魏魯予,剡根強,齊亞銀,莫敏,王靜梅

(石河子大學動物科技學院,石河子832003)

牛源木糖葡萄球菌的生物學特性及耐藥性分析

魏魯予,剡根強,齊亞銀,莫敏,王靜梅

(石河子大學動物科技學院,石河子832003)

為確定致奶牛乳房炎木糖葡萄球菌的某些生物學特性及耐藥性,采用常規(guī)方法對60株木糖葡萄球菌分離株進行了檢測與分析。結(jié)果顯示:被測菌株血漿凝固酶均為陰性,過氧化氫酶及甘露醇發(fā)酵為陽性,8株分離菌出現(xiàn)β-溶血,5株對小白鼠有致病性。本次分離的木糖葡萄球菌對磺胺嘧啶(耐藥率100%)、青霉素鉀(耐藥率93.3%)、慶大霉素(耐藥率90%)、四環(huán)素(耐藥率90%)高度耐藥,對環(huán)丙沙星(耐藥率43.3%)、氧氟沙星(耐藥率46.6%)呈中度敏感。

木糖葡萄球菌;分離與鑒定;藥敏試驗

Abstract:To determine parts of biolgical characteristics and medicine sensitivity of Staphyloccus xylosus,60 strain Staphyloccus xylosus were examined with common methods.Results showed that examined bacteral strain were staphylocoagulase feminine,catalase and Mannitol fermentation were masculine.8 bacteral strains hadβhemolysis and 5 bacteral strains had pathogenicity.The drug sensitivity tests showed that those strains were resistant to Sulfadiazine(drug fast rate 100%),benzylpenicillin potassium(drug fast rate 93.3%),Tetracycline(drug fast rate 90%),Gentamicin(drug fast rate 90%),and medium sensitive to Ciprofloxacin(drug fast rate 43.3%),Ofloxacinmedium(drug fast rate 46.6%).

Key words:Staphyloccus xylosus;isolation and identification;resistance test

木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylose,S.xylose)是一種血漿凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase negative staphylococcus,CNS)。此菌廣泛分布于自然界,以往被認為是非致病菌[1]。木糖葡萄球菌作為CNS中的一種,其致病性較弱[2]。近年來,由于抗生素的廣泛應(yīng)用,葡萄球菌的耐藥性也逐年增強。隨著介入性手段和免疫抑制劑的使用,血漿凝固酶陰性葡萄球菌也成為重要的機會致病菌,并出現(xiàn)多重耐藥菌株[3]。在奶牛乳房炎的臨床防治中,隨著抗生素的濫用,凝固酶陰性葡萄球菌感染的乳房炎也不斷增加[4],因此對凝固酶陰性葡萄球菌的確切認知就顯得很有必要。

隨著抗生素的普遍應(yīng)用,治療手段的改變,致病力弱的凝固酶陰性葡萄球菌逐漸代替了致病力強的金黃色葡萄球菌,占重要位置[4]。在引起奶牛乳房炎葡萄球菌中,報道最多的為金黃色葡萄球菌,木糖葡萄球菌報道的很少。在引起奶牛乳房炎細菌中,凝固酶陰性葡萄球菌的總體比例有逐漸上升趨勢[5]。因此對引起奶牛乳房炎凝固酶陰性葡萄球菌生物學特性及耐藥性監(jiān)測就顯得很有必要。

為了確定石河子地區(qū)奶牛場乳房炎病原菌分布情況,本實驗采集了石河子部分奶牛場臨床型乳房炎奶牛乳樣,對其中的木糖葡萄球菌進行了分離鑒定,并檢測其對磺胺嘧啶等12種常用抗生素的藥物敏感性,以期為本地區(qū)奶牛乳房炎的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

分別采集北疆地區(qū)14個規(guī)?；龅呐R床型乳房炎奶樣623份,分離得到172株葡萄球菌,篩選出木糖葡萄球菌60株,金黃色葡萄球菌為本實驗室保存牛源金黃色葡萄球菌。

1.1.2 生化試劑

脲酶、吡咯烷酮酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、精氨酸芳基酰胺酶、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖、木糖、果糖、蕈糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、木糖醇、纖維二糖、密二糖、棉子糖、松三糖等用于木糖葡萄球菌鑒定的生化鑒定培養(yǎng)基由石河子大學動物科技學院微生物實驗室制備。

1.1.3 藥敏試驗

選取環(huán)丙沙星、林可霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、硫酸鏈霉素、紅霉素、頭孢拉定、阿米卡星、青霉素鉀、慶大霉素、磺胺嘧啶、四環(huán)素等用于葡萄球菌藥敏試驗常用藥物。

1.2 方法

1.2.1 葡萄球菌分離培養(yǎng)基的制備

Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0 g,牛肉膏5.0 g,酵母浸膏1.0 g,丙酮酸鈉10.0 g,甘氨酸12.0 g,氯化鋰(含6份結(jié)晶水)5.0 g,瓊脂粉20.0 g,蒸餾水950 mL。將各成分加到蒸餾水中加熱煮沸至完全溶解,冷至45～50℃,校正p H值至7.0±0.2,121℃高壓滅菌15 min,4℃保存[6]。

1.2.2 葡萄球菌的分離

無菌條件下取乳汁樣品各25 mL,加入至225 mL 7.5%氯化鈉肉湯增菌液中,放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,轉(zhuǎn)接劃線于Baird-Parker瓊脂平板,置37℃培養(yǎng)24 h,挑取典型菌落進行革蘭氏染色 ,鏡 檢[7]。

1.2.3 木糖葡萄球菌生化鑒定

分離純培養(yǎng)的菌落經(jīng)革蘭染色初步判定為葡萄球菌后,其發(fā)酵葡萄糖、對新生霉素(5μg/片)和桿菌肽(0.04 IU/片)耐藥、凝固酶陰性、分解木糖,進行木糖陽性CNS的種間鑒別[8],同時按梅里埃公司的葡萄球菌生化鑒定系統(tǒng)進行生化鑒定并做相應(yīng)的補充實驗。

1.2.4 血液瓊脂平板培養(yǎng)

將普通瓊脂培養(yǎng)基121℃高壓滅菌20 min,冷卻至50℃時,加入健康成年家兔的脫纖血,制成5%脫纖血瓊脂平板培養(yǎng)基。挑選Baird-Parker培養(yǎng)基上的灰色(或黑色)單個菌落,劃線接種于血液瓊脂平板,37℃,培養(yǎng)24 h,觀察溶血情況。

1.2.5 血漿凝固酶試驗

吸取0.5 mL兔血漿與0.5 mL木糖葡萄球菌24 h肉湯培養(yǎng)物充分混勻,置37℃培養(yǎng),每隔0.5 h觀察1次,連續(xù)觀察6 h,出現(xiàn)凝固時,將小試管傾斜或倒置時,內(nèi)容物不流動,判為陽性。同時做陰陽性對照。

1.2.6 過氧化氫酶試驗

在載玻片上滴1滴3%的過氧化氫,挑取單個菌落放在過氧化氫中觀察變化。在30 s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡者為陽性,不產(chǎn)生氣泡者為陰性。

1.2.7 甘露醇發(fā)酵試驗

將純培養(yǎng)的各分離菌株接種于甘露醇發(fā)酵管中,置37℃溫箱中培養(yǎng)24 h,觀察分解甘露醇的情況。

1.2.8 小白鼠感染試驗

將小白鼠分成15組,每組2只,選擇8株具有β-溶血特性的木糖葡萄球菌和任意選取6株不具有β-溶血特性的木糖葡萄球菌分別腹腔接種小白鼠,體重15～20 g/只,每只 0.2 mL(含 5.0×107CFU細菌),1組注射生理鹽水,觀察小鼠反應(yīng),實驗小白鼠由石河子大學實驗動物中心提供。

1.2.9 藥敏試驗

按 K-B紙片擴散法進行藥敏試驗[9].將分離株分別接種LB肉湯,37℃搖床培養(yǎng)16～18 h。用滅菌的棉拭子蘸取搖勻的肉湯培養(yǎng)物,均勻的涂布到直徑90 mm的MH平板表面,每一菌株涂2塊平板。用無菌鑷子將藥敏紙片緊貼在平板表面(每塊平板貼6個藥敏紙片),紙片與平板內(nèi)緣相距不得少于15 mm,兩紙片之間的距離不得少于24 mm,37℃18～24 h后記錄結(jié)果。

以藥敏紙片周圍沒有肉眼可見生長區(qū)域為抑菌圈,根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷細菌對抗菌藥的敏感性。判定標準根據(jù)NCCLS 2004年新版標準進行判定[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色鏡檢結(jié)果

由圖1可見,此菌為革蘭陽性球菌,呈單個,成雙及不規(guī)則葡萄狀排列,無芽胞,無莢膜,無鞭毛。

圖1 葡萄球菌革蘭氏染色(100×10)Fig.1 Staphylococcus Gram staining(100×10)

2.2 血瓊脂平板培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)觀察,分離純培養(yǎng)24 h后在血瓊脂平板上長出灰白色、中央凸起、邊緣光滑、直徑為2～3 mm的菌落。革蘭染色呈散在狀葡萄球菌。

2.3 菌株的生化鑒定結(jié)果

此次從臨床型乳房炎奶樣中分離的菌株,木糖葡萄球菌觸酶陽性,發(fā)酵葡萄糖,血漿凝固酶陰性,符合CNS的一般特性。

生化反應(yīng)結(jié)果:氧化酶陰性,V-P陽性,能還原硝酸鹽。脲酶、吡咯烷酮酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖、木糖、果糖、蕈糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、木糖醇均為陽性,其它均為陰性。

經(jīng)法國生物梅里埃API Staph(葡萄球菌鑒定條)鑒定,此次經(jīng)生化鑒定的木糖葡萄球菌,符合率在98%以上。

2.4 血漿凝固酶、過氧化氫酶和甘露醇發(fā)酵試驗結(jié)果

此次分離的木糖葡萄球菌血漿凝固酶均為陰性,對照組金黃色葡萄球菌為陽性;過氧化氫酶均為陽性;甘露醇發(fā)酵試驗均為陽性。

2.5 動物感染試驗結(jié)果

8組小白鼠在接種具有β-溶血特性木糖葡萄球菌后24 h開始出現(xiàn)精神萎靡,身體蜷縮,被毛逆立;48 h后,其中5組小白鼠全部死亡,死后剖檢可從肝、脾、淋巴結(jié)和腦組織中分離出與病料分離株具有相同生物學特性的細菌。不具有β-溶血特性的6組中,除2組精神輕微萎靡外,無死亡,對照組小白鼠無癥狀。

2.6 藥物敏感試驗

應(yīng)用12種臨床常用抗生素對60株木糖葡萄球菌進行了藥敏試驗,結(jié)果見表1。

從表1可以看出,此次分離的木糖葡萄球菌對恩諾沙星、阿米卡星敏感,對磺胺嘧啶,青霉素鉀、慶大霉素、四環(huán)素高度耐藥,對環(huán)丙沙星、氧氟沙星中度敏感,對恩諾沙星,阿米卡星敏感。

表1 12種臨床常用抗生素對木糖葡萄球菌的藥敏試驗結(jié)果Tab.1 The results of resistance test of 12 antibiotics to Staphylococcus xylosus

3 討論

金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的最主要病原菌,約50%的奶牛乳房炎是由該菌引起。而本次研究分離的木糖葡萄球菌占葡萄球菌分離株的34.88%,在引起奶牛乳房炎的葡萄球菌中占較大比例,說明在引起奶牛乳房炎細菌中,凝固酶陰性葡萄球菌的總體比例逐漸上升,這是近年奶牛乳房炎病原菌的新特點。

木糖葡萄球菌觸酶陽性,可區(qū)別于鏈球菌屬;氧化酶陰性、發(fā)酵葡萄糖,可區(qū)別于微球菌屬。在葡萄球菌致病性鑒定中,凝固酶陰性并不是致病性的重要參考因素,細菌是否具有溶血性在分析細菌致病性方面具有重要參考價值。

此次分離的木糖葡萄球菌對磺胺嘧啶青霉素鉀高度耐藥,而青霉素、磺胺類等目前主要用于治療奶牛乳房炎的藥物[11],對常見的致病菌抑菌效果較差,甚至無效。隨著新的抗菌藥物的廣泛使用,將會面臨新的耐藥性的問題。因此有必要在給藥途徑、藥物配合使用上進行進一步的研究,以達到有效控制本病的目的。在使用抗生素時,應(yīng)避免使用氨基糖苷類和磺胺類抗生素,而選用對葡萄球菌具有較好抑菌效果的藥物。

[1]Rupp P E,Archer G L.Coagulate-negative staphylococci:pathogens associated with medical progress[J].Clin Infect Dis,1994,19(6):231.

[2]路娟,仲椒英.木糖葡萄糖菌腦術(shù)后感染1例[J].中華醫(yī)學檢驗雜志,1991,14,63.

[3]Martin de Nicols M M,Vindel A,Sacz-Nieto J A.Epidemio-logical typing of clinically significant strains of coagulase-negative staphylococci[J].J Hosp Infect,1995,29(11):35.

[4]Harmon RJ,Langlois B E.Mastitis due to coagulate negative Staphylococcus species[J].Agri Practice,1989,10:29-34.

[5]戈勝強,柴同杰,等.奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性檢測[J].西北農(nóng)林科技大學學報:自然科學版,36(11):40-45.

[6]葉應(yīng)嫵,王毓三.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].第2版.南京:東南大學出版社,1997.

[7]李英奇,剡根強.新疆北疆地區(qū)臨床型乳房炎病原細菌的分離鑒定[J].石河子大學學報:自然科學版,2009,27(6):56-59.

[8]徐迪誠,馬俊才,王艷,等.細菌編碼鑒定手冊(葡萄球菌)[M].哈爾濱:黑龍江人民出版社,2000.

[9]姚火春.獸醫(yī)微生物學實驗指導[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2002.

[10]NCCLS.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing,fourteenth informational supplement[J].NCCLS,Wayne,Pennsylvania,2004,24(1):151-159.

[11]Kaarina S H,Olavi E.Efficacy of parenteral administration of three antimicrobial agent in treatment of clinical mastitis in lactating cows:487(1989-1995)[J].J Am Vet Med Assoc,1998,212(3):407-412.

Biological Characteristics and Medicine Sensitive Test of Staphyloccus xylosus

WEI Luyu,YAN Genqiang,QI Yaying,MO Ming,WANGJingmei
(College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S852.611

A

1007-7383(2010)05-0572-04

2009-10-19

魏魯予(1983-),男,碩士生,專業(yè)方向為動物傳染病診斷與防治;e-mail:weiluyu2007@126.com。

王靜梅(1958-),女,高級實驗師,從事動物傳染病診斷與防治研究。