周婷婷,李 燕,宋 斐

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

抗氧化大豆多肽制備的研究

周婷婷,李 燕,宋 斐

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

以還原能力、清除超氧陰離子自由基和過氧化氫能力為指標,篩選制備抗氧化大豆多肽的水解酶及水解條件,得到高效的抗氧化大豆多肽制品。結果表明：選擇 1000U/g菠蘿蛋白酶、2000U/g中性蛋白酶、2000U/g堿性蛋白酶,三酶復合在 pH6.0,酶解溫度 50℃,底物濃度 8.0%的酶解條件下,對大豆蛋白酶解 4h,多肽的抗氧化能力表現最強,還原能力達到 0.898,超氧陰離子自由基的清除率達到 40.93%,過氧化氫的清除率達到 33.37%。經超濾分離,分子量小于 10KDa而大于 5KDa的多肽表現出較強的還原能力,而小于 5KDa的多肽表現出較強的清除超氧陰離子自由基和過氧化氫的能力。

抗氧化,大豆多肽,酶解,超濾

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全溶解大豆蛋白粉 河南安陽漫天雪大豆蛋白有限公司,蛋白質含量約為 92.84%;菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶 SIG MA公司;抗超氧陰離子自由基與產生超氧陰離子自由基測試盒、雙氧水測試盒 南京建成生物科技研究所。

冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠,G L-20G-II;真空冷凍干燥器 CHR IST ALPHA1-2;超低溫冰箱海爾公司;RO-NF-UF-4100型膜分離裝置、中空纖維式超濾組件 (外壓式 PP-100、PS-5,內壓式PS-10) 上海摩速科學器材有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆蛋白水解物的制備[4]稱取大豆蛋白溶于緩沖液中,90℃處理 5min,冷卻至一定溫度后,定容到原體積并調節(jié)pH至酶的最適值。置于恒溫水浴調節(jié)到酶的最適溫度,加入蛋白酶啟動水解反應。水解結束后,100℃滅酶 10min。冷卻后,4℃,5000r/min離心 15min,取上清液冷凍干燥,冷凍保存待用。

1.2.2 酶活力的測定 福林酚法[5]。

1.2.3 水解度的測定 甲醛滴定法[6]。

1.2.4 抗氧化能力的測定

1.2.4.1 樣品的還原能力[7]將 10mg樣品溶于 1mL蒸餾水中,加入 2.5mL 0.2mol/L PBS(pH6.6)和2.5mL 1%的鐵氰化鉀溶液,混勻,從上述混勻的混合液中取 1mL,然后加入 0.2mL 0.1%的三氯化鐵溶液混勻,再加 1mL蒸餾水搖勻,以蒸餾水調零,在700nm處測定吸光度。吸光度越高,說明樣品的還原能力越強。

1.2.4.2 樣品的抗超氧陰離子自由基能力 方法參照測試盒說明書。

1.2.4.3 樣品清除過氧化氫的能力 方法參照測試盒說明書。

1.2.5 超濾分離 將大豆蛋白酶解物離心,取上清液,經 100kDa超濾膜 (PP-100中空纖維組件)截流分離,保留濃縮液;將濾液再經 10kDa超濾膜(PS-10中空纖維組件)截流分離,保留濃縮液;將濾液再經5kDa超濾膜 (PS-5中空纖維組件)截流分離,保留濃縮液。超濾過程保持組件最大工作壓力不超過0.15MPa,依次制備分子量為 100kDa以上、10～100kDa、5～10kDa、5kDa以下的大豆多肽溶液。然后將各部分溶液進行真空冷凍干燥,分別測定各部分的抗氧化活性。

2 結果與討論

2.1 酶的篩選

目前,用于水解大豆蛋白的水解酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、細菌蛋白酶和霉菌蛋白酶等,要制備盡可能多的活性肽類產物,一般不應選用端肽酶[8-9]。不同蛋白酶的專一性不同,酶切位點不同,導致水解產物中多肽也有區(qū)別,獲取抗氧化大豆多肽的數量、活性就有較大不同,因此蛋白酶的選擇尤為重要。

胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶,分別在各種酶的最適 pH和溫度下,以相同的酶量對大豆蛋白進行酶解,以酶解物的還原能力、超氧陰離子自由基清除能力、雙氧水清除能力作為指標,篩選合適的蛋白酶。

2.1.1 還原能力的測定 此方法的原理為[10]：

樣品提供電子,使體系中 Fe3+還原成 Fe2+,在波長為 700nm下測定最終反應物的吸光度,吸光度越大,說明越多的 Fe3+被還原成 Fe2+,樣品的還原能力就越強。一般情況,樣品的還原能力與抗氧化能力呈正相關。

圖 1顯示,隨著酶解時間的延長,由各蛋白酶酶解得到的大豆多肽表現出的還原能力分別逐漸加強,原因可能是隨著水解程度的加深,更多的活性基團和位點暴露在外,提供電子的能力變強,表現出更強的還原能力。中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解物表現出比較高的還原能力,菠蘿蛋白酶的酶解物還原能力其次,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解物還原能力較低。原因可能是前三種酶的水解能力較強,在相同的時間內使更多的基團暴露在外;再有可能是前三種酶的酶切點,更有利于具有還原能力的活性基團或活性位點暴露出來。因此,從還原能力的角度,本研究選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶。

圖1 酶解物的還原能力

2.1.2 清除超氧陰離子自由基能力的測定 超氧陰離子自由基是生命代謝中對生物體危害很嚴重的一種自由基,清除超氧陰離子自由基的能力是檢測樣品抗氧化性的重要指標。

圖 2顯示,隨著酶解時間的延長,由各蛋白酶酶解得到的大豆多肽表現出清除超氧陰離子自由基的能力分別逐漸加強,在酶解 10h時上升趨勢還很明顯,因此如果要得到清除超氧陰離子自由基的能力更強的大豆多肽,可以繼續(xù)酶解。中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解物表現出比較高的超氧陰離子自由基的清除能力,胃蛋白酶清除能力最低,因此,從清除超氧陰離子自由基能力的角度,本研究選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶。

圖 2 酶解物的超氧陰離子自由基清除能力

2.1.3 清除過氧化氫能力的測定 過氧化氫與樣品反應,過氧鏈保留并轉移到樣品分子上,樣品生成新的過氧化物,被轉移的過氧鏈越多,即樣品接受過氧鏈的能力越強,說明樣品的抗氧化能力越強。

圖 3顯示,隨著酶解時間的延長,由各蛋白酶酶解得到的大豆多肽表現出清除過氧化氫的能力分別逐漸加強,胃蛋白酶在酶解 8h后酶解液清除能力上升趨勢變緩,但其他四種酶上升趨勢還很明顯,因此要得到清除過氧化氫能力更強的大豆多肽,其它四種酶可以繼續(xù)酶解。中性蛋白酶和堿性蛋白酶作用下的酶解物表現出比較高的過氧化氫清除能力,菠蘿蛋白酶酶解物清除能力其次,但在 7h后超過了中性蛋白酶酶解物清除能力,胃蛋白酶、木瓜蛋白酶的清除能力最差。因此,從清除過氧化氫能力的角度,本研究選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶。

圖3 酶解物的過氧化氫清除能力

綜上所述,本研究選擇菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。

2.2 酶解條件的篩選

2.2.1 pH、底物濃度和溫度的篩選 pH、底物濃度和溫度是大豆蛋白酶解過程的重要影響因素,最適酶解條件可以保證實際生產中酶解的高效性。本實驗選用 L9(34)正交表,以水解度為指標,對 2000U/g的堿性蛋白酶、2000U/g的中性蛋白酶和 1000U/g的菠蘿蛋白酶三酶復合物的 pH、底物濃度和溫度進行篩選,酶解時間為 6h,見表 1、表 2。

表 1 L9(34)正交實驗因素水平設計

由表 2可知,三酶復合物酶解大豆蛋白的最適工藝條件是：酶解 pH 6.0,酶解溫度 50℃,底物濃度8.0%。經統(tǒng)計分析,各因素對水解度影響的主次順序為：底物濃度 ＞pH＞酶解溫度,且底物濃度對酶解程度的影響非常大,pH、酶解溫度對酶解程度的影響很小。

表 2 三酶復合酶解正交實驗結果直觀分析表

2.2.2 酶解時間的篩選 在最適溫度、pH、底物濃度的酶解條件下,大豆蛋白得到最高效的酶解,以還原能力、清除超氧陰離子、雙氧水能力為指標,篩選酶解時間,以期達到短時、高效得到抗氧化能力較強的大豆多肽。

2.2.2.1 還原能力的測定 由圖 4可知,大豆蛋白酶解液的還原能力大于未酶解的大豆蛋白還原能力,且在 4h時酶解液的還原能力達到最大,前者為后者的 1.91倍。酶解 4h后酶解液還原能力逐漸變小,原因可能是在 4h后酶解液中具還原能力的基團和位點更多地暴露出來,但隨著水解程度的加深,部分活性結構被破壞,酶解出的活性基團和位點其具有的還原能力不足以彌補被破壞的活性結構所具有的還原能力。因此在上述酶解條件下,4h為制備抗氧化大豆多肽的最適時間。

圖4 樣品還原能力的測定結果

2.2.2.2 清除超氧陰離子自由基能力的測定 由圖 5可知,大豆蛋白酶解液清除超氧陰離子自由基的能力遠大于未經酶解的大豆蛋白的清除能力,且在 4h時酶解液清除超氧陰離子自由基的能力達到最大,為未酶解大豆蛋白的 3.12倍,之后逐漸變小。因此經 4h酶解,可得到對超氧陰離子自由基有較強清除能力的大豆多肽。

圖 5 樣品清除超氧陰離子自由基能力的測定

2.2.2.3 清除過氧化氫能力的測定 由圖 6可知,大豆蛋白酶解液清除過氧化氫的能力遠大于未經酶解的大豆蛋白清除能力,且在酶解 4h時酶解液清除過氧化氫的能力達到最大,為未酶解大豆蛋白的 6.45倍,之后逐漸變小。因此經 4h酶解,可得到對過氧化氫有較強清除能力的大豆多肽。

圖 6 樣品清除過氧化氫能力的測定結果

以還原能力、清除超氧陰離子自由基和過氧化氫能力為指標,在最適酶解條件下,大豆蛋白經 4h酶解,制得的大豆多肽表現出的抗氧化性最強。

綜上所述,選擇 1000U/g菠蘿蛋白酶、2000U/g中性蛋白酶、2000U/g堿性蛋白酶,在 pH 6.0,酶解溫度 50℃,底物濃度 8.0%的酶解條件下,對大豆蛋白酶解 4h,抗氧化能力表現最強,還原能力達到0.898,對超氧陰離子自由基的清除率達到 40.93%,對過氧化氫的清除率達到 33.37%。

2.3 超濾分離

對分子量為 100kDa以上、10～100kDa、5～10kDa、5kDa以下 4部分的大豆多肽取相同的量,進行抗氧化能力測定。

由圖 7～圖 9可知,分子量分布在 10kDa以下的大豆多肽抗氧化能力表現較高,原因可能是小分子的多肽活性位點或基團更多地暴露在外,能充分和自由基等結合,所以多肽分子量的大小與抗氧化性有著密切的聯系。具體為 10kDa以下 5kDa以上的多肽表現出更強的還原能力,而 5kDa以下大豆多肽表現出更強的清除超氧陰離子自由基和過氧化氫的能力。

圖7 不同分子量大豆多肽的還原能力

10kDa以下的大豆多肽得率為 37.52%,產率較高,滿足實際生產的要求。如需提高原料的利用率,可對 10kDa以上的大豆多肽進一步進行控制性水解。

3 結論

圖 8 不同分子量大豆多肽的清除超氧陰離子自由基的能力

圖 9 不同分子量大豆多肽清除過氧化氫的能力

3.1 選擇 1000U/g菠蘿蛋白酶、2000U/g中性蛋白酶、2000U/g堿性蛋白酶,三酶復合在 pH 6.0,酶解溫度 50℃,底物濃度 8.0%的酶解條件下,對大豆蛋白酶解 4h,還原能力、超氧陰離子自由基和過氧化氫的清除率達到最高,表現出較高的抗氧化能力。

3.2 大豆蛋白酶解液的抗氧化能力遠大于未經酶解的大豆蛋白的抗氧化能力,還原能力前者為后者的1.91倍,超氧陰離子清除率為 3.12倍,過氧化氫的清除率為 6.45倍。

3.3 10kDa以下 5kDa以上的多肽表現出更強的還原能力,而 5kDa以下的大豆多肽表現出更強的清除超氧陰離子自由基和過氧化氫的能力。

3.4 分子量分布在 10kDa以下的大豆多肽抗氧化能力表現較高,且得率較高,為 37.52%,滿足實際生產需要。

[1]馮永財,趙曉丹,劉濤 .大豆肽的生理及加工特性分析[J].哈爾濱商業(yè)大學學報：自然科學版,2003,19(1)：90-92.

[2]Saito K,Jin DH,Ogawa T.Antioxidative properties of tripeptide libraries prepared by the combinatorial chemistry[J]. Agric Food Chem,2003,5l(12)：3668-3674.

[3]鄭建仙 .活性肽和蛋白質生產-關鍵技術與典型范例[M] .科學技術文獻出版社,2006：60-62.

[4]劉志東,郭本恒,王蔭榆,等 .乳清分離蛋白酶解物的抗氧化活性研究[J].天然產物研究與開發(fā),2007(3)：477-480.

[5]劉欣 .食品酶學[M].中國輕工業(yè)出版社,2006：53-64.

[6]冮潔,王文俠,欒廣忠 .大豆深加工技術[M].中國輕工業(yè)出版社,2004：358-376.

[7]Oyaizu M.Studieson productsofbrowning reaction：Antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine[J].Jap J Nutr,1986(44)：307.

[8]徐明生 .雞蛋卵白蛋白酶解物抗氧化肽研究[D].西安：陜西師范大學,2006.

[9]程云輝,文新華,王璋 .麥胚抗氧化肽水解用酶的篩選研究[J].中國糧油學報,2007,22(3)：29-33.

[10]黃海蘭,徐波,李增新,等 .嶗山蘑菇抗氧化成分提取及其活性研究[J].食品科學,2005,26(9)：61-66.

Study on preparation of soybean peptides w ith antioxidant activity

ZHOU Ting-ting,L IYan,SONG Fei
(College of Food Science and Technology,ShanghaiOcean University,Shanghai 201306,China)

Suitab le enzym e and hyd rolys is cond itions we re se lec ted for p rep a ring soybean p ep tides w ith antioxidant ac tivity bas ing on reduc ing ab ility,ab ility of scaveng ing sup e roxide free rad ica l and hyd rogen p e roxide.Results showed that the p ep tides,which showed highes t antioxidant activity,were p rep ared by1000U/g b rom e la in,2000U/g neutra l p rotease and 2000U/g a lka line p rotease toge the r for4h unde r the hyd rolys iscond itionsof pH6.0, temp e ra ture a t50℃ and subs tra te concentra tion a t8.0%.Reduc ing ab ility reached0.898,ab ility of scaveng ing sup e roxide free rad ica l40.93%and ab ility of scaveng ing hyd rogen p e roxide33.37% sep a ra te ly.Afte r ultrafiltra tion p ep tides less than10kDa and m ore than5kDa showed s tronge r reduc ing ab ility and p ep tides less than5kDa showed s tronge r ab ility of scaveng ing sup e roxide free rad ica l and hyd rogen p e roxide.

antioxidant ac tivity;soybean p ep tides;hyd rolys is;ultrafiltra tion

TS214.2

B

1002-0306(2010)03-0281-04

機體防御體系的抗氧化能力的強弱與健康程度存在著密切聯系,該防御體系有酶促與非酶促兩個體系。酶促體系中起作用的酶主要是超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽 S-轉移酶(GST)等;非酶促反應體系中主要為維生素、多肽、氨基酸和金屬蛋白質,例如：VE、VC、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸、組氨酸、乳鐵蛋白、轉鐵蛋白等。目前市場上的抗氧化劑大多為人工合成,例如VE、VC,作用效果好,但化學合成物質存在著安全隱患,它在清除自由基的同時也對人體的組織或器官產生副作用。研究表明,許多動植物的水解蛋白、個別肽和氨基酸都有抗氧化性[1]。大豆多肽具有較高的抗氧化能力,有研究結果表明,大豆多肽對脂質體系、非脂質體系、酶系統(tǒng)、非酶系統(tǒng)、體外實驗均有顯著的抗氧化作用[2]。因此相比較而言,沒有副作用的生物活性肽更具優(yōu)勢。另一方面,抗氧化大豆多肽的生產缺乏技術基礎,抗氧化多肽提取耗時久、得率低、效果差、成本高,導致現在市場上的大豆多肽產品處于初級開發(fā)階段[3]。本實驗旨在基于國內外研究,即對抗氧化多肽分子結構、分子大小與抗氧化生理功能的聯系,達到短時、高產率、低成本制得具有較強抗氧化能力的大豆多肽,為抗氧化大豆多肽產品的進一步開發(fā)、生產奠定基礎。

2009-05-06

周婷婷(1985-),女,碩士,研究方向：生物資源利用。