趙靜靜，李 艷,2,*，張利中，莊玉婷

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊050018；3.中國長城葡萄酒有限公司，河北 沙城 075400)

Interdelta PCR 指紋圖譜法區(qū)分鑒定沙城產(chǎn)區(qū)釀酒酵母

趙靜靜1，李 艷1,2,*，張利中3，莊玉婷1

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊050018；3.中國長城葡萄酒有限公司，河北 沙城 075400)

運用Interdelta PCR指紋圖譜分析技術(shù)，對從沙城產(chǎn)區(qū)龍眼葡萄相關(guān)的葡萄園土壤、釀酒設(shè)備和自然發(fā)酵過程中分離得到的54株釀酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)進(jìn)行亞種水平的區(qū)分鑒定，研究不同釀酒酵母的分布和變化規(guī)律。結(jié)果表明：54株釀酒酵母產(chǎn)生7種指紋圖譜，代表7種不同的基因類型，基因型Ⅰ～Ⅶ分別占所分離菌株的31.5%、11.1%、7.4%、42.6%、3.7%、1.85%和1.85%。自然發(fā)酵中后期有4種基因類型的酵母菌，釀酒設(shè)備表面3種，葡萄園土壤中2種。通過聚類分析軟件處理所得數(shù)據(jù)作出樹形圖，可直觀地看出亞種第Ⅰ和第Ⅳ的親緣關(guān)系最近，而第Ⅶ與其他亞種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

釀酒酵母；Interdelta PCR；區(qū)分鑒定；聚類分析；沙城產(chǎn)區(qū)；龍眼葡萄

葡萄酒釀造過程是包括細(xì)菌、酵母菌和霉菌在內(nèi)的微生物作用的結(jié)果，其中酵母菌對葡萄酒中化合物的形成和最終酒香的產(chǎn)生起到尤為重要的作用。在葡萄酒發(fā)酵初期，非釀酒酵母(non-Saccharomyces)，如假絲酵母(Candida)、有孢漢遜酵母(Hanseniaspora)、畢赤酵母(Pichia)、克魯維酵母(Kluyveromyces)等占有主導(dǎo)優(yōu)勢，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中乙醇濃度越來越高，對乙醇具有較高耐受力的釀酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)漸漸取代非釀酒酵母成為主導(dǎo)菌，并最終完成發(fā)酵過程[1]。許多文獻(xiàn)報道了不同釀酒酵母對發(fā)酵所得葡萄酒揮發(fā)性化合物形成及感官品質(zhì)的影響[2-3]，可見酵母菌種的選取在生產(chǎn)中的重要性。目前，我國葡萄酒生產(chǎn)中大量使用商品活性干酵母，優(yōu)良的酵母菌能夠保證發(fā)酵的正常進(jìn)行和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，然而大家都使用商用酵母必然導(dǎo)致葡萄酒風(fēng)味的雷同和單一，這正是篩選葡萄酒產(chǎn)區(qū)本土釀酒酵母以釀造具有獨特風(fēng)味葡萄酒的必要性[4]。

釀酒酵母往往存在于葡萄園和酒廠環(huán)境中。如酒廠設(shè)備表面或破碎的葡萄上釀酒酵母存在的概率很大[5]。先前的報道顯示，在葡萄園土壤和葡萄漿果表面很少能篩選到釀酒酵母[6]。本研究室于2008—2009年從河北沙城釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)的懷來縣沙城鎮(zhèn)沙營、夾河和東水泉3個自然村的龍眼葡萄園土壤、中國長城葡萄酒有限公司釀酒車間設(shè)備、龍眼葡萄酒的自然發(fā)酵過程等分別采集土壤、葡萄鮮果、葡萄汁、龍眼葡萄自然發(fā)酵液和擦拭設(shè)備表面等樣品共計184份。經(jīng)過傳統(tǒng)的表型分類和5.8S-ITS區(qū)域、26S D1/D2區(qū)域的RFLP分析和基因測序，得到了54株釀酒酵母(S. cerevisiae)，它們主要來自葡萄園土壤、葡萄汁和自然發(fā)酵的中后期。本實驗采用Interdelta PCR指紋圖譜法[7-8]對這54株釀酒酵母菌進(jìn)行亞種水平的區(qū)分，對區(qū)分結(jié)果進(jìn)行聚類分析，得出物種進(jìn)化樹形圖，使分類進(jìn)一步接近自然分類系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 出發(fā)菌株

本研究室于2008—2009年從沙城產(chǎn)區(qū)采集的184份菌樣中，經(jīng)分離、鑒定和測序確定54株釀酒酵母(S. cerevisiae)，這些菌的采樣地點、采樣時間及菌株編號如表1所示。

表1 釀酒酵母菌株來源及編號Table 1 Geographic sources and numbers of S. cerevisiae strains

1.2 試劑與培養(yǎng)基

Taq DNA 聚合酶(5U/μL)、Colorless GoTaq Reaction Buffer Promega公司；十二烷基磺酸鈉(SDS表面活性劑)、100bp DNA LadderⅠ(生化試劑) 北京鼎國生物技術(shù)有限公司；dNTP Mixture(生化試劑) Toyobo公司；引物δ12(5＇-TCAACAATGGAATCCCAAC-3＇)和δ 2(5＇-GTGGATTTTTATTCCAACA-3＇) 上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

YEPD 培養(yǎng)基(%)：酵母浸粉 1.0、蛋白胨 2.0、葡萄糖 2.0、瓊脂 2.0；WL培養(yǎng)基(%)：酵母浸粉 0.4、蛋白胨 0.5、葡萄糖 5、瓊脂粉 2、KH2PO40.055、KCl 0.0425、CaCl20.0125、MgSO40.0125、FeCl30.00025、MnSO40.00025，溴甲酚氯22mg/mL。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌單菌落分離

將篩選得到的保藏釀酒酵母菌稀釋涂布在YEPD培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)，經(jīng)過多次劃線分離得到單菌落。

1.3.2 酵母菌DNA提取

SDS裂解法：挑取新鮮菌體于盛有30μL 0.25% SDS溶液的EP管中，漩渦振蕩15s。在90℃熱激4min，再冰浴5min，然后13000r/min離心1min，取上清液20μL至新的EP管中，－20℃保藏備用。

1.3.3 Interdelta PCR指紋圖譜法區(qū)分鑒定酵母菌株

反應(yīng)體系(50μL)：引物δ12、δ2各1μmol/L；dNTP 0.2mmol/L；Colorless GoTaq Reaction Buffer 10μL；TaqDNA聚合酶0.5μL；模板DNA 1μL。反應(yīng)條件：97℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，45℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)30次；再72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠75V電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母菌的鑒定

圖1 釀酒酵母菌落形態(tài)(A)及顯微形態(tài)(B)Fig.1 Colony and microscopic morphology of Saccharomyces cerevisiae

本實驗室于2008—2009年采集的184份樣品經(jīng)過分離篩選共得到960株酵母菌。經(jīng)過稀釋涂布和反復(fù)劃線培養(yǎng)得到單菌落，再進(jìn)行5.8S-ITS區(qū)域和26S D1/D2區(qū)域的RFLP分析和基因測序，最終確定54株釀酒酵母，分別來自4個不同地點及時間(表1)，釀酒酵母占總篩得菌數(shù)的5.6%。釀酒酵母菌落為白色偏微綠色、火山狀凸起、表面光滑、邊緣整齊，其菌落及顯微形態(tài)見圖1。5.8S-ITS區(qū)域和26S D1/D2區(qū)域的RFLP分析結(jié)果見表2。5.8S-ITS區(qū)域和26S D1/D2區(qū)域PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜及分別用3種限制性核酸內(nèi)切酶CfoI、HaeIII和HinfI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜見圖2。

表2 5.8S-ITS區(qū)域和26S D1/D2區(qū)域的RFLP分析結(jié)果Table 2 Results of RFLP analysis of 5.8S-ITS and 26S D1/D2 regions

圖2 5.8S-ITS區(qū)域和26S D1/D2區(qū)域PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及3種限制性核酸內(nèi)切酶酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.2 Electrophoregrams of 5.8S-ITS and 26S D1/D2 regions digested with different restriction endonucleases and their PCR-amplified products

2.2 Interdelta PCR指紋圖譜鑒定釀酒酵母菌

1993年，Ness等[9]提出酵母菌基因組Ty1/Ty2 反轉(zhuǎn)座子兩端存在δ序列，同時獨立的δ序列原件也存在于酵母菌中。而且δ序列在釀酒酵母的基因組中數(shù)量是最多的，分布也最廣[10]，通過擴(kuò)增檢測δ序列的存在從而判斷菌株是否為釀酒酵母具有實際的應(yīng)用價值。Interdelta PCR指紋圖譜法由于操作方便，擴(kuò)增條帶電泳圖譜穩(wěn)定等優(yōu)點，在國外已經(jīng)逐漸取代傳統(tǒng)方法，廣泛被應(yīng)用于菌種鑒定中[11]。本實驗采用PCR指紋圖譜鑒定區(qū)分54株釀酒酵母，將其區(qū)分為7個亞種，所占比例分別為31.5%、11.1%、7.4%、42.6%、3.7%、1.85%和1.85%。使用Quantity One v4.62 軟件的核酸分子質(zhì)量預(yù)測功能，通過人工讀帶和軟件自動讀帶相結(jié)合的方法，刪除模糊不清和強(qiáng)度較低的電泳條帶，預(yù)測出利用Interdelta PCR方法產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物大致大小，Interdelta PCR指紋圖譜結(jié)果見表3，電泳圖譜如圖3所示。

表3 Interdelta PCR指紋圖譜分析結(jié)果Table 3 Results of Interdelta fingerprinting analysis of seven subspecies of Saccharomyces cerevisiae

圖3 釀酒酵母Interdelta PCR指紋圖譜分析電泳圖Fig.3 Interdelta fingerprinting patterns of Saccharomyce cerevisiae

由表3可以看出，第Ⅰ和第Ⅳ亞種的釀酒酵母數(shù)占有絕對優(yōu)勢。存在于自然發(fā)酵第三期和接觸酒廠設(shè)備的葡萄汁的釀酒酵母亞種種類最多，占總類數(shù)的43%。在自然發(fā)酵第三期，類型Ⅳ的釀酒酵母菌是最多的，占該時期總菌數(shù)的82%，可以推知其在發(fā)酵過程中處于主導(dǎo)地位；而且在此時期，釀酒酵母的多樣性十分豐富，這也證實了葡萄酒的釀造過程就是多種菌的相互作用，而發(fā)酵過程中微生物的多樣性會豐富葡萄酒的香氣，從而提升酒的品質(zhì)。

綜合以上實驗結(jié)果可知，沙城產(chǎn)區(qū)微生物資源豐富，將篩選得到的釀酒酵母應(yīng)用于葡萄酒生產(chǎn)可以獲得具有獨特風(fēng)味的葡萄酒。而應(yīng)用分子生物學(xué)手段對釀酒酵母菌區(qū)分到亞種水平，對于選取產(chǎn)區(qū)優(yōu)良酵母菌具有十分重要的作用。

2.3 聚類分析及結(jié)果

2.3.1 轉(zhuǎn)換0-1矩陣

將得到的所有DNA片段大小匯總，菌株電泳圖中有此條帶則為1，沒有則為0。依次將所有類型進(jìn)行轉(zhuǎn)換，將結(jié)果輸入到NTSYSpc軟件下的ntedit中，保存為聚類分析文件1。

2.3.2 形系數(shù)計算

在Ntsys中用Similarity程序中的Qualitalive data，輸入上面得到的聚類分析文件1，計算形系數(shù)矩陣，輸出文件命名為聚類分析文件2。

2.3.3 生成樹圖

用Clustering中的SHAN或Njoin輸入文件2進(jìn)行計算，聚類方法選擇為UPGMA，In case of ties選擇FIND，選擇的最大數(shù)要至少大于樣品數(shù)，計算輸出文件3，生成樹形圖見圖4。

圖4 釀酒酵母聚類分析樹形圖Fig.4 Cluster analysis tree of Saccharomyce cerevisiae

由圖4可知，各不同亞種的釀酒酵母菌之間的親緣關(guān)系，其中亞種第Ⅰ和第Ⅳ的親緣關(guān)系最近，而第Ⅶ與其他亞種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。在接觸酒廠設(shè)備的葡萄汁和自然發(fā)酵第三期獲得的釀酒酵母菌的相似性很高。滅菌的發(fā)酵罐或者剛建的新酒廠設(shè)備表面是沒有釀酒酵母存在的，設(shè)備上的釀酒酵母菌是在進(jìn)行了發(fā)酵之后殘留在設(shè)備外表面上的，因此設(shè)備表面的釀酒酵母菌種類和發(fā)酵過程中處于主導(dǎo)的釀酒酵母菌極為相似，且在篩選得到的釀酒酵母菌中數(shù)量上也處于主要地位。

3 結(jié) 論

釀酒酵母菌株的獲得是在自然發(fā)酵第三和第四期、葡萄酒廠生產(chǎn)的自流汁、接觸酒廠設(shè)備的葡萄汁中。而葡萄園土壤中釀酒酵母存在的數(shù)量很少，不容易獲得。利用Interdelta PCR指紋圖譜法能夠較快速準(zhǔn)確的將釀酒酵母菌在亞種水平上進(jìn)行區(qū)分，通過聚類分析可以得到這些不同亞種釀酒酵母菌的親緣關(guān)系，使其更加接近于自然分類系統(tǒng)。通過分析可以看出，葡萄酒的發(fā)酵過程是需要多種酵母菌參加反應(yīng)的，酵母菌種的混合發(fā)酵有利于酒的品質(zhì)和風(fēng)味的提高，而在發(fā)酵過程中產(chǎn)生最重要作用的釀酒酵母菌存在于發(fā)酵的第三和第四期。進(jìn)一步的研究是將區(qū)分到亞種水平的釀酒酵母菌進(jìn)行生理生化特性研究和發(fā)酵性能測試，從而篩選出適合于發(fā)酵生產(chǎn)用的菌株，對于豐富葡萄酒風(fēng)味，釀造具有地區(qū)特色的葡萄酒產(chǎn)品具有現(xiàn)實的指導(dǎo)意義。

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Interdelta PCR Fingerprinting for the Identification of Saccharomyce cerevisiae from Shacheng Area

ZHAO Jing-jing1，LI Yan1,2,*，ZHANG Li-zhong3，ZHUANG Yu-ting1
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. R&D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province, Shijiazhuang 050018, China；3. China Great Wall Wine Co. Ltd., Shacheng 075400, China)

Interdelta PCR fingerprinting technology was used to differentiate 54 Saccharomyce cerevisiae strains isolated from vineyard soil, brewing equipments and spontaneous fermentation process of Longan grape in Shacheng area. Results indicated that 7 genetic patterns were distinguished by Interdelta PCR fingerprinting. The genetic patterns I through VII accounted for 31.5%, 11.1%, 7.4%, 42.6%, 3.7%, 1.85% and 1.85%, respectively. The numbers of genotypes of yeasts isolated the late stage of spontaneous fermentation, the surface of brewing equipments and vineyard soil were 4, 3 and 2, respectively. Based on the cluster analysis tree, the genetic pattern I and IV had the closest genetic relationship, and the genetic pattern VII had the most far genetic relationship with others. The distribution and variation discipline of different Saccharomyce cerevisiae strains will provide a theoretical foundation for choosing excellent strains with their own favor characteristics.

Saccharomyce cerevisiae；Interdelta PCR；differentiation and identification；cluster analysis；Shacheng area； Longan grape

Q93.331

A

1002-6630(2010)23-0281-04

2010-07-06

河北省2009年科技支撐計劃課題項目(092210003D)

趙靜靜(1985—)，女，碩士研究生，主要傳統(tǒng)發(fā)酵工程創(chuàng)新技術(shù)研究。E-mail：ly5885@yahoo.com.cn

李艷(1958—)，女，教授，主要從事傳統(tǒng)發(fā)酵工程創(chuàng)新技術(shù)研究。E-mail：lymdh5885@163.com