李學(xué)寧,杜軍偉,李鴻彬

(1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003;2石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子832003)

棉花脫氫抗壞血酸還原酶基因的克隆、原核表達(dá)與純化

李學(xué)寧1,杜軍偉2,李鴻彬1

(1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003;2石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子832003)

為進(jìn)一步探討脫氫抗壞血酸還原酶的生物學(xué)功能,克隆棉花的脫氫抗壞血酸還原酶基因,對(duì)該基因進(jìn)行了原核表達(dá),并對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化和分析。通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增脫氫抗壞血酸還原酶基因全長(zhǎng),利用BamH I和Xhol I酶切位點(diǎn)將其克隆至組氨酸(histidine,His)融合蛋白表達(dá)載體pET28a中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后,經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy-β-D-5-thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),用 SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物,并用親和層析柱純化重組表達(dá)的pET28a-DHAR蛋白。結(jié)果表明:重組體PET28a-DHAR經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定證實(shí)構(gòu)建成功。導(dǎo)入大腸桿菌BL21進(jìn)行表達(dá),SDS-PAGE分析目的蛋白高效表達(dá),相對(duì)分子量為26 kD左右,并獲得了純化的 His-DHAR融合蛋白。

棉花;脫氫抗壞血酸還原酶基因;克隆;原核表達(dá)

Abstract:A cotton dehydroascorbate reductase gene was cloned,and expression was performed using prokaryotic expression vector.The full-length cDNA of GhDHAR was cloned by RT-PCR,and then was constructed into pET28a vector containing histidine.Recombinant pET28a-DHAR plasmid was obtained after digestion using BamH I and Xhol I restriction endonuclease sites.Recombinant fusion protein was produced after transformation into E.coli BL21(DE3)with subsequent IPTGinduction,and was purified utilizing a histrap chromatogram column.SDSPAGE identification was also used to analysis the recombinant protein expression,and a particular 26 kD protein band visualized successfully.The results establish a basis for further functional research of DHAR gene and molecular mechanism elucidation of ascorbate participating cotton fiber fast elongation.

Key words:cotton;dehydroascorbate reductase gene;cloning;prokaryotic expression

纖維長(zhǎng)度是棉花纖維品質(zhì)最重要的參考指標(biāo)之一,纖維的最終長(zhǎng)度由細(xì)胞快速伸長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期所決定。當(dāng)前的研究熱點(diǎn)主要集中在激素對(duì)纖維的伸長(zhǎng)發(fā)育的促進(jìn)作用,如赤霉素、油菜素內(nèi)酯、乙烯等[1-2];此外,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多基因參與纖維細(xì)胞的快速伸長(zhǎng)發(fā)育,如與細(xì)胞骨架相關(guān)的 GhPFN1、GhACT1、GhTUB1,糖代謝相關(guān)的 GhSusy 等[3-6]?？箟难?ascorbate acid,AsA)是普遍存在于植物組織的一種十分重要的抗氧化小分子物質(zhì),在細(xì)胞分裂旺盛的組織中含量較高。不僅對(duì)于保持細(xì)胞的還原狀態(tài)有重要作用,還參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、分化、防衛(wèi)和其它的許多生理過(guò)程,并且與應(yīng)答脅迫條件的抗逆性密切相關(guān)[7]。目前,關(guān)于高等植物AsA功能和水平調(diào)控的生理機(jī)制及分子機(jī)制的研究,多集中于擬南芥、煙草等少數(shù)模式植物[8]。

脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR),是維持AsA濃度和保證細(xì)胞處于還原狀態(tài)的限速酶,對(duì)于控制細(xì)胞內(nèi)AsA的總量具有十分重要的作用。目前鮮有關(guān)于抗壞血酸與纖維伸長(zhǎng)發(fā)育的報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過(guò)克隆與抗壞血酸合成密切相關(guān)的脫氫抗壞血酸還原酶基因,構(gòu)建該基因的原核表達(dá)載體,并誘導(dǎo)表達(dá)獲得較高純度的蛋白,以期為進(jìn)一步分析該蛋白活性,解析抗壞血酸參與棉花纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制以及進(jìn)一步的基因工程改良棉花纖維品質(zhì)奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

陸地棉徐-142由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng);原核表達(dá)載體pET28a、大腸桿菌 DH5α、BL21由本實(shí)驗(yàn)室保存;凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取微量試劑盒購(gòu)自 TIANGEN公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamH I、Xhol I、T4連接酶購(gòu)自大連寶生物公司;親和層析柱購(gòu)自 GE公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 棉花葉片總RNA的提取

采用改良CTAB法[9]提取棉花葉片總RNA:1)稱取100 mg棉花幼嫩葉片,迅速放入液氮研磨呈粉末狀,轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管內(nèi),加入預(yù)熱65℃提取液 700μLβ-巰基乙醇,65℃溫浴并震蕩 20 min;2)加入等體積的氯仿∶異丙醇(24∶1)混勻,4℃12000 r/min離心10 min;3)吸上清裝入新的離心管里,加入1/4體積的10 mol/L LiCl混勻后,-20℃過(guò)夜沉淀;4)4℃12000 r/min離心15 min,棄上清液,75%乙醇洗滌;5)4℃12000 r/min離心10 min,棄上清,空氣干燥 10 min后加入 20μL DEPC水,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA及DHAR基因的PCR擴(kuò)增

DHAR的核酸序列通過(guò)比對(duì) Genebank中棉花纖維大量EST獲得,根據(jù)DHAR基因編碼序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的基因(包含BamH I和Xho I酶切位點(diǎn),下劃線所示),引物序列分別為:上游5′-GGATCCATGGCTTTGGAGATCTGTG-3′;下游 5′-CTCGAGTC ATGCATTCACCTTAGG-3′。參照 RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行棉花葉片總RNA的反轉(zhuǎn)錄,并以反轉(zhuǎn)錄的棉花葉片cDNA為模板,進(jìn)行PCR[10],擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 pET28a-DHAR原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將DHAR凝膠回收產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET28a分別用BamH I和 Xhol I進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠回收純化[11]。分別取回收后的目的片段及載體片段(目的片段∶載體片段=7∶1),16℃連接過(guò)夜,然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,均勻涂布于 Kan+抗性固體LB培養(yǎng)基,37℃溫箱過(guò)夜,挑取陽(yáng)性克隆,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 DHAR重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及 SDS-PAGE鑒定

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET28a-DHAR和空質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)化DE3感受態(tài)細(xì)胞,涂布 Kan+抗性固體LB培養(yǎng)基37℃溫箱過(guò)夜,分別挑取重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒的單克隆菌落接種于10 mL含 Kan+的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。各取上述過(guò)夜菌100μL轉(zhuǎn)接入10 mL含 Kan+的新鮮LB中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時(shí),各取1 mL菌液記為0 h(對(duì)照),然后加入 IPTG至終濃度為1 mmol/L,繼續(xù)振蕩培養(yǎng),分別取加入 IPTG后2、4、6 h菌液1 mL。將收取的菌液于5000 r/min離心10 min后收集沉淀,用100μL 0.01 mol/L冰 PBS混懸。各加入2×SDS上樣緩沖液100μL,煮沸5 min,12000 r/min離心 2 min,取上清15μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳(5%積層膠,12%分離膠)[12],凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.5 DH AR重組蛋白的純化及SDS-PAGE鑒定

分別接種2 mL重組菌和空載體菌的過(guò)夜菌液至200 mL含 Kan+的新鮮LB中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為 0.4～0.6時(shí),加入 IPTG至終濃度為 1 mmol/L,37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h,收集菌液4℃,5000 r/min離心10 min后收集沉淀,用10 mL 0.01 mol/L冰 PBS清洗1遍,加入4 mL Lysis Buffer(pH 8.0)震蕩混勻,反復(fù)凍融2次(-196 ℃凍、42 ℃融),冰浴超聲裂解。4℃,12000 r/min離心20 min,取上清用親和層析柱純化。取試驗(yàn)組純化產(chǎn)物10μL加入2×SDS上樣緩沖液10μL,煮沸5 min,12000 r/min離心2 min,取15μL SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠,12%分離膠)檢測(cè),凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花葉片總RNA的提取

用改良的CTAB法提取棉花葉片的總RNA,1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果顯示提取的總RNA呈現(xiàn)2條帶(圖1),RNA質(zhì)量良好。

圖1 棉花葉片RNAFig.1 Cotton leaf RNA extract

圖2 DHAR基因的克隆Fig.2 PCR amplification of DHAR gene

2.2 DHAR基因的克隆

以反轉(zhuǎn)錄的棉花葉片cDNA為模板,通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增DHAR基因,得到特異性片段,與預(yù)期的結(jié)果相符(圖2)。棉花 GhDHAR基因包含639個(gè)核苷酸對(duì),編碼213個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),理論分子量為23.4 kD。

2.3 重組原核表達(dá)載體pET28a-DHAR的構(gòu)建與鑒定

提取 pET28a-DHAR質(zhì)粒,利用 BamH I和Xhol I進(jìn)行雙酶切,結(jié)果可見(jiàn)2條DNA條帶,1條為載體片段,另1條為目的基因片段(圖3)。經(jīng)測(cè)序證實(shí)結(jié)果正確,表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3 pET28a-DHAR重組子的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pET28a-DHAR recombinant plasmid by Bam HI and XhdI

2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)純化及 SDSPAGE鑒定

分別用 IPTG對(duì)pET28a-DHAR重組載體和pET28a空載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),12%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)及純化蛋白(圖4),用親和層析柱純化(圖5)。結(jié)果顯示:在約 26 kD處得到與 His-DHAR融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相符的蛋白條帶。

圖4 重組GhDH AR蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE電泳分析Fig.4 Induced expression and SDS-PAGE analysis of recombinant GhDHAR protein

圖5 重組 GhDHAR蛋白的純化Fig.5 Purification of recombinant GhDHAR protein

3 討論

在植物細(xì)胞中存在一個(gè)重要的谷胱甘肽-抗壞血酸循環(huán),其作用是除去細(xì)胞中的活性氧[13]。這個(gè)循環(huán)由四種酶即抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHA)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)催化。DHAR基因的過(guò)量表達(dá)可以提高植物體內(nèi)還原性抗壞血酸的含量,使植物氧化還原系統(tǒng)功能明顯增強(qiáng)[14],并且可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)AsA的量參與細(xì)胞快速生長(zhǎng)[15]。此外,AsA與細(xì)胞的伸長(zhǎng)發(fā)育緊密相關(guān),可能通過(guò)誘導(dǎo)使ROS產(chǎn)生的分泌型過(guò)氧化物酶的表達(dá)、抑制使細(xì)胞壁變硬的酶的表達(dá)和參與細(xì)胞壁胞外多糖的切割,使細(xì)胞壁膨脹疏松參與細(xì)胞伸長(zhǎng)發(fā)育[16-18]。

本試驗(yàn)選用了pET28a原核表達(dá)載體,該載體帶有 His標(biāo)簽蛋白,融合蛋白產(chǎn)物可通過(guò)親和層析柱純化快速、簡(jiǎn)便的純化。本試驗(yàn)通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè),表達(dá)的融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為26 kD,其為His和DHAR基因相對(duì)分子質(zhì)量之和。結(jié)果表明pET28a-DHAR重組載體成功表達(dá)了 His-DHAR融合蛋白,并且還對(duì)該融合蛋白進(jìn)行了初步純化,為下一步繼續(xù)探討DHAR的生物學(xué)功能提供了必要條件,為基因工程改良棉花纖維品質(zhì)奠定了基礎(chǔ),也為解析纖維發(fā)育的分子機(jī)制提供了參考依據(jù)。

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Cloning,Prokaryotic Expression and Purification of a Cotton Dehydroascorbate Reductase Gene

LI Xuening1,DU Junwei2,LI Hongbin1
(1 College of Life Sciences/Key Laboratory of Agrobiotechnology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S513

A

1007-7383(2010)05-0542-04

2009-11-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30860031)

李學(xué)寧(1984-),男,碩士生,專業(yè)方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué);e-mail:lixuening2009@126.com。

李鴻彬(1980-),男,副教授,博士,從事植物分子生物學(xué)與基因工程研究;e-mail:lihb@shzu.edu.cn。