包怡紅,秦 蕾,王 戈

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040; 2.中共黑龍江省委辦公廳,黑龍江哈爾濱 150007)

沙棘葉多糖的提取工藝及抗氧化作用的研究

包怡紅1,秦 蕾1,王 戈2

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040; 2.中共黑龍江省委辦公廳,黑龍江哈爾濱 150007)

以沙棘葉多糖得率為指標(biāo),通過單因素及正交實(shí)驗(yàn),對(duì)水提、微波輔助及超聲波輔助三種提取方法進(jìn)行比較,超聲波輔助法的最佳提取條件為:液固比60∶1,超聲波功率700W,超聲波作用時(shí)間 40min。在此條件下,超聲波法的最佳提取率為 7.50%,高于微波法的最佳提取率 7.05%和水提法的最佳提取率 6.24%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:沙棘葉多糖具有一定的體外抗氧化能力,其中當(dāng)多糖濃度為 1200μg/mL時(shí),對(duì)·的清除率比同濃度的VC還高 18.92%。

提取,多糖,沙棘葉,體外抗氧化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘葉 俄羅斯大果沙棘,采于黑河市林業(yè)局;石油醚、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醇、硫酸亞鐵 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀 天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純;總抗氧化活性(T-AOC)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

722S可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;WD800(MG-5531SD)微波爐 樂金電子 (天津)電器有限公司; SHB-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州杜甫儀器廠;T6-新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;TDL-40B-W臺(tái)式低速大容量離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司;ALPHA1-2冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHR IST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘葉多糖的提取工藝流程 沙棘葉→粉碎、過篩(60目)→石油醚脫脂→微波或超聲波輔助處理→水浴浸提→脫蛋白→脫色→透析→濃縮→醇沉→冷凍干燥→沙棘葉多糖(備用)

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用苯酚 -硫酸法[4]。

1.2.3 總還原糖含量的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取 1.0mL提取液于 100mL容量瓶中,加蒸餾水定容;取 2.0mL稀釋液于試管中,加入 6%的苯酚 1.0mL,98%的濃硫酸5.0mL,靜置 10min后搖勻,室溫放置 20min,然后在490nm波長(zhǎng)處比色,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖含量及提取率。

1.2.4 單因素及正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 水提法 水提法以液固比、提取溫度和提取時(shí)間為單因素,分別研究各單因素的不同水平對(duì)多糖得率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,按 L9(33)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),以確定其最佳提取工藝條件。

1.2.4.2 微波輔助法 微波輔助法以液固比、微波作用時(shí)間、微波功率為單因素,分別研究各因素的不同水平對(duì)多糖得率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,按L9(33)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),以確定其最佳提取工藝條件。

1.2.4.3 超聲波輔助法 超聲波輔助法以液固比、超聲波功率、超聲波作用時(shí)間為單因素,分別研究各因素的不同水平對(duì)多糖得率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,按L9(33)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),以確定其最佳提取工藝條件。

1.2.5 沙棘葉多糖體外抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

1.2.5.1 清除羥自由基 (·OH)能力的測(cè)定[5-6]在10mL的試管中依次加入 6mmol/L的 FeS O4溶液 1mL, 6mmol/L的 H2O2溶液 1mL,濃度為 200～1000μg/mL的待測(cè)溶液 1mL,搖勻,靜置 10min,再加入 6mmol/L的水楊酸溶液 1mL,搖勻,靜置 30min后于 510nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。

式中:A1為空白對(duì)照的吸光度;A2為無(wú)水楊酸時(shí)加入待測(cè)液的吸光度;A3為加入待測(cè)液的吸光度。

1.2.5.2 總抗氧化活性 (T-AOC) 根據(jù)總抗氧化能力試劑盒測(cè)定。定義在 37℃時(shí),每分鐘每毫升樣品使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加 0.01時(shí),為一個(gè)總抗氧化能力單位U。

1.2.5.3 超氧陰離子 (O2-·)清除率的測(cè)定[7]采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。在試管中依次加入 4.5mL 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.2,內(nèi)含 2mmol/L EDT A)緩沖溶液,4.2mL雙蒸水,于 25℃恒溫 20min后,加入25℃預(yù)熱過的0.3mL 3mmol/L鄰苯三酚溶液,迅速搖勻,在波長(zhǎng) 325nm波長(zhǎng)處每 30s測(cè)定一次吸光度,計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增值,此即為鄰苯三酚的自氧化速率A0。

沙棘葉多糖 (對(duì)照 VC)抗氧化活性測(cè)定按上述操作,加入鄰苯三酚前,先加入一定量多糖溶液,并減少同體積雙蒸水,其它操作均與上述相同,所測(cè)吸光度為Ai。

1.2.5.4 總還原力的測(cè)定[8]采用鐵氰化鉀法測(cè)定。在 2.5mL 0.2mol/L磷酸緩沖溶液 (pH 6.6)中加入2.5mL 1%的鐵氰化鉀溶液和 1mL樣品?；旌衔镌?0℃水浴中反應(yīng) 20min后,迅速冷卻并加入 2.5mL 10%的三氯乙酸,混勻后以 3000r/min離心 10min。取 1mL上清液加入 0.2mL 0.1%的三氯化鐵溶液混勻,再加入 1mL蒸餾水搖勻,以蒸餾水調(diào)零,在700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取葡萄糖 0.020g于 500mL容量瓶中定容,即為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,取 2.0mL蒸餾水作為空白樣,依次取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,用蒸餾水補(bǔ)足 2.0mL,在 9個(gè)樣品中加入 6%的苯酚 1.0mL,98%的濃 H2SO45.0mL,靜置 10min后搖勻,室溫放置 20min,然后在 490nm波長(zhǎng)處比色,結(jié)果如圖1所示。

圖 1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 三種提取方法的比較結(jié)果分析

2.2.1 水提法工藝條件的確定

2.2.1.1 水提法單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如圖 2所示,液固比對(duì)沙棘葉多糖提取率的影響最大,多糖得率隨著液固比的增加而增加,當(dāng)液固比為 50∶1時(shí),多糖得率為 5.44%,之后其變化趨于穩(wěn)定,此時(shí)多糖成分已基本溶出;隨著提取溫度的升高,多糖得率也在逐漸增加,當(dāng)提取溫度為 90℃時(shí),多糖得率達(dá)到 5.49%,之后其變化趨于穩(wěn)定;當(dāng)提取時(shí)間大于 3h時(shí),多糖得率的增加也已不再明顯。

2.2.1.2 水提法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 為了獲得最佳工藝條件,利用正交“均衡分散”的特點(diǎn),根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,按 L9(33)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),結(jié)果如表 1所示。

圖 2 水提法各因素對(duì)沙棘葉多糖得率的影響

由表 1可知,3個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響中,液固比的影響最為顯著,其次是提取溫度和提取時(shí)間。最佳提取工藝條件為A3B2C3,即液固比 60∶1,提取溫度 90℃,提取時(shí)間 4h,經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得樣品多糖含量為 6.24%,證實(shí)為最優(yōu)組合。

表 1 水提法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.2.2 微波輔助提取法工藝條件的確定

2.2.2.1 微波輔助法單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如圖 3所示,多糖得率隨著液固比的增加而增加,當(dāng)液固比大于50∶1時(shí),多糖得率的變化已基本穩(wěn)定,說明此時(shí)沙棘葉中的水溶性多糖已基本溶出;當(dāng)微波作用時(shí)間為3.5min時(shí),多糖得率達(dá) 7.03%,之后繼續(xù)延長(zhǎng)微波作用時(shí)間,由于反應(yīng)容器不密閉,高溫使部分溶劑揮發(fā),故導(dǎo)致提取率隨之下降;當(dāng)微波功率為 480W時(shí),多糖得率增加到 7.03%,其后隨著功率的增加,溶劑揮發(fā)也過多,使液固比降低,故多糖得率也隨之下降。

圖 3 微波輔助法各因素對(duì)沙棘葉多糖得率的影響

2.2.2.2 微波輔助法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表 2可知,3個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響依次為:微波功率 >液固比 >微波作用時(shí)間。此法的最佳提取工藝條件為A1B2C2,正是正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的第二組合,即液固比40∶1,微波作用時(shí)間 3.5min,微波功率 480W,此條件下多糖得率為 7.05%,證實(shí)為最優(yōu)組合。

表 2 微波輔助法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.2.3 超聲波輔助提取法工藝條件的確定

2.2.3.1 超聲波輔助法單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如圖 4所示,沙棘葉多糖的得率隨著液固比的增加而增加,當(dāng)其達(dá)到 50∶1時(shí),原料中的水溶性多糖已基本溶出,其后隨著液固比的增加,多糖得率的變化已基本平穩(wěn);在超聲波功率為 600W時(shí),多糖的得率達(dá) 7.36%,之后隨著作用功率的增加,多糖得率開始下降,這是由于超聲波產(chǎn)生的空化、震蕩作用,雖可加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解,但過大的超聲波功率也可使部分多糖發(fā)生降解[9-10];超聲波作用時(shí)間對(duì)多糖得率的影響最小,多糖得率隨著其增加而增加,當(dāng)作用時(shí)間超過 40min時(shí),多糖得率的增加幅度已減小。

圖 4 超聲波輔助法各因素對(duì)沙棘葉多糖得率的影響

2.2.3.2 超聲波輔助法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 為了獲得最佳工藝條件,利用正交“均衡分散”的特點(diǎn),根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,按L9(33)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),結(jié)果如表3所示。

由極差分析可知,3個(gè)因素對(duì)多糖的影響依次為:液固比 >超聲波功率 >超聲波作用時(shí)間。最佳提取工藝條件為A2B2C2,即液固比 50∶1,超聲波功率600W,超聲波作用時(shí)間 40min,經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得此條件下的多糖得率為 7.50%,證實(shí)為最優(yōu)組合。

表 4 沙棘葉多糖及VC的還原力測(cè)定結(jié)果

表 3 超聲波輔助法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.2.4 三種提取方法的結(jié)果比較 見圖 5。

圖 5 三種提取方法的多糖得率的比較

2.3 沙棘葉多糖體外抗氧化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果分析

2.3.1 清除羥自由基能力的結(jié)果分析 如圖 6所示,濃度為 200～2000μg/mL的沙棘葉多糖對(duì)·OH的清除率隨其濃度的增加而增加,2000μg/mL的多糖溶液對(duì)·OH的清除率為 90.09%,明顯接近于同濃度的VC溶液的·OH清除率 99.72%。沙棘葉多糖對(duì)·OH具有很強(qiáng)的清除作用,說明它具有一定的體外抗氧化活性。

圖 6 不同濃度沙棘葉多糖及VC對(duì)·OH的清除作用

2.3.2 總抗氧化活性 (T-AOC)的結(jié)果分析 如圖 7所示,沙棘葉多糖的總抗氧化能力隨其濃度的增加而增加,在濃度為 2000μg/mL時(shí)抗氧化能力已達(dá)到86.33U/mL,但是明顯小于同濃度的 VC抗氧化能力252.96U/mL。

2.3.3 清除超氧陰離子能力的結(jié)果分析 如圖 8所示,沙棘葉多糖對(duì)·的清除率隨其濃度的增加而增加,在 1000μg/mL時(shí)已達(dá)到 98.65%,高于同濃度的VC對(duì)·的清除率 70.27%,當(dāng)濃度大于 1200μg/mL時(shí)清除率達(dá)到 100%,說明沙棘葉多糖具有很高的清除率。

圖 7 不同濃度沙棘葉多糖及VC的總抗氧化能力

圖 8 不同濃度沙棘葉多糖及VC對(duì)·的清除作用

2.3.4 還原力測(cè)定的結(jié)果分析 如表 4所示,濃度為200～2000μg/mL的沙棘葉多糖的還原力隨其濃度的增加而增強(qiáng),但變化不大,而且明顯低于同濃度的VC溶液的還原力。雖然 2000μg/mL沙棘葉多糖的還原力比 200μg/mL的VC溶液還要略低一些,但已表明沙棘葉多糖具有一定的還原力。

3 結(jié)論

3.1 水提取法的最佳工藝條件為:液固比 60∶1,浸提溫度 90℃,浸提時(shí)間 4h,經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得樣品多糖得率為 6.24%,各因素對(duì)多糖得率的影響順序?yàn)?液固比 >提取溫度 >提取時(shí)間。

3.2 微波輔助提取法的最佳工藝條件為:液固比40∶1,微波作用時(shí)間 3.5min,微波功率 480W,此條件下多糖得率為 7.05%,各因素對(duì)多糖得率的影響順序?yàn)?微波功率 >液固比 >微波作用時(shí)間。

3.3 超聲波輔助提取法的最佳工藝條件為:液固比60∶1,超聲波功率 700W,超聲波作用時(shí)間 40min,此條件下多糖得率為 7.50%,各因素對(duì)多糖得率的影響順序?yàn)?液固比 >超聲波功率 >超聲波作用時(shí)間。

3.4 本實(shí)驗(yàn)中沙棘葉多糖的四項(xiàng)體外抗氧化能力均隨其濃度的增加而增加,與同濃度的 VC溶液相比,具有明顯的總抗氧化能力和清除·OH的能力,其中對(duì)·的清除作用比同濃度的 VC溶液還高18.92%,還原力雖比同濃度的 VC溶液低,但已表明沙棘葉多糖具有一定的體外抗氧化能力。

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Study of extraction and antioxidant of polysaccharide fromH ippohae rham noidesL.leave

BAO Y i-hong1,QIN Lei1,WANG Ge2
(1.College of Forest,Northeast ForestUniversity,Harbin 150040,China; 2.GeneralOffice of the CPC Heilongjiang Province Committee,Harbin 150007,China)

Taking the ra te of p olysaccha ride from Hipp ohae rham noides L.leaves as eva lua tion index,and through s ing le fac tor and orthogona l tes ts,the three m e thods of extrac tion:wa te r,m ic rowave-ass is ted and ultrasonicass is ted,we re comp a red.The results showed the bes t ultrasonic-ass is ted extrac tion ra te of7.50%,highe r than the m ic rowave m e thod the bes t ra te of7.05% and wa te r m e thods the bes t ra te of6.24%.The bes t cond itions of ultrasonic extrac t m e thods we re as follows:liquid-solid ra tio60∶1,the ultrasonic p owe r700W,ultrasonic t im e 40m in.The p olysaccha ride extrac ted from Hipp ohae rham noides L.leave had ce rta in deg ree antioxidant cap ac ities in vitro,for examp le,when the concentra tion of p olysaccha ride was1200μg/mL,the rem ova l effec t towa rds· was of highe r than VCby18.92%。

extrac tion;p olysaccha ride;Hipp ohae rham noides L.leave;antioxidant in vitro

TS201.2

A

1002-0306(2010)01-0286-05

沙棘 (Hippophae rham nosidesL.)屬于胡頹子科沙棘屬植物,落葉灌木或小喬木,又名沙棗、酸柳。我國(guó)華北、西北、西藏、云南等地均有分布,是沙棘資源最豐富的國(guó)家[1]。沙棘是較好的綠化植物,同時(shí)也具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,它主要體現(xiàn)在食品開發(fā)和藥品開發(fā)等方面[2]。沙棘油是各種生命活性物質(zhì)的濃縮物,在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中有廣泛用途;沙棘莖皮可提取抗癌物質(zhì);沙棘花是很好的蜜源等。目前,我國(guó)沙棘的加工工藝和設(shè)備都相對(duì)簡(jiǎn)單,隨著沙棘產(chǎn)品數(shù)量的日益擴(kuò)大,其不被重視和利用的沙棘葉和沙棘粕等也越來(lái)越多。近年來(lái)除少量供藥用外,大量用于多種保健飲料的配制[3]。盡管如此,關(guān)于沙棘葉中多糖的研究仍報(bào)道很少,為此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)沙棘葉水溶性多糖的提取進(jìn)行了研究,對(duì)比了水提、微波輔助及超聲波輔助三種提取方法的提取效果,且對(duì)其體外抗氧化能力進(jìn)行研究,旨在為進(jìn)一步研究沙棘葉多糖的構(gòu)效關(guān)系提供依據(jù)。

2009-10-26

包怡紅 (1970-),女,教授,博士后,研究方向:林副產(chǎn)品深加工與食品微生物資源開發(fā)利用。