高華杰,李雨菲,剛永運,何洪巨

(1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100048;2.北京師范大學(xué)附屬實驗中學(xué),北京 100032; 3.國家蔬菜工程技術(shù)研究中心,北京 100097)

紫皮豇豆(VIGNA UNGUICULATA L.)花色苷的研究

高華杰1,李雨菲2,剛永運2,何洪巨3,＊

(1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100048;2.北京師范大學(xué)附屬實驗中學(xué),北京 100032; 3.國家蔬菜工程技術(shù)研究中心,北京 100097)

首次應(yīng)用高效液相色譜-二極管陣列檢測器-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-DAD-MS)鑒定出紫皮豇豆主要含有三種花色苷,分別為飛燕草色素、矢車菊色素、天竺葵色素的葡萄糖苷,其中矢車菊葡萄糖苷相對百分含量達到 93.4%;應(yīng)用 pH示差法測定出其單體花色苷的含量為 57.15mg/100g鮮重;應(yīng)用DPPH法測定結(jié)果顯示,花色苷粗提液有較強的抗氧化能力。

紫皮豇豆,花色苷,抗氧化性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫皮架豇豆(J1、J58、J229) 于 2008年 7月 31號采自北京市延慶農(nóng)場;鹽酸、甲醇、乙醇、磷酸氫二鈉、氯化鉀、乙酸乙酯、三氟乙酸 (TFA) 均為分析純;乙腈 色譜純。

離心機 飛鴿牌,TDL-40B;HJ-3恒溫磁力攪拌器 江蘇金壇醫(yī)療儀器廠;電子天平 Sartorius BS210S;紫外分光光度儀 H ITACH I U-3410;高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 島津公司：DGU-20A5脫氣機 Degasser;LC-20AD高壓泵 Pump;S IL-20A自動進樣器 Auto SamLpler;CBM-20A色譜工作站Communications BusModule;SPD-20A紫外 /可見光檢測器 UV/V IS Detector;CT O-20A柱溫箱Column Oven;組織搗碎機,真空泵,布氏漏斗, millipore制水機。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫皮豇豆花色苷粗提液的制備 將收獲的紫皮豇豆洗凈晾干,切碎,準(zhǔn)確稱取 30g置于組織搗碎機里磨碎,加入酸化甲醇 (v/v=1%),置于 4℃冰箱中1h,用布氏漏斗抽濾,濾液轉(zhuǎn)移到500mL的容量瓶中,濾渣則加入酸化甲醇 (v/v=1%),置于冰箱中再靜置 1h,再次抽濾。重復(fù)提取,直到濾液為無色時止,將濾液合并,定容至 500mL,置于 4℃冰箱中保存,待后續(xù)實驗使用。

1.2.2 紫皮豇豆單體花色苷含量的測定 準(zhǔn)確量取等體積的花色苷粗提液兩份,分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去掉溶劑,一份用pH1.0的緩沖液溶解,一份用 pH4.5的緩沖液溶解,靜置 2h后測定,測定原理及方法參照文獻[8]。

1.2.3 紫皮豇豆花色苷種類的鑒定 紫皮豇豆花色苷溶液的純化方法與文獻[9]相同。

花色苷分離鑒定所用的儀器是島津公司生產(chǎn)LCMS-IT-TOF,色譜分離所用的色譜柱為：150× 4.6mm i.d.,5UMSS Wakosil C18,柱溫為 32℃,流動相由A液(0.1%TFA-水溶液)和B液(0.1%TFA-乙腈溶液)組成。洗脫梯度為 0.01min 10%B,0.01～2min 10%B,2～30min 20%B,30～40min 30%B;流速為1.2mL/min。二極管陣列檢測器的掃描波長范圍是250～600nm。

質(zhì)譜參數(shù)：霧化氣流速 1.5L/min,曲形脫溶劑管溫度為 200℃,檢測電壓為 1.75kV,掃描對象為質(zhì)荷比為 200～1500的正離子。

1.3 花色苷的抗氧化能力測定

測定原理與方法參考文獻 [10],略有改動。如表 1所示加樣,用力搖勻,靜置 30min后,加入 1cm比色皿中進行吸光度的測定,測出 A0、Ai、Aj的吸光度值,按下列公式 1進行清除率的計算,運用 Origin8軟件作圖并找出半抑制率濃度 (I C50)。

式中：A0-未加提取液的 DPPH·溶液的吸光度,以甲醇作空白;Ai-加入提取液后的DPPH·溶液的吸光度,以甲醇作空白;Aj-提取液與提取劑混合后的吸光度,以甲醇作空白。

表1 清除DPPH·實驗設(shè)計

2 結(jié)果與討論

2.1 紫皮豇豆中花色苷的含量

pH示差法被用于測定花色苷的含量,是基于花色苷溶液的顏色隨著 pH的變化發(fā)生可逆性的改變,在 pH為 1時主要以有顏色的形式存在,在 pH為 4.5時主要以無色形式存在,這兩種 pH的色素溶液在520nm下的吸光度的差別,與色素的濃度成比例[8]。矢車菊葡萄糖苷是植物中存在最廣的單體花色苷[7],所以以它作為標(biāo)準(zhǔn)來表達單體花色苷的總量。而多聚花青素降解后形成的單體花青素,其顏色不會隨著 pH的變化而變化,它們在 pH為 1和 pH為 4.5時的吸光率是相同的,這樣就消除了花色苷粗提液中常?；煊械亩嗑刍ㄇ嗨貙嶒灲Y(jié)果的干擾。

表 2 三種紫皮豇豆花色苷含量(mg/100g FW)

由表 2可知,紫皮豇豆 J58的含量高于另外兩種紫皮豇豆的含量,與文獻中報道[12]的一些水果蔬菜的花色苷含量 (黑豆花色苷含量為 44.5mg/100g,紫洋蔥為 48.5mg/100g)比較,J58中花色苷的含量也是比較高的,因此,紫皮豇豆尤其是 J58可作為花色苷的一個重要來源。

2.2 紫皮豇豆花色苷種類鑒定

紫皮豇豆花色苷種類由對 HPLC-DAD-T OF MS生成的譜圖分析,結(jié)合出峰順序,參照相關(guān)文獻鑒定得出。由圖 1～圖 4可知,J58的主要物質(zhì)峰有三個,其中二號峰為主峰,積分面積最大,此外還有兩個明顯的小峰,在一號峰與二號峰之間還有一些更小的峰,但由于其含量太低,超出儀器的最低檢測限,故不在本次檢測范圍內(nèi)。由表 3可知,二號峰的面積占總積分面積的 93.4%,一號峰占 5.1%,三號峰占1.5%;二號峰的純度達到 98%,其光譜圖顯示,可見光區(qū)最大吸收峰為515nm,該峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示分子離子質(zhì)荷比為 449,碎片離子質(zhì)荷比是 287,與文獻[13]對照可知,該峰代表的物質(zhì)可能是矢車菊-3-葡萄糖苷 (cyanidin3-O-glucoside);一號峰分子離子質(zhì)荷比、碎片離子質(zhì)荷比分別是 465、303,可見光區(qū)最大吸收波長是 523nm,與文獻[14]比較可知,該峰代表的物質(zhì)可能是飛燕草 3-葡萄糖苷 (delphinidin 3-O-glucoside);三號峰分子離子質(zhì)荷比、碎片離子質(zhì)荷比分別是 433、271,可見光區(qū)最大吸收波長為500nm,低的最大吸收波長及質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示該峰代表的物質(zhì)一定是天竺葵色素的糖苷化合物,即天竺葵3-葡萄糖苷 (pelargornidin 3-O-glucoside)[15]。

表 3 紫皮豇豆花色苷色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖1 紫皮豇豆花色苷色譜圖

圖2 紫皮豇豆二號峰的光譜圖

圖 3 紫皮豇豆花色苷二號峰的一級質(zhì)譜圖

圖 4 紫皮豇豆花色苷二號峰的二級質(zhì)譜圖

2.3 花色苷粗提液抗氧化性研究

本實驗用DPPH法來評價紫皮豇豆花色苷的抗氧化能力,以VC、BHT作為參照。I C50是抗氧化劑對DPPH的清除率達到 50%時抗氧化劑的濃度,濃度越低說明該抗氧化劑的抗氧化能力越強。由表 4可知,3.6177mg/mL紫皮架豇豆就清除自由基能力理論上來說相當(dāng)與 0.0157mg/mL VC,可見紫皮架豇豆是值得推薦的有較強抗氧化能力的蔬菜。

圖5 不同濃度的花色苷溶液對DPPH·的清除率

表4 不同材料對DPPH·的半抑制率濃度

3 結(jié)論

結(jié)果表明,紫皮豇豆莢果花色苷含量較高,所含花色苷以矢車菊 3-葡萄糖苷為主,除了三種含量高的花色苷得到鑒定外,還有幾個峰由于含量低沒有得到鑒定,有待進一步研究;花色苷粗提液中有許多雜質(zhì)對花色苷起到輔色作用,這些雜質(zhì)有待鑒定,從而有助于研究花色苷同別的物質(zhì)之間的關(guān)系,這對提高花色苷穩(wěn)定性的研究及應(yīng)用有巨大價值;本文只用DPPH法測定了花色苷的抗氧化性,由于方法的選擇也會對結(jié)果造成一定的影響,應(yīng)該嘗試多用幾種方法來測定,通過不同方法間的比較以減少方法造成的誤差,這一點也是值得進一步研究的地方。

從天然植物中尋找有效的抗氧化成分應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品、保健品之中是當(dāng)前研究的熱點之一,而花色苷不僅可作為抗氧化劑,更是優(yōu)良的食品著色劑,這使得近年來花色苷的研究越來越受到重視。紫皮豇豆纖維素含量少,花色苷含量比較高,所以既是優(yōu)良的保健蔬菜又可作為花色苷的來源,研究和應(yīng)用前景廣闊。

[1]Francis F J.Athocyanins[J].Crit Rev Food Sci Nutr,1989, 28(4)：273-314.

[2]Cristina A E.Identification of anthocyanins of pinta boca (solanum stenotomum)tubers[J].Food Chemistry,2004,86：441-448.

[3]Harborne J B.The anthocyanins[M].The flavonoidsAdvances in Research Science,1980.London：Chapman and Hall,1988：1-18.

[4]Charron C S,Clevidence B A,Britz S J,et al.Effect of dose size on bioavailability of acylated and nonacylated anthocyanins from red cabbage(B rassica oleraceaL.Var.capitata)[J]. Agricultural and Food Chemistry,2007,55(13)：5354-5362.

[5]Andersen ? M,Jordheim M.TheAnthocyanins In Flavonoids：Chemistry,Biochemistry and Applications[M].CRC Press：Boca Raton,2006：471-553.

[6]Cao G,Muccitelli H U,Sanchez-Moreno C,Prior R L. Anthocyanins are absorbed in glycated for ms in elderly women：a pharmacokinetic study[J].Am J Clin Nutr,2001,73：920-926.

[7]Kong J M,Chia L S,Goh N K,et al.Analysis and biologicalactivities of anthocyanins[J].Phytochem,2003,64：923-933.

[8]Lee J M.Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices,beverages,natural colorants,and winesby the pH differentialmethod：collaborative study[J].AOAC inte-rnational,2005,88(5)：1269-1278.

[9]Longo L,Vasapollo G.Extraction and identification of anthocyanins from Smilax aspera L.berries[J].Food Chemistry, 2006,94：226-231.

[10]霍超,宋曙輝,徐桂花,等 .朝蘚薊葉片多酚化合物提取及體外抗氧化研究[J].食品科技,2008,198：158-155.

[11]Galvano F,FauciL L,et al.Bioavailability,antioxidant and biological properties of the natural free-radical scavengers cyanidin and related glycosides[J].ANN IST SUPER SAN ITA, 2007,43(4)：382-393.

[12]Wu X L,et al.Concentrations of anthocyanins in common foods in the united states and Estimation of normal consumption [J].Agricultural and Food Chemisry,2006,54：4069-4075.

[13]Due?asM,et al.Anthocyanin composition in fig(Ficus carica L.)[J].Food Composition and Analysis,2008,21：107-115.

[14]Burdulis B,et al.Study of diversity of anthocyanin composition in bilberry(Vaccinium m yrtillusL.)fruits[J]. Medicina(Kanuas),2007,43(12)：971-977.

[15]Glenda A,Macz-pop,et al.Natural occurrence of free anthocyanin aglycones in beans(Phaseolus vulgarisL.)[J].Food Chemistry,2006,94(3)：448-456.

Study on anthocyanins in purple cowpea(Vigna unguiculata L.)

GAO Hua-jie1,L IYu-fei2,GANG Yong-yun2,HE Hong-ju3,＊
(1.College ofLife Sciences,CapitalNor malUniversity,Beijing 100048,China; 2.The Exper imental High SchoolAttach to BeijingNor malUniversity,Beijing 100032,China; 3.National Engineering Research Center forVegetables,Beijing 100097,China)

Purp le cowp eas(Vigna unguicula ta L.)we re extrac ted w ith of0.1%HC l in m e thanol solution,p urified on a C-18solid ca rtridge,quantified by the pH d iffe rentia l m e thod,and cha rac te rized by m eans of HPLC-DAD-IT/ TO FMS ana lys is for the firs t t im e.Antioxidant ac tivity of extrac ts was sc reened us ing DPPH rad ica l scaveng ing m e thods.The content of anthocyanins in the p urp le cowp eas was57.15m g/100g FW.Three kinds of anthocyanin riched in the extrac ts which exhib ited s trong antioxidant ac tivity we re identified,they we re de lp hinid in3-O-g lucos ide,cyanid in3-O-g lucos ide,p e la rgornid in3-O-g lucos ide.

p urp le cowp ea;anthocyanins;antioxidant ac tivity

TS255.1

A

1002-0306(2010)03-0155-04

隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強,天然產(chǎn)物正逐漸取代化工合成產(chǎn)物在人們生活中所占的地位,在這種社會趨勢中,天然來源的食品著色劑越來越受到人們的關(guān)注[1]。在眾多的天然色素中,花色苷 (Anthocyanin)因其獨特的性質(zhì)成為了廣為研究的對象,因為花色苷的顏色范圍很寬,從紅到藍,包括桔黃色、紫色等顏色[2];它在植物體中的分布也廣,不僅存在于植物的花朵、果實中,在一些植物中,莖、葉、根以及一些貯藏器官也含有大量花色苷[3];更為重要的是花色苷有超強的抗氧化能力,對人類許多慢性和衰老方面的疾病如心臟病、癌癥、帕金森癥以及對衰老有很好的預(yù)防和 (或)治療作用[4]。花色苷是植物來源的水溶性色素-花色素 (Anthocyanidin)的糖苷化合物,屬于類黃酮類多酚化合物,到目前為止已經(jīng)在 25科 73屬植物中發(fā)現(xiàn)了 575種[5]。這些單體花色苷之間的區(qū)別在于與母核結(jié)構(gòu)相連的羥基、甲氧基、糖基的位置、數(shù)目、性質(zhì)以及與糖基連接的脂肪酸和 (或)芳香酸的數(shù)目、性質(zhì)不同[6]。在高等植物中,含量最高的花色苷是矢車菊 3-葡萄糖苷[7],而花色苷含量最高的是漿果類植物,如葡萄皮、藍莓等。篩選價格低廉、花色苷含量高的植物品種既是花色苷研究中的基礎(chǔ)也是重要的工作。對于大多數(shù)國家和地區(qū)的人民來說,蔬菜在日常飲食中要比水果、保健品占得比重高,所以篩選、培育一些富含花色苷的蔬菜,讓人們普遍享受到花色苷對人體健康的益處,其意義是重大的。紫皮豇豆 (V igna unguiculataL.)蔓生,豆科一年生草本植物,是豇豆的一個地方品種,因夾的顏色為紫色而得名。紫皮豇豆含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、膳食纖維,還含有多種人體必需的維生素及微量元素。我國醫(yī)學(xué)很早就有紫豇豆種子入藥,能健胃補氣、滋養(yǎng)消食的記載。但是,迄今為止還沒有對紫皮豇豆中的花色苷進行過系統(tǒng)研究。本文就紫皮豇豆花色苷的含量,種類及其粗提取液的穩(wěn)定性和抗氧化性進行初步研究,旨在為紫皮豇豆及其花色苷的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

2009-03-30 ＊通訊聯(lián)系人

高華杰(1982-),男,碩士,研究方向：藥用植物學(xué)。