楊佐毅,李 理

(1.廣東工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006; 2.華南理工大學(xué)食物蛋白工程研究中心,廣東廣州 510640)

固態(tài)發(fā)酵中的傳感器檢測技術(shù)

楊佐毅1,李 理2

(1.廣東工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006; 2.華南理工大學(xué)食物蛋白工程研究中心,廣東廣州 510640)

固態(tài)發(fā)酵(SSF)中各種變量的檢測對發(fā)酵過程的控制具有重要意義,但由于其培養(yǎng)基來源的多樣和復(fù)雜性,使得這些參數(shù)不易測定。本文綜述了固態(tài)發(fā)酵中采用不同傳感器對環(huán)境參數(shù) (溫度、pH、水分含量和水活度)和碳素平衡(生物量、底物濃度、CO2)的檢測方法,并對目前固態(tài)發(fā)酵在線檢測中的新技術(shù)應(yīng)用,以及具有應(yīng)用潛力的檢測方法(X射線、磁共振成像技術(shù)等)進行了介紹。

固態(tài)發(fā)酵,傳感器,在線檢測

1 環(huán)境變量的檢測

1.1 溫度測定

在固態(tài)發(fā)酵中溫度與濕度范圍的監(jiān)控至關(guān)重要,例如在堆肥生產(chǎn)中,溫度達到 80℃時會成為限制因素而造成曝曬,導(dǎo)致培養(yǎng)基干燥和水活度下降并使養(yǎng)分流失。溫度測定中常用的傳感器包括熱電偶、熱敏電阻或金屬探針 Pt100(表1),溫度傳感器一般置于反應(yīng)器徑向的不同距離并連接到相應(yīng)的控制系統(tǒng),通常在氣流入口和出口測定固態(tài)發(fā)酵生物反應(yīng)器內(nèi)的溫度情況。在實驗室條件下可通過控制恒溫水浴或室內(nèi)溫度來調(diào)節(jié)固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器的溫度,而在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中,通過強制通風(fēng)、攪拌或蒸汽加熱來進行溫度控制,最有效的方法是調(diào)節(jié)進入反應(yīng)器的空氣濕度,誤差為 ±4℃。

1.2 水分含量與水活度的測定

水分含量通常采用離線測定干重進行分析,但這種方法不能準確測定微生物生長代謝活動所消耗的水分。SSF中的水活度 (aw)測定可采用細胞接觸平衡法 (The Prox imity Equilibration Cell method)[2],采用干燥的濾紙或微晶纖維素與培養(yǎng)基質(zhì)接觸,通過測定其重量的變化可測得水活度變化,雖然不能在線檢測但可實現(xiàn)水分測定的自動化。在線測定中使用最多的是用電容式傳感器來測定水活度 (aw)和空氣濕度。在實驗室研究中可將生物反應(yīng)器置于室內(nèi),用飽和鹽溶液調(diào)節(jié)空氣濕度從而來控制 SSF的水活度,而大規(guī)模生產(chǎn)中常用飽和濕空氣通風(fēng)來進行控制。

表 1 不同溫度傳感技術(shù)的比較[1]

表 2 離線生物量測定[1]

1.3 pH

pH是衡量微生物代謝活性變化的指標,其變化會影響基質(zhì)消耗 (如蛋白質(zhì)水解)與代謝物 (例如有機酸)的產(chǎn)生,在 SSF中可通過在冷卻水中加酸堿進行 pH控制。由于 SSF中缺乏游離水,因此無法用電極直接測定固體培養(yǎng)基的 pH。有些研究人員將樣品浸泡于蒸餾水中,然后采用電位電極或 pH電極來測定,但這樣難于精確控制固態(tài)培養(yǎng)基的 pH[3],而標準的 pH測定方法是采用氮源物質(zhì) (尿素,氨鹽)、鈣鹽或堿性溶液等對培養(yǎng)基進行緩沖后進行測定。

2 碳平衡中變量的測定

在固態(tài)發(fā)酵中碳源在需氧條件下可轉(zhuǎn)化成生物量、代謝產(chǎn)物、CO2和水。微生物生長的在線監(jiān)測可通過O2消耗和 CO2的產(chǎn)生(呼吸作用),以及絲狀真菌菌絲體生長引起的壓力降 (PD)等間接方法來測定,呼吸作用和 PD測量需要對空氣流量進行準確測量和控制。為了獲得有價值的數(shù)據(jù)必須進行離線檢測,通常需要從基質(zhì)中取出生物量、蛋白質(zhì)、核酸、麥角固醇和測定酶活力等特征成分(表 2),這些操作會影響物質(zhì)平衡,從而對發(fā)酵具有破壞性。

2.1 氣流監(jiān)測與控制

通?？諝饬髁渴窃诜磻?yīng)器出口處采用測定裝置進行在線檢測,可采用的設(shè)備包括轉(zhuǎn)子流量計、熱式質(zhì)量流量計、風(fēng)力計或空速計等壓力傳感器,若采用可校準的電磁閥系統(tǒng)來監(jiān)測出口的氣體流量,則可設(shè)定間隔為 100mL/min的進氣量進行數(shù)字化控制。

2.2 呼吸作用

由于O2在水中的溶解度低,因此也可在反應(yīng)器頂部空間采用順磁分析儀測定濃度。順磁分析儀的缺點是對熱敏感和精度不高,但也足以檢測到氣體成分的變化和O2在反應(yīng)器中的變化,由于順磁性的測量是非破壞性的,因此在其后可以連接紅外探測器來同時測定 CO2的含量。順磁分析很適合 SSF,因為在發(fā)酵過程中 O2是唯一的順磁性氣體。而液相中 O2濃度一般采用安培計探頭進行檢測。通常用紅外光譜來測定CO2,在分析中CO2的測量可用于評價固態(tài)基質(zhì)的生物可降解性或研究揮發(fā)性有機物(VOC)的特點。CO2的釋放量也可先用NaOH、KOH等堿液吸收,然后采用手動或自動的方法檢測其含量。通過對呼吸作用的監(jiān)控可評估微生物的生長、驗證氣體擴散模型,以及監(jiān)測固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)。

采用氣相色譜(GC)可同時進行O2和 CO2的測定。利用兩個同心的色譜柱,其中一根柱充滿多孔聚合物或硅膠,從空氣中分離出 CO2;另一根柱充滿了一種分子篩對O2和N2進行分離,然后再用熱定量探測儀或?qū)嵛鰵庥嫶_定[4]。這一系統(tǒng)可同時在線監(jiān)控幾個生物反應(yīng)器,甚至在較大范圍內(nèi)也能測定耗氧率的變化。測得數(shù)據(jù)可用于二氧化碳產(chǎn)率(CDPR)、呼吸商(RQ)、CO2產(chǎn)生和O2消耗率的計算,以及建立 O2攝取速率(OUR)基礎(chǔ)上的動態(tài)生長模型等。

表 3 氣味傳感器在固態(tài)發(fā)酵的應(yīng)用

2.3 壓差測量

由于 SSF中微生物吸附在固體基質(zhì)顆粒上和培養(yǎng)基的異質(zhì)性,因此難以用生物傳感器進行檢測。生物量的增長可以直接測定菌絲的生長,采用這種方法需要在反應(yīng)器中將氣體流速降到最低,而氣體流速可用壓差計、液柱或不同類型的壓力傳感器進行測定。PD/L值是壓力降和反應(yīng)器長度的比值,可顯示發(fā)芽、生長、產(chǎn)孢等過程的定量變化,并反映了固定床的生產(chǎn)能力。由于在固態(tài)發(fā)酵中,植物性原料往往同時用來作為支持物和反應(yīng)基質(zhì)成分,滲透率變化不僅可能導(dǎo)致生物量增長,而且改變了固態(tài)反應(yīng)器內(nèi)部支持物的結(jié)構(gòu)。因此壓力傳感器最好用作報警用,用于探測床層壓實性或排水性是否良好。

3 生物量和代謝產(chǎn)物的測定

氣體成分測定、近紅外(N I R)分光法和成像分析技術(shù)可用于測定生物量和代謝物的生長,有望在固態(tài)發(fā)酵代謝物生產(chǎn)的在線監(jiān)控系統(tǒng)中得到應(yīng)用。

3.1 揮發(fā)性有機化合物(VOC s)的分析

在固態(tài)發(fā)酵過程中往往會產(chǎn)生揮發(fā)性有機物,例如初級代謝產(chǎn)生的乙醇和堆肥中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,這些代謝物質(zhì)的量是微生物活性的重要指標。自上世紀九十年代中期開始,氣味傳感器 (電子鼻)在食品工業(yè)中得到商業(yè)化應(yīng)用,用于監(jiān)測產(chǎn)品的缺陷和異常情況[5]。氣味傳感器系統(tǒng)內(nèi)設(shè)有敏感物質(zhì)感應(yīng)單元和數(shù)據(jù)處理單元,相應(yīng)敏感材料可吸附和處理VOCs,通過傳感器測得的數(shù)據(jù)可對樣品進行分析。在固態(tài)發(fā)酵中氣味傳感器用來監(jiān)測微生物增長,預(yù)測芳香族代謝物的質(zhì)量,或在某些情況下可區(qū)別不同的微生物種類。在固態(tài)發(fā)酵監(jiān)測中使用的感應(yīng)元件包括半導(dǎo)體探測器 (如 SnO2)、導(dǎo)電聚合物和石英微感應(yīng)器(表 3)。

雖然看起來頗具吸引力,但這些傳感器一般都存在重復(fù)性差、靈敏性差、選擇性差和反應(yīng)時間滯后等弱點,生產(chǎn)中可將幾個傳感器結(jié)合使用來彌補各自的缺點。新的檢測技術(shù)如微型和低成本的氣相色譜法(GCs)可進行快速和可靠的氣味分析,已進入商業(yè)化應(yīng)用,利用熱導(dǎo)率探測器可 3min內(nèi)得出結(jié)果。質(zhì)譜儀也可作為電子鼻使用,其優(yōu)點在于選擇性、敏感性和適應(yīng)性很好,GC-MS方法常被用于揮發(fā)性成分的定性和定量測定。田懷香等采用自制簡易的氣體吸取裝置,用 GC-MS對頂空固相微萃取法提取的金華火腿的風(fēng)味物質(zhì)進行測定,同時進行感官評價,對其中 22種化合物進行了明確的定性[6]。Hau采用GC-MS分析方法測定了自制和商品腐乳中的揮發(fā)性物質(zhì),其中的主要成分為醇和酯[7]。

3.2 紅外光譜

紅外光譜包括特征分子鍵的近紅外 (N I R)和中紅外 (M I R)吸收光譜。N I R和 M I R技術(shù)在固態(tài)發(fā)酵、堆肥和土壤有機物的分析中得到大量應(yīng)用,例如在 SSF中采用 N I R(1100～2500nm和 800～1100nm)進行干酪風(fēng)味成分的分析[8-9]。研究人員采用近紅外光譜和聲化學(xué)計量法來檢測玉米青貯法生產(chǎn)的沼氣,在靠近反應(yīng)器的附近取樣,采用在線近紅外技術(shù),標準差分析結(jié)果表明在線測定效果較好[10]。

3.3 人工視覺

人工視覺技術(shù)包括產(chǎn)品影像收集和相關(guān)特征的提取,需要進行攝像 (CCD)、數(shù)碼化和計算機處理(圖像分析),其中最困難的步驟在于建立從背景中自動分離目標對象的算法。在液體介質(zhì)中由于微生物對均勻背景的對比度高,因此很容易進行圖像分離,可對酵母和菌絲的生長過程進行研究。而在固態(tài)發(fā)酵中,反應(yīng)物的多樣性使得很難找到從背景中分離目標微生物圖像的方法。在土壤研究中,圖像分析可以用來鑒別培養(yǎng)基的宏觀結(jié)構(gòu) (體積、粒子大小和孔隙度)或菌絲生長。近年來 CCD在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用正在逐漸增加,可使研究人員測量環(huán)境條件在真菌生理活動中的作用。

采用新的多光譜攝像技術(shù)在可見光范圍之外能夠拍攝菌絲,并且能對代謝產(chǎn)物或菌絲活動進行定量研究。紅外線和紫外線輻射范圍內(nèi),可以提高生物量和基質(zhì)的反差,或者使得某些代謝物變得可見。例如某些真菌代謝物熒光染色后在紫外線照射下會成像,采用UV多光譜分析法還可區(qū)分不同菌株。

4 基于斷層攝影的檢測技術(shù)

由于固態(tài)發(fā)酵中培養(yǎng)基成分多樣,代謝中空間變量的數(shù)據(jù)也在不斷變化,因此可設(shè)計和利用傳感器來進行 X射線斷層攝影從而對 SSF的過程進行深入研究。例如固體培養(yǎng)基中的水分、生物量或代謝化合物的三維圖像,尤其是水分含量在固態(tài)發(fā)酵控制是一個關(guān)鍵的參數(shù),在固態(tài)發(fā)酵以及食品、土壤領(lǐng)域的研究中,可利用微波、X射線和磁共振成像(MR I)等技術(shù)來研究水分的動態(tài)變化。

4.1 微波

微波感應(yīng)傳感器的原理是建立在水分子吸收微波輻射的基礎(chǔ)上,其優(yōu)點是對 SSF沒有破壞性,并可以測定出總的濕度值。例如在食品工業(yè)中,基于朗伯-比耳定律信號減弱的原理,微波傳感器正在應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn),能檢測谷物、魚、面粉中的水分含量而對產(chǎn)品無破壞作用[11]。微波傳感器也用于分析土壤結(jié)構(gòu)、溫度和鹽濃度等方面的內(nèi)容。Pablo Resa等采用超聲技術(shù)來在線監(jiān)控樣品中啤酒酵母細胞胞外水解酶的動態(tài)變化,具有檢測快捷方便、無污染、低消耗、非破壞性、分析速度快等優(yōu)點[12]。采用微波傳感器是適應(yīng)固體發(fā)酵的發(fā)展方向,但目前還較少用于對 SSF水分概況的分析。

4.2 X射線和伽馬射線

計算機輔助 X射線斷層攝影 (CT)是一種無破壞性的技術(shù),目前使用在醫(yī)療領(lǐng)域,可對目標的內(nèi)部特征進行觀察,實際上首先觀察到的是“片狀”的目標,然后將這些“片段”重新整合得到三維圖像,在土壤研究中,可采用 X射線技術(shù)可用于測量其多孔性與水分特征曲線[13]。在固態(tài)發(fā)酵的實驗室研究中,也可采用該技術(shù)來觀察菌絲的空間結(jié)構(gòu)。

4.3 時間域-核磁共振(TD-NMR)

T D-NMR通常用于檢測食品中含1H的化合物或監(jiān)測其在生產(chǎn)過程中的變化,這種技術(shù)可對固態(tài)培養(yǎng)基中的化學(xué)鍵和游離水進行測定,因此在 SSF培養(yǎng)基中,可應(yīng)用該技術(shù)來進行濕度和水活度的分析。磁共振成像 (MR I)已被用于研究水的流動性、多孔介質(zhì)中自由水和結(jié)合水等領(lǐng)域。

在固態(tài)發(fā)酵中,1H MR I技術(shù)用來測定水含量、葡萄糖的濃度梯度、固態(tài)基質(zhì)中的水活度等,結(jié)果表明基質(zhì)表面之下的水活度主要受到水含量的影響,而同一位置的葡萄糖濃度卻很低,可能是由于真菌菌絲層對葡萄糖的攝取率較高[14];MR I可用于固態(tài)發(fā)酵的研究,例如考查奶酪成熟過程中水分的變化[15],但由于磁共振成像儀還十分昂貴,目前其工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用還受到制約。

5 結(jié)語

固態(tài)發(fā)酵技術(shù)主要是采用低成本的基質(zhì)生產(chǎn)低附加值的產(chǎn)品,因此生產(chǎn)中用于在線測定的傳感器必須成本低、可靠性高和易于維護,可在線安裝使用而又不能過于昂貴。在本文所述的檢測方法中,可用電流傳感器在線檢測除 pH之外的環(huán)境變量 (溫度、濕度、氧氣),工業(yè)上最有前途的傳感器包括氣體傳感器尤其是小型氣相色譜(GCs)、照像技術(shù)和微波傳感器,而近紅外(N I R)傳感器難以用作固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的在線檢測。

[1]Véronique Bellon-Maurel,Olivier Orliac,Pierre Christen. Sensors and measurements in solid state fermentation[J].Process Biochemistry,2003,38:881-896.

[2]Xavier S,Karanth NG.A convenientmethod to measure water activity in solid state fermentation systems[J].Lett Appl Microbiol,1992,15:53-55.

[3]Villegas E,Aubague S,Alcantara L,et al.Solid state fermentation:acid protease production in controlled CO2and O2environments[J].BiotechnolAdv,1993,11:387-397.

[4]Saucedo-Castaneda G,Trejo-HemnandezMR,Lonsane BK, et al.On-line automated monitoring and control systems for CO2and O2in aerobic and anaerobic solid-state fermentations[J]. Proc Biochem,1994,29:13-24.

[5]Gardner IW,Bartlett PN.A brief history of electronic noses [J].SensActuatorsB,1994,18:211.

[6]田懷香,王璋,許時嬰 .GC-O法鑒別金華火腿中的風(fēng)味活性物質(zhì)[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(12):117-221.

[7]Han YC.Volatile Components in Fermented Soybean(Glycine max)Curds[J].J Agric Food Chem,1999,47:2690-2696.

[8]Sorensen LK,Jepsen R.Assess ment of sensory properties of cheese by near infrared spectroscopy[J].Int Dairy J,1999,8: 863-887.

[9]李桂峰 .近紅外光譜技術(shù)及其在農(nóng)業(yè)和食品檢測中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2007,27(5):91-94.

[10]Carina J Lomborg,JensBo Holm-Nielsen,PiotrOleskowicz -Popiel,et al.Near infrared and acoustic chemometricsmonitoring of volatile fatty acids and dry matter during co-digestion of manure and maize silage[J].Bioresource Technology,2009,100 (5):1711-1719.

[11]張吉,劉稚,畢建秀,等 .微波消解原子熒光光度法測定糧谷中的硒[J].檢驗檢疫科學(xué),2008,18(4):44-45.

[12]Pablo Resa,Luis Elvira,Carlos Sierra,et al.Ultrasonic velocity assay of extracellular invertase in living yeasts[J]. AnalyticalBiochemistry,2009,384(1):68-73.

[13]何娟,劉建立,呂菲 .基于 CT數(shù)字圖像的土壤孔隙分形特征研究[J].土壤,2008,40(4):662-666.

[14]Van As H,Nagel F-I,W ieland A.1H MR I applied to low water and/or low mobility systems:solid-state-fer menter and biomats.Book of abstracts fifth international meeting on recent advances in MR applications to porous media,Bologna,Italy, 2000,11:64.

[15]張錦勝,林向陽,阮榕生,等 .NMR和MR I技術(shù)對面包和奶酪二元體系在貯藏過程中水分遷移的研究[J].食品科學(xué), 2006,27(11):132-138.

Sensors in the detecting of solid-state fermentation

YANG Zuo-yi1,L IL i2
(1.Faculty of Environmental Science and Engineering,GuangdongUniversity of Technology,Guangzhou 510006,China; 2.Research Center of Food Protein Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

De tec tion of va ria tiona lp a ram e te rs is s ignifica tive for the solid s ta te fe rm enta tion(SSF),but the de tec ting is d ifficult because of the va riab le and comp licacy subs tra tein SSF.D iffe rent sensors we re d iscussed in the m easurem ent of environm enta l p a ram e te rs(temp e ra ture,pH,wa te r content and ac tivity)and the ca rbon cyc le (b iom ass,subs tra te concentra tion,CO2)in SSF.App lica tion of new techniques and p otentia l techniques(X-rays, M agne tic Resonance I m ag ing,e t a l.)of m ore recentm e thods in the on-line de tec tion we re introduced.

solid s ta te fe rm enta tion;sensor;on-line de tec tion

TS201.1

A

1002-0306(2010)01-0402-04

固態(tài)發(fā)酵 (SSF)是在低濕含量 (aw)的固態(tài)培養(yǎng)基上(一般為 0.40～0.90),在不腐爛和自然狀態(tài)下進行的發(fā)酵過程。自從 1940年青霉素引起液體深層發(fā)酵(SmF)技術(shù)的迅速發(fā)展以來,SSF長期受到未引起人們的重視,而近年來 SSF在食品、燃料、酶、動物飼料的生產(chǎn)和染料降解等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多。在生物反應(yīng)器設(shè)計和操作中,環(huán)境參數(shù)的監(jiān)測對于固態(tài)發(fā)酵中生物量和/或代謝物的生產(chǎn)具有重要意義,但由于SSF的培養(yǎng)基物質(zhì)通常來源于農(nóng)作物,未經(jīng)精制使得生產(chǎn)的重現(xiàn)性差,SSF的復(fù)雜性和固體培養(yǎng)基的異質(zhì)性使得各種變量的探測和衡量比 SmF更加困難。傳感器是基于物理、化學(xué)或生物的原理,感應(yīng)生產(chǎn)環(huán)境條件的變化并將有用信號傳送到顯示單元,最常見的形式是對電信號進行傳送或顯示。傳感器主要有三種測定方式:樣品不用從反應(yīng)器中取出,信號由傳感器直接在線測定;傳感器安裝在生產(chǎn)環(huán)境附近,需要通過取樣系統(tǒng)或從反應(yīng)器中取出樣品進行分析,通常這種方式使用較多;離線分析,也稱測量/檢測系統(tǒng)或分析儀。傳感器在生產(chǎn)中作為監(jiān)測和控制關(guān)鍵部件,常會出現(xiàn)誤差而需要矯正。

2009-01-19

楊佐毅(1976-),男,博士,講師,研究方向:環(huán)境生物技術(shù)。

廣東工業(yè)大學(xué)博士基金資助(073018)。