楊建峰,石曉鵬,趙丹,鄧峰美,王振煥,陳雄英,王剛,何芳

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002)

TGF-β1 rs1800469基因多態(tài)性與新疆漢族原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究

楊建峰,石曉鵬,趙丹,鄧峰美,王振煥,陳雄英,王剛,何芳

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002)

為研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)基因單核苷酸多態(tài)(SNP)rs1800469及血漿水平與新疆漢族原發(fā)性高血壓(EH)的關(guān)系。采用整群抽取隨機(jī)抽樣的方式,以新疆沙灣縣732名漢族人(EH組365人,對(duì)照組367人)為研究對(duì)象,進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和臨床檢查,并采集血樣。用雙抗體夾心法(ELISA試劑盒)測(cè)量 TGF-β1血漿濃度。SNaPshot方法進(jìn)行基因分型。rs1800469基因型及等位基因在 EH組和對(duì)照組分布差異無(wú)顯著性(P>0.05)。TGF-β1血漿水平在EH組與對(duì)照組各基因型和等位基因之間無(wú)差異(P>0.05)。結(jié)果表明:在新疆漢族人群中TGF-β1基因 rs1800469位點(diǎn)存在C/T分子變異,與原發(fā)性高血壓缺乏關(guān)聯(lián)。同時(shí) TGF-β1基因rs1800469位點(diǎn)多態(tài)性與 TGF-β1血漿水平不相關(guān)。

TGF-β1;基因多態(tài)性;血漿水平;高血壓;新疆漢族;單核苷酸多態(tài)

Abstract:We investigate the relationship between the single nucleotide polymorphism rs1800469 in transforming growth factor-β1(TGF-β1)gene,protein levels and essential hypertension(EH)in the Han population in Xinjiang.Based on the case-control study,we selected 732(365 EH patients,367 controls)Han Chinese people from the Boertonggu countryside of Shawan region in the Xinjiang Uygur Autonomous Region of China by random cluster sampling.After questionnaires and physical examinations,we collected blood samples,and the blood levels of TGF-β1 were quantified using sandwich ELISA.The polymorphisms of TGF-β1 in the studygroups were detected with SNaPshot system.The frequencies of genotypes and alleles of rs1800469 had no differences between EH and controls(P>0.05).There were no differences of TGF-β1 levels between the different genotypes and alleles in rs1800469 of TGF-β1 gene(P>0.05).The result showed there was a C to T substitution at rs1800469 of TGF-β1 gene,but there was a lack of association between the mutation of TGF-β1 gene and essential hypertension in the Han of Xinjiang.There was no association between the rs1800469 and TGF-β1 blood levels in them.

Key words:TGF-β1;gene polymorphism;blood level;hypertension;Han in the Xinjiang;single nucleotide polymorphism

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一個(gè)多功能生長(zhǎng)因子 ,能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、胚胎形成、傷口愈合和血管再生。近年來(lái),隨著對(duì) TGF-β1的深入研究,發(fā)現(xiàn)其系一基因家族編碼產(chǎn)物,對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)沉積以及介導(dǎo)心血管疾病的發(fā)生起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)在眾多細(xì)胞生長(zhǎng)因子中,TGF-β1基因變異與高血壓及其靶器官損害的關(guān)系非常密切[1]。對(duì)于 TGF-β1基因變異與新疆漢族EH關(guān)系目前未見(jiàn)報(bào)道。

本文采用SNaPshot SNP方法在新疆漢族人群中對(duì) TGF-β1基因多態(tài)進(jìn)行分析,探討 rs1800469與新疆漢族高血壓的相關(guān)性,以闡明 TGF-β1基因多態(tài)、血漿水平和環(huán)境因素交互作用及與EH的關(guān)系,以便尋找新疆漢族EH可能的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子,揭示新疆漢族EH的遺傳易感機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

在新疆天山北麓塔城地區(qū)沙灣縣博爾通古鄉(xiāng)牧區(qū)、元興宮村、紅土莊字村及烏拉烏蘇鎮(zhèn),采取整群抽取隨機(jī)抽樣,選擇年齡18歲以上72歲以下,至少3代在本地居住的漢族居民,非一、二級(jí)親屬,無(wú)血緣關(guān)系,無(wú)異族通婚史。

病例組納入標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)1999年 WHO/ISH診斷標(biāo)準(zhǔn),收縮壓 ≥140 mmHg和(或)舒張壓 ≥90 mmHg,常規(guī)檢查排除繼發(fā)性高血壓、心肌梗死、過(guò)量飲酒、服用避孕藥史,無(wú)糖尿病、甲狀腺及肝腎疾病史等。

本次共調(diào)查2300人,隨機(jī)選取漢族732人作為研究對(duì)象,EH組365人(男性160人,女性205人,平均年齡52.39歲),對(duì)照組367人(男性143人,女性224人,平均年齡47.84歲)。

由于本研究需測(cè)量 TGF-β1血漿水平,因此尚需排除其它影響 TGF-β1血漿濃度測(cè)定的因素(如動(dòng)脈粥樣硬化、肝硬化、腫瘤、腎臟疾病等)。

1.2 基因組DNA提取

采用酚-氯仿法提取DNA。

1.3 TGF-β1基因片段擴(kuò)增

設(shè)計(jì)PCR引物用于擴(kuò)增包含SNP位點(diǎn)的片段,及緊鄰SNP位點(diǎn)的延伸引物用于單堿基延伸。檢索美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中SNP位點(diǎn)序列,用 Primier primer 5軟件設(shè)計(jì)PCR引物及延伸引物。引物如下:

上游:5′-cttagccacatgggaggtgctc-3′,

下游 :5′-ggagagtcaggctgggaaacaa-3′。

PCR反應(yīng)體系:10×buffer 2μL,25 mm MgCl21.2μL,dNTP 0.6μL,多重 PCR引物 2 μL,Hotstar Taq聚合酶 0.2μL,DNA模板 1μL,去離子水 13μL,總體系 20μL。

1.4 TGF-β1基因片段的多態(tài)性檢測(cè)

利用SNaPshot SNP分型技術(shù)進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型。PCR產(chǎn)物延伸反應(yīng)即單堿基延伸反應(yīng)。單堿基延伸引物序列如下:CCTCCTGACCCTTCCATCC。

延伸反應(yīng)體系(10μL)包括 5μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI),2μL純化后 PCR產(chǎn)物,1μL延伸引物,2μL超純水。PCR循環(huán)程序:96℃預(yù)變性1 min;28×(96℃變性10 s,50℃退火5 s,60℃延伸30 s);60℃充分延伸1 min;4℃保存。延伸產(chǎn)物純化,在10μL延伸產(chǎn)物中加入1U SAP酶,37℃溫浴1h,然后 75℃滅活 15 min。延伸產(chǎn)物上ABI3130XL測(cè)序儀,取0.5μL純化后的延伸產(chǎn)物,與0.5μL Liz120 SIZE STANDARD,9μL Hi-Di混勻,95℃變性5 min后上ABI3130XL測(cè)序儀。

將在測(cè)序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用 GeneMapper 4.0(AppliedBiosystems Co.,Ltd.,USA)來(lái)分析,進(jìn)行基因型判斷。

1.5 TGF-β1血漿濃度測(cè)定

用ELISA試劑盒測(cè)定血漿水平,試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司(Westang,Shanghai,China)人類 TGF-β1 ELISA試劑盒。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)算兩組基因型頻率以確認(rèn)符合 Hardyweinberg平衡。

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x ±S)表示,兩組間比較采用 t檢驗(yàn),多組間比較用方差分析,兩個(gè)計(jì)量資料之間有無(wú)相關(guān)采用相關(guān)分析。

計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。由基因型頻率計(jì)算等位基因頻率,組間等位基因頻率和基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn),不同基因型與 TGF-β1血漿水平的關(guān)系比較采用單因素方差分析(One way ANOVA),P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 漢族EH組與對(duì)照組的臨床相關(guān)指標(biāo)比較

比較結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知:各指標(biāo)如收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓、脈壓、體重指數(shù)、腰臀比、空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的平均水平,兩組間比較均有差異(P<0.05),EH組均高于照組;其余指標(biāo)如年齡、高密度脂蛋白兩組間均無(wú)差異(P>0.05)。

表1 EH組與正常對(duì)照組臨床相關(guān)指標(biāo)比較Tab.1 Clinical parameters of essential hypertension and contro subjects x±S

2.2 漢族tSNP及單位點(diǎn)單堿基延伸電泳峰型

結(jié)果見(jiàn)圖 1。圖 1中橙色峰(A)為 SIZE STANDARD,藍(lán)色(B)、綠色(C)、紅色(D)、黑色峰(E)分別代表延伸加入 ddGTP、ddATP、ddTTP和ddCTP的延伸產(chǎn)物,峰下面標(biāo)注的等位基因(如果用的延伸引物是正向的,則跟延伸加入的堿基一致,如果是反向的,則跟延伸加入的堿基互補(bǔ))。

圖2為rs1800469位點(diǎn)單堿基延伸電泳峰型圖。根據(jù)單峰、雙峰來(lái)判斷基因型,單峰為純合基因型,雙峰為雜合基因型。

圖1 漢族不同SNP單堿基延伸電泳峰型Fig.1 SNaPshot electropherogram result of all SNPs in Han groups

圖2 rs1800469位點(diǎn)單堿基延伸電泳峰型Fig.2 SN Pshot electropherogram result of rs1800469(C/C、C/T、T/T)

2.3 TGF-β1基因型及等位基因在新疆漢族EH組與對(duì)照組中的分布及患病風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)

rs1800469位點(diǎn)基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),提示該人群有較好的代表性。表2中,rs1800469位點(diǎn)在EH組與對(duì)照組間均無(wú)差異。

表2 漢族rs1800469位點(diǎn)基因型及等位基因分布及患病風(fēng)險(xiǎn)Tab.2 Distribution of TGF-β1 genotypes and alleles in case and control groups in Han

2.4 TGF-β1基因多態(tài)性與新疆漢族TGF-β1血漿水平的關(guān)系

rs1800469位點(diǎn)基因型及等位基因在漢族人EH組和對(duì)照組中 TGF-β1血漿水平的比較如表3所示,各位點(diǎn)基因型在 EH組與對(duì)照組的 TGF-β1血漿濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。等位基因在EH組與對(duì)照組的 TGF-β1血漿濃度差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。單因素方差分析(One-Way ANOVA)發(fā)現(xiàn) EH組或?qū)φ战M中各基因型TGF-β1血漿濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,T檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)等位基因在EH組或?qū)φ战M中 TGF-β1血漿濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可以看出各位點(diǎn)基因多態(tài)性與漢族 TGF-β1血漿水平無(wú)關(guān)。

表3 漢族rs1800469基因型及等位基因在漢族EH組和對(duì)照組中TGF-β1血漿水平的比較Tab.3 TGF-β1 protein levels in different genotypes and alleles of rs1800469 in case and control groups in Han±S

表3 漢族rs1800469基因型及等位基因在漢族EH組和對(duì)照組中TGF-β1血漿水平的比較Tab.3 TGF-β1 protein levels in different genotypes and alleles of rs1800469 in case and control groups in Han±S

注:★表示One-Way ANOVA分析發(fā)現(xiàn) EH組或?qū)φ战M中3種基因型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;△表示 T-Test分析發(fā)現(xiàn)EH組或?qū)φ战M中兩種等位基因之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

基因型及等位基因EH組(n=365/人)對(duì)照組(n=367/人) t P rs1800469 CC 31.50±11.36 31.43±9.25 0.012 0.990 CT 30.07±11.62 29.07±12.20 0.300 0.765 TT 30.80±8.25 23.57±7.29 1.566 0.121 P=0.942★P=0.278★C 31.50±10.78 31.43±13.34 0.017 0.986 T 30.36±9.22 27.52±10.78 1.496 0.135 P=0.887△P=0.146△

3 討論

目前EH的病因尚不完全清楚,只是認(rèn)識(shí)到某些因素的存在與EH發(fā)生有關(guān),包括環(huán)境與遺傳兩個(gè)方面的因素,屬于多基因、多因素及兩者交互作用引起的復(fù)雜性狀疾病。不同的基因背景可以造成不同人群對(duì)于某些疾病存在不同的易感性。分析臨床相關(guān)指標(biāo)比較發(fā)現(xiàn):漢族群體中,血壓包括收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓、脈壓,在 EH組和對(duì)照組有顯著差異。研究結(jié)果提示:新疆漢族高血壓患者中普遍存在著高血壓知曉率、服藥率和控制率低的狀況。大規(guī)模臨床研究證實(shí),對(duì)高血壓病人血壓的控制尤其是收縮壓能減少腦卒中與心力衰竭的發(fā)生。因此,長(zhǎng)期服用藥物治療高血壓同時(shí)建立健康的生活方式,合理膳食,適量運(yùn)動(dòng),戒煙限酒和調(diào)整心理平衡,只有這樣才能提高高血壓治療率和控制率,有效降低高血壓病發(fā)病率、致殘率及死亡率,提高患者的生活質(zhì)量[2]。同時(shí),超重和肥胖是EH的危險(xiǎn)因素,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3-6],尤其是以肥胖更顯著。已有研究表明,血脂代謝異常(主要是指血漿中甘油三酯和總膽固醇以及低密度脂蛋白的濃度升高)是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素之一,本研究調(diào)查結(jié)果顯示漢族EH人群中血漿總膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白較正常血壓人群明顯增高,進(jìn)一步證實(shí)了超重、肥胖及血脂紊亂與 EH的關(guān)系密切。上述研究結(jié)果提示,控制體重,降低甘油三酯、總膽固醇及血糖濃度,減少飲酒量,增加蔬菜攝入,有助于預(yù)防高血壓的發(fā)生。

本研究 TGF-β1rs1800469基因型頻率在新疆漢族總?cè)巳悍植?CC、CT、TT分別為24.7%、50.5%、24.7%,內(nèi)地漢族則為 30.0%、51.1%、19.9%[6],兩者多態(tài)性分布差異無(wú)顯著性?，幾迦藶?6.0%、43.3%、10.7%[6],德 國(guó) 人 為 42.6%、45.4%、12.0%[7],英國(guó)人為 44.4%、46.2%、9.4%[8],均與我們報(bào)道的rs1800469基因型頻率分布存在差異。由此可以看出 TGF-β1 rs1800469基因多態(tài)性的分布情況在不同民族具有很大的差異性。

新疆漢族 EH組和對(duì)照組 TGF-β1 rs1800469基因型及等位基因頻率無(wú)差異,可能與以下因素有關(guān):(1)可能是本研究的樣本量不夠大,提供的信息量有限。(2)SNP在不同人群中分布頻率可能不一樣,雜合程度也未必相同[9],血壓遺傳度在不同人群間差異較大,可能正是由于這種分布差異,SNP在關(guān)聯(lián)分析時(shí)提供的信息量也可能存在較大的差別。(3)疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制非常復(fù)雜,可能存在很多未知通路,或者存在連鎖不平衡、基因多效性等。所以每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的存在并不是單獨(dú)起作用,它們之間既可表現(xiàn)為協(xié)同也可表現(xiàn)為拮抗[10]。TGF-β1基因型是調(diào)節(jié) TGF-β1血漿水平的重要調(diào)節(jié)因素之一,來(lái)自英國(guó)170對(duì)孿生姐妹[11]和中國(guó)人群的報(bào)道也證實(shí)了血漿中 TGF-β1的濃度rs1800469T/T較C/T、C/C為高[11-12]。在本研究中,發(fā)現(xiàn)新疆漢族中TGF-β1 rs1800469 基因型與 TGF-β1 血漿水平都不相關(guān)。上述研究結(jié)果表明 TGF-β1基因型很可能是 TGF-β1血漿水平的重要調(diào)節(jié)因素之一,但rs1800469C>T不同基因型與 TGF-β1血漿水平之間關(guān)系在不同種族、地域間是否存在差異以及產(chǎn)生差異的機(jī)制,尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述,在新疆漢族人群中存在 TGF-β1 rs1800469基因多態(tài)性,其分布頻率在 EH和對(duì)照組中無(wú)差異。TGF-β1基因型與血漿水平無(wú)相關(guān)性。除此之外,環(huán)境因素在新疆漢族人群EH高發(fā)的機(jī)制中可能占有重要地位,其中超重、肥胖、血脂代謝紊亂是EH危險(xiǎn)因素。

[1]Cambien f,Ricard s,Troesch A,et al.Polymorphisms of the transforming growth factor-β1 gene in relation to myocardial infarction and blood pressure[J].Hypertension,1996,28(5):881-887.

[2]李新華,陶金.淺淡健康和健康教育[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2001,4(5):337-340.

[3]JovanoviéZ,Crncevié-Orli Z,Stimac D,et al.Effects of obesity reduction on cardiovascular risk factors:comparison of individual and group treatment-substudy of the Croatian Healthy Weight Loss Programme[J].Coll Antropol 2009,33(3):751-757.

[4]Nomata Y,Kume N,Sasai H,et al.Weight reduction can decrease circulating soluble lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 levels in overweight middleaged men[J].Metabolism,2009,58(9):1209-1214.

[5]Veber V P,Kazymov M S,Kopina M N,et al.Age and sex-related prevalence of overweight,arterial hypertension,hyperglycemia and their combina[J].Ter Arkh.2008,80(9):76-78.

[6]梁曉萍,韓全水,文錦麗,等.超重和肥胖人群高血壓病的患病率及血清脂聯(lián)素水平的變化[J].中華心血管病雜志,2006,34(1):41-43.

[7]徐群清,韋葉生,梁峰.廣西瑤族與漢族人群 TGF-β1基因啟動(dòng)子-509 C/T多態(tài)性的研究[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2005,13(7):20-27.

[8]Hona L I,Fassmann A,Benes P,et al.5 polymorphisms in the transforming growth factor-beta 1 gene(TGF-beta 1)in adult periodontitis[J].J Clin Periodontol,2002,29(4):336-341.

[9]Cotton S A,Ghn R A,Williams S,et al.Role of TGF-beta 1 in renalparenchymal scarring following childhood urinary tract infection[J].Kidney Int,2002,61(1):61-67.

[10]Goddard K A,Hopkins P J,Hall J M,et al.Linkage disequilibrium and allele-frequency distributions for 114 single-nucleotide polymorphisms in five populations[J].Am J Hum Genet,2000,66(1):216-234.

[11]Salisbury B A,Pungliya M,Choi J V,et al.SNP and haplotype variation in the human genome[J].Mutat Res,2003,526(12):53-61.

[12]Luedecking E K,Dekosky S T,Mehdi H,et al.Analysis of genetic polymorphism in the transforming growth factor-beta 1 gene and the risk of Alzheimer’s disease[J].Hum Genet,2000,106(5):565-569.

[13]Yao W,Wang Z M,Wamg M Z,et al.The relationship between the concentration of TGF-beta1 in serum and its gene polymorphisms in CWP[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2005,36(6):827-829.

Relationship between the rs1800469 Polymorphisms of TGF-β1 Gene and Essential Hypertension in the Han of Xinjiang

YANGJianfeng,SHI Xiaopeng,ZHAO Dan,DENG Fengmei,WANG Zhenhuan,CHEN Xiongying,WANG Gang,HE Fang
(Medical College of Shihezi University/Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases,Shihezi 832002,China)

R446.1

A

1007-7383(2010)05-0576-06

2010-01-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30760077)

楊建峰(1981-),男,碩士生,專業(yè)方向?yàn)樾难懿±砩硌芯俊?/p>

何芳(1964-),女,教授,從事心血管病理生理研究;e-mail:fangf2002shz@126.com。