李 濤,寧喜斌,安秀華,符姜燕

(上海海洋大學(xué),上海 201306)

副溶血性弧菌溫度-PH雙因素預(yù)警模型的建立

李 濤,寧喜斌＊,安秀華,符姜燕

(上海海洋大學(xué),上海 201306)

以副溶血性弧菌Vp BJ1.1997為研究對(duì)象,采用均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法,建立并驗(yàn)證了溫度范圍為 7～43℃,pH范圍為 5.5～10.0的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型。結(jié)果表明,所選一級(jí)模型的擬合效果優(yōu)劣依次為 Logistic方程 ＞Gompertz方程 ＞Linear方程,以Logistic方程為一級(jí)模型計(jì)算生長(zhǎng)參數(shù);二級(jí)模型采用平方根模型進(jìn)行擬合,得到模型相關(guān)系數(shù) r為0.9739,最低生長(zhǎng)溫度為 11.7769℃,最低生長(zhǎng) pH為 7.38,經(jīng) F檢驗(yàn)和偏差因子、準(zhǔn)確因子驗(yàn)證,模型可接受。

副溶血性弧菌,雙因素預(yù)測(cè)模型,均勻設(shè)計(jì)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副溶血性弧菌Vp BJ1.1997 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院普通微生物菌種保藏管理中心;胰蛋白胨大豆肉湯(TSB) 上海市疾病預(yù)防控制中心;TCBS培養(yǎng)基 上海康潤(rùn)生物科技有限公司。

低溫生化培養(yǎng)箱 LRH-250CL(溫度波動(dòng) ± 1.0℃) 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;臺(tái)式酸度計(jì)InoLab pH730 德國(guó)WT W儀器。

1.2 菌種活化

挑取 24h斜面培養(yǎng)的 Vp BJ1.1997一環(huán),接種于10mL TSB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng) 12h,備用。

1.3 菌體生長(zhǎng)的測(cè)定

取制備好的菌懸液0.1mL接種于裝有 10mL TSB液體培養(yǎng)基的試管中 (接種量為 103～105cfu/mL),將試管按設(shè)計(jì)的條件培養(yǎng),每隔 1h取樣測(cè)定,采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。每組培養(yǎng)條件平行 2次。

1.4 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1.4.1 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)因素水平表的選擇 本實(shí)驗(yàn)溫度范圍為7～43℃,pH為5.5～10.0,因素水平表如表1所示。

表1 因素水平表

1.4.2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排 采用 10因素 11水平的U11(1110)均勻設(shè)計(jì)表。根據(jù)均勻設(shè)計(jì)表的使用,2因素的U11(1110)均勻設(shè)計(jì)表選第 1、7列,其他列和第11行為空。

1.5 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立

1.5.1 一級(jí)模型 選定Linear方程、Gompertz模型及Logistic模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,三種模型生物學(xué)意義表達(dá)式如表 2[6]。

表2 三種模型生物學(xué)意義表達(dá)式

式中,N：微生物在時(shí)間 t時(shí)的生物量;N0：t=0時(shí)的初始菌數(shù);A：t=+∞時(shí)的 lgN/N0,即當(dāng) N達(dá)到最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的值;U：生長(zhǎng)速率;M：達(dá)到最大相對(duì)速率需要的時(shí)間。相關(guān)生長(zhǎng)參數(shù)計(jì)算如下：

最大比生長(zhǎng)速率

模型之間擬合效果的差異可通過比較相關(guān)系數(shù)r和殘差平方和(RSS)來(lái)獲知。r越接近于 1,RSS越小,說(shuō)明模型的擬合效果越好。

1.5.2 二級(jí)模型 二級(jí)模型選用平方根模型,數(shù)學(xué)描述如下[7]：

為避免當(dāng)溫度 T小于 Tmin或 pH小于 pHmin時(shí),U為負(fù)值的情況,對(duì)模型修改如下：

式中,μmax是最大比生長(zhǎng)速率;Tmin是最低生長(zhǎng)溫度;α為系數(shù)。

1.5.3 模型驗(yàn)證 應(yīng)用偏差因子 (bias factor)和準(zhǔn)確因子 (accuracy factor)對(duì)模型預(yù)測(cè)效果進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià),計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度-pH條件下Vp生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

根據(jù)VpBJ1.1997在不同溫度-pH組合條件下的生長(zhǎng)數(shù)據(jù),繪制 Vp在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線,并據(jù)生長(zhǎng)趨勢(shì)不同區(qū)分為圖 1(A)和圖 1(B)。

圖 1 VpBJ1.1997不同組合培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線

從圖 1(A)看出,在圖中設(shè)定條件下培養(yǎng) Vp呈正增長(zhǎng)。溫度-pH組合為 39-9.0時(shí)增長(zhǎng)幅度最快,其次為 27-9.5,19-8.0、31-7.5和 15-10.0增長(zhǎng)趨勢(shì)較為緩和。此組條件比較發(fā)現(xiàn),組合中溫度均高于15,pH均高于 7.5。

從圖 1(B)看出,在圖中在設(shè)定條件下培養(yǎng) Vp呈負(fù)增長(zhǎng)。溫度-pH組合為 35-5.5時(shí)下降幅度最大,其次為 43-7.0,再次為 23-6.0,11-6.5時(shí)下降幅度最小,下降趨勢(shì)最為緩和。此組條件比較發(fā)現(xiàn),除7-8.5組合條件外,其余各組合 pH均低于 7.0,而 7-8.5組合中溫度值較Vp生長(zhǎng)溫度偏低。

2.2 一級(jí)模型的擬合

Linear方程多用于微生物在低溫條件下生長(zhǎng)曲線的擬合,Gompertz方程、Logistic方程為 S形曲線函數(shù)方程,在微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究中較為常用。運(yùn)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),對(duì)各條件下Vp的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行回歸,得到部分統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果,如表 3。

三種方程的擬合效果進(jìn)行比較,10組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全部通過 Logistic方程擬合所得的 r值最高,對(duì)應(yīng)的RSS值最小;其次為 Gompertz方程擬合所得的 r值較高,對(duì)應(yīng)的 RSS值較小;而通過 Linear方程擬合所得的 r值均在同組比較中最低,對(duì)應(yīng)的RSS值最大。由此得出,Logistic方程在本實(shí)驗(yàn)中擬合效果優(yōu)于Gompertz方程,為最好;Linear方程的擬合效果最差。對(duì) Logistic方程擬合結(jié)果進(jìn)一步做統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證并計(jì)算μmax,如表 4。

表 4 Logistic方程統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證及μmax計(jì)算結(jié)果表

表6 模型回歸系數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

從表 4中可看出,在顯著性差異分析中,10組數(shù)據(jù)的 F值均大于 F0.01(2,10),即 P＜0.01,因此在α= 0.01水平上差異極顯著,說(shuō)明模型回歸效果較好;計(jì)算得Bf最小值為 0.9910,最大值為 1.0014,均接近 1,說(shuō)明模型預(yù)測(cè)效果較好;Af最小值為 1.0145,最大值為 1.0871,均接近 1,說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的平均誤差合理,模型可以接受。因此選定Logistic方程作為一級(jí)生長(zhǎng)模型,進(jìn)而計(jì)算μmax,得比生長(zhǎng)速率最大培養(yǎng)條件組合為 39-9.0,μmax可達(dá) 1.9740h-1,生長(zhǎng)速率最小組合為 35-5.5,μmax為-2.6340h-1,與圖 1直接觀察結(jié)果相符。

2.3 二級(jí)模型的擬合

據(jù)表 4中計(jì)算所得的生長(zhǎng)速率,用平方根模型(2)進(jìn)行擬合,建立二級(jí)模型。所得模型為：

μmax=0.18252＊ (T-11.7769)2＊ (logpH-0.8670)

模型相關(guān)系數(shù) r=0.9739,其中α=0.1825,Tmin= 11.7769,logpHmin=0.8607,即 pH=7.3773。由模型表達(dá)式中得出,實(shí)驗(yàn)組 1、2、5、8、10為負(fù)值,其余為正值,與實(shí)測(cè)結(jié)果相符。值得注意的是,微生物在極限生長(zhǎng)條件的生長(zhǎng)速率難以準(zhǔn)確測(cè)定,因此模型預(yù)測(cè)的最低生長(zhǎng)溫度可能不是該菌的實(shí)際最低生長(zhǎng)溫度?？捎^測(cè)的 Tmin值與 pHmin因選用不同菌株或使用不同培養(yǎng)基而有差異,但預(yù)測(cè)的 Tmin值與 pHmin是微生物的固有屬性,不隨培養(yǎng)基變化而變化[8]。二級(jí)模型的部分統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表 5所示。

表5 模型統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

模型總體的顯著性可以通過 F統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行假設(shè)實(shí)驗(yàn)。從模型的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果來(lái)看,模型 F＞F0.01(2,7),即 P＜0.01,因此在α=0.01水平上差異極顯著,說(shuō)明模型整體回歸效果較好。對(duì)模型回歸系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,如表 6所示。

從表中可看出,Tmin的 t值均大于 t0.05(7),回歸系數(shù)達(dá)到顯著水平;pH的 t值大于 t0.01(7),回歸系數(shù)達(dá)到極顯著水平,其對(duì)應(yīng)最低生長(zhǎng) pH的 95%置信區(qū)間為 7.3773±1.0347。利用函數(shù)繪制平臺(tái) 1.2版繪制模型三維曲面擬合圖,如圖 2所示。

圖2 模型擬合圖

2.4 模型驗(yàn)證

以 TSB培養(yǎng)基為基質(zhì),將Vp在任意 5組組合培養(yǎng)條件下培養(yǎng),生長(zhǎng)速率實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較分析,結(jié)果如表 7所示。

表7 培養(yǎng)基數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證

利用Bf和Af對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證,Bf為 0.8034(n= 5),Af為 1.5958(n=5)。Bf小于 1表明生長(zhǎng)速率預(yù)測(cè)值比實(shí)測(cè)值大,一般認(rèn)為 Bf在 0.75～1.25之間,模型即可接受;Af等于 1表明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值完全吻合,一般在 1.1～1.9之間均可接受[9]。該模型Bf和Af值均在合理范圍內(nèi),說(shuō)明模型可接受。

3 結(jié)論與討論

3.1 利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)不同溫度-pH條件下 VpBJ1.1997的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,結(jié)果表明, Logistic模型比 Gompertz模型及線性模型能更好地?cái)M合副溶血性弧菌的生長(zhǎng),在α=0.01水平上模型極顯著。擬合結(jié)果表明,培養(yǎng)溫度-pH組合為 39-9.0時(shí),Vp比生長(zhǎng)速率最大,組合為 35-5.5時(shí),Vp比生長(zhǎng)速率最小。

3.2 利用平方根模型對(duì)Vp進(jìn)行最大比生長(zhǎng)速率與溫度-pH之間關(guān)系的擬合,得到Vp生長(zhǎng)的二級(jí)雙因素模型。預(yù)測(cè)得知,Vp的最低生長(zhǎng)溫度為11.7769℃,最低生長(zhǎng) pH為 7.3773。F檢驗(yàn)表明模型在α=0.01顯著,培養(yǎng)基數(shù)據(jù)Bf和Af驗(yàn)證值在可接受范圍內(nèi),回歸系數(shù)分析表明回歸系數(shù)顯著,說(shuō)明此模型能較好描述Vp比生長(zhǎng)速率與溫度-pH之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

3.3 均勻設(shè)計(jì)由數(shù)學(xué)家方開泰和王元 1978年創(chuàng)立,與傳統(tǒng)“正交設(shè)計(jì)”相比,均勻設(shè)計(jì)將實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在高維空間內(nèi)充分均勻分散,使數(shù)據(jù)具有更好的代表性,為揭示規(guī)律創(chuàng)造必要條件。均勻設(shè)計(jì)在多水平實(shí)驗(yàn)研究中有重要意義,在實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分散的同時(shí)可大大減少工作量,縮短實(shí)驗(yàn)周期,在醫(yī)藥、化工、食品及生物工程等領(lǐng)域都有應(yīng)用。本文嘗試將均勻設(shè)計(jì)方法引入到微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立過程中,并得到較好的實(shí)驗(yàn)效果。但在微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究中,大量數(shù)據(jù)的積累十分重要,均勻設(shè)計(jì)雖在水平數(shù)不變的條件下可減少實(shí)驗(yàn)次數(shù),其精準(zhǔn)性應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證比對(duì)。

[1]劉秀梅,陳艷,等 .1992～2001年食源性疾病暴發(fā)資料分析——國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)[J].衛(wèi)生研究,2004,33(6)：725-727.

[2]俞鶯,寧喜斌 .對(duì)蝦副溶血性弧菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J].現(xiàn)代食品科技,2006,23(5)：184-186.

[3]陳瑞英,魯建章,蘇意誠(chéng),等 .食品中副溶血性弧菌的危害分析、檢測(cè)與預(yù)防控制[J].食品科學(xué),2007,28(1)：341-346.

[4]王璐華,寧喜斌 .副溶血性弧菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立與應(yīng)用探討[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2008,23(增刊)：263-267.

[5]楊振泉,焦新安 .副溶血性弧菌在低溫貯藏過程中的失活動(dòng)力學(xué)特征[J].食品科學(xué),2008,29(7)：47-51.

[6]RatkowskyDA著,洪再吉等譯 .非線性回歸模型統(tǒng)一的實(shí)用方法[M].南京：南京大學(xué)出版社,1986：71-81.

[7]Adams M R,Little C L,Easter M C.Modeling the effect of pH,acidulant and temperature on the growth rate of yersinia enterocolitica[J].J ApplBacteriol,1991,71：65-71.

[8]MilesDW,Ross T,Olley J,et al.Development and evaluation of a predictive model for the effect of temperature and water activity on the growth rate of Vibrio parahaemolyticus[J].Food Microbiol,1997,38：133-142.

[9]Braun P,Sutherland JP.Predictive modeling of growth and enzyme production and activity by a cocktail of Pseudomonas spp., Shewanella putrefaciens andAcinetobacter sp[J].FoodMicrobiol, 2003,86：271-282.

Developm ent of predictive model for com bined effect of temperature and pH on the grow th ofVibrio parahaemolyticus

L I Tao,NING Xin-b in＊,AN Xiu-hua,FU Jiang-yan
(College of Food Science,ShanghaiOcean University,Shanghai 201306,China)

Based on the s tanda rd s tra in-Vib rio p a rahaem olyticus BJ1.1997,its g row th s ta tus which affec ted by temp e ra ture(7～43℃)and pH(5.5～10.0)was s tud ied w ith uniform des ign.Theresults showed tha t Log is tic equa tion was op t im a l in p r im a ry m ode ls,while Gomp e rtz equa tion was m ore adap tab le than Linea r,so g row th p a ram e te rs we re ca lcula ted from Log is tic equa tion.The seconda ry m ode lwas deve lop ed by squa re rootm ode ls.Its rva lue was0.9739,the lowes t g row th temp e ra ture was11.7769℃and the lowes t g row th pH was7.38.Through F tes t and eva lua tion by b ias fac tor and accuracy fac tor,the m ode l can exac tly desc ribe the re la tionship be tween the g row th ra te and com b ined effec t of temp e ra ture and pH.

Vib rio p a rahaem olyticus;doub le-fac tors p red ic tive m ode l;uniform des ign

TS201.3

A

1002-0306(2010)03-0091-04

副溶血性弧菌 (V ibrio parahaem olyticus,簡(jiǎn)稱Vp)又稱嗜鹽菌,廣泛分布于海灣、海岸線區(qū)域、鹽湖及海產(chǎn)品中,溫?zé)岬貛л^多,是沿海地區(qū)引起微生物性食物中毒的重要病原菌。國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示,沿海省份副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物性食物中毒的首位[1]。該菌在水產(chǎn)品中的天然帶菌率較高,溫暖季節(jié)在海蝦中可高達(dá)90%[2],生長(zhǎng)繁殖達(dá)一定量可引發(fā)人體病變,因此研究副溶血性弧菌在水產(chǎn)品中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)狀況,建立預(yù)警機(jī)制,對(duì)于保證水產(chǎn)品安全性具有重要意義。影響副溶血性弧菌生長(zhǎng)的因素很多,如溫度、鹽度、pH等。副溶血性弧菌在含鹽 0.5%～8%的環(huán)境中生長(zhǎng),含鹽量為 2%～4%生長(zhǎng)最佳,無(wú)鹽或高鹽 (10%)不生長(zhǎng);在溫度為 5～44℃范圍內(nèi)生長(zhǎng),以 30～35℃為最佳;適宜生長(zhǎng)的 pH為 7.5～8.5,以 pH7.7為最佳, pH低于 6則生長(zhǎng)不佳[3]。目前國(guó)內(nèi)學(xué)者多進(jìn)行單因素生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究,并主要以溫度為對(duì)象,已建立了副溶血性弧菌的溫度預(yù)測(cè)模型以及低溫失活模型等[4-5],多因素協(xié)同作用模型的建立方法報(bào)道較少。本研究以溫度-pH交互作用為對(duì)象進(jìn)行研究,鑒于副溶血性弧菌所涉及單因素生存范圍較寬、研究二因素交互作用時(shí)所取水平數(shù)較多而采用均勻設(shè)計(jì),對(duì)副溶血性弧菌二級(jí)雙因素模型的建立方法進(jìn)行初步探討。

2009-04-22 ＊通訊聯(lián)系人

李濤(1985-),女,在讀碩士,研究方向：食品安全與檢測(cè)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助 (30771675);上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助(J50704)。