,為開發(fā)新的VC衍生物提供了依據(jù)。

[1]徐積恩 .維生素C衍生物的開發(fā)和應(yīng)用[J].食品飼料添加劑信息,1994(2):1-3.

[2]耿志明,俞巧玲,曹建民 .L-抗壞血酸脂肪酸酯的特性與應(yīng)用[J],江蘇食品與發(fā)酵,1997(1):31-37.

[3]張慶,周如金,吳文浩,等 .防霉劑富馬酸單甲酯的合成研究[J].茂名學(xué)院學(xué)報,2008,18(2):1-3.

[4]何莉斌,寧正祥,李娜 .順-β-甲氧羰基丙烯酸-6-L-抗壞血酸酯的合成及在豬油中抗氧化性能的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24(10):992-994.

[5]楊江濤,楊娟,謝紅,等 .刺梨多糖粗品與純品體外抗氧化作用[J].食品工業(yè)科技,2008,29(2):94-96.

[6]高春燕,田呈瑞,周默 .枸杞多糖體外清除自由基活性研究[J].三峽大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2005(5):456-458.

[7]Sun T,Ho C T.Antioxidant activities of buckweat extracts [J].Food Chemistry,2005,90(4):734-749.

[8]丁利君,沈建毅 .黃芪中黃酮類化合物提取及其對羥基自由基清除作用[J].科研開發(fā),2002,(3):20-21.

[9]吳亞楠,魯曉翔,連喜軍,等 .玉米須黃酮清除自由基活性的研究[J].食品研究與開發(fā),2009,30(1):5-8.

Synthesis of 6-L-ascorbyl trans-β-alkoxycarbonylacrylate and study on its antioxidant property

W U Ya-liang,NING Zheng-xiang
(College ofLight Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te was p rep a red via es te rifica tion by H2SO4as the solvent and ca ta lys.The reac tion cond itions was op t im ized and 53.45% yie ld could be ob ta ined unde r the op t im um synthes is cond ition.The antioxida tive ac tivities of ascorb ic ac id and6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te was comp a red through the sup e roxide anion free rad ica l sys tem,hyd roxyl rad ica l sys tem and sys tem ofDPPH·. D iffe rent scaveng ing effec t be tween ascorb ic ac id and6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te in these rad ica lsys tem s wasobse rved,bes ides the antioxide tive ac tivitiesbecom e s tronge r w ith the inc rease of the concentra tion.The scaveng ing cap ab ility of6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te to sup e roxide anion free rad ica l,hyd roxyl rad ica l and DPPH· wass tronge r than tha t of ascorb ic ac id.6-L-ascorbyl trans-βa lkoxyca rbonylac ryla te was found w ith s ignificant scaveng ing effec t.

ascorb ic ac id;6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te;synthes is;antioxidant ac tivity

TS202.3

A

1002-0306(2010)01-0310-04

L-抗壞血酸是一種水溶性的維生素,也是一種維持人體正常生理活動所必需的營養(yǎng)強化劑,同時還作為一種安全高效的抗氧化劑廣泛用于食品工業(yè),然而 L-抗壞血酸有穩(wěn)定性不佳、脂溶性較差等缺點。由于VC分子中有烯二醇基團,具有較強的還原能力,因此極易被氧化為去氫抗壞血酸,尤其是在空氣、光線、熱和金屬離子的存在下,VC的功效極易減弱甚至消失[1]。VC的不穩(wěn)定性使其應(yīng)用受到限制,因此,對VC進行改性,增強其穩(wěn)定性進而擴展其應(yīng)用范圍,是目前世界上許多公司和學(xué)者所關(guān)注的熱點。目前已被開發(fā)的抗壞血酸及其衍生物主要有抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣、異抗壞血酸及其鈉鹽、抗壞血酸棕櫚酸酯和抗壞血酸硬脂酸酯等[2],主要被德國巴斯夫公司、日本武田公司、SIG MA公司等幾家大公司所壟斷。本實驗以 L-抗壞血酸和馬來酸酐為主要原料,濃硫酸為溶劑及催化劑,采用直接酯化法對L-抗壞血酸進行分子修飾,對其反應(yīng)條件 (如物料配比、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度)進行優(yōu)化,合成了一種新的 VC衍生物——反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯,提高了 VC的穩(wěn)定性,并對其對·OH、O-2·和DPPH·自由基的清除能力進行研究。

2009-03-30

吳亞涼(1985-),女,碩士,研究方向:食品化學(xué)。