張 凡,佘躍惠,孔淑瓊,舒福昌,喻高明,侯讀杰

(1.中國地質(zhì)大學(xué)(北京)能源學(xué)院,北京100080;2.長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北荊州434023)

天然氣庫上方土壤微生物群落研究

張 凡1,佘躍惠2,孔淑瓊2,舒福昌2,喻高明2,侯讀杰1

(1.中國地質(zhì)大學(xué)(北京)能源學(xué)院,北京100080;2.長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北荊州434023)

通過基于16S rRNA基因克隆文庫的方法研究了天然氣庫上方土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)。針對大港油田板876氣庫上方同一取樣點1.0 m和2.0 m的土壤樣品構(gòu)建了16S rDNA克隆文庫DGS1和DGS2,并對其150個陽性克隆進行限制性酶切片段長度多樣性分析(ARDRA)。結(jié)果表明,克隆文庫DGS1有40個操作分類單元(OTU),克隆文庫DGS2有39個OTU,該天然氣庫上方土壤中微生物較豐富;但由于土壤深度的不同兩個土壤樣品微生物群落結(jié)構(gòu)存在著差異。每個OTU的代表克隆序列分析結(jié)果表明,克隆文庫DGS1中優(yōu)勢菌群為芽單胞菌(Gemmatimonadetes)28%、綠彎菌(Chlorof lexi)23%和放線菌(Actinobacterium)21%;克隆文庫DGS2菌群分布較平均,其中 Chlorof lexi19%、硫氧化菌(Sulfur-oxidizing)12%、酸酐菌(Acidobacteria)10%、Gemmatimonadetes10%。天然氣庫上方土壤微生物多樣性的分子分析可為開展微生物油氣勘探(MPOG)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

氣庫;16S rRNA基因;克隆文庫;微生物群落;微生物油氣勘探(MPOG)

基于16S rDNA分子生物學(xué)技術(shù)已被廣泛用于研究環(huán)境微生物群落多樣性?？寺『?6S rDNA序列分析能有效地確定研究區(qū)域中未被培養(yǎng)出來的微生物[1],能夠使人們更準確全面地認識特定生態(tài)系統(tǒng)中的微生物種群多樣性[2]。

基于16S rDNA的分子生物學(xué)方法已被用來研究森林、稻田、草原土壤和海湖沉積物中的微生物群落。對油田微生物群落的研究主要集中在油田產(chǎn)出油水樣、油田地層水樣中的微生物群落[3～5],而對于油氣田上方土壤中的微生物群落研究報道卻很少。采用微生物油氣勘探(MPOG)技術(shù)檢測土壤中烴氧化菌的異常,可以預(yù)測下伏油氣藏的存在[6,7]。

作者在此通過構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫分子,研究了大港油田板876氣庫上方土壤微生物群落結(jié)構(gòu),為詳細研究油藏生態(tài)系統(tǒng)中微生物種群組成及開展微生物油氣勘探(MPOG)技術(shù)提供了可靠數(shù)據(jù)。

1 實驗

1.1 取樣

樣品取自中石油大港油田(天津)板876氣庫上方土壤樣品。其地層剖面圖如圖1所示。

圖1 板876氣庫地層剖面Fig.1 G eological base of Ban876 gas reservoir

取樣點距注氣點板876井100 m。氣藏蓋層上部為沙一中、上段地層,全部為暗色泥巖,總厚度200 m左右,平面上,砂體呈席狀分布,氣藏主體部位滲透砂巖厚度 6～9 m?？紫抖?13.0%～24.4%,平均21.1%。滲透率21.0×10-3～398.0×10-3μm2,平均164.5×10-3μm2。氣層受構(gòu)造控制,氣水界面在2244 m處,含氣高度24 m,凝析油含量72.7 g·m-3。氣藏氣層平面上分布連片,連通性好,氣層有效厚度1.2～11.4 m,碾平厚度4.6 m,為構(gòu)造氣藏。天然氣相對密度為0.6264(設(shè)空氣的密度為1),其中甲烷含量為90%。

分別取取樣點的縱向剖面0.5 m、1.0 m、1.5 m、2.0 m以及2.5 m處的5個土壤樣品,立即送實驗室, 20℃保存。

1.2 土壤樣品處理以及DNA提取

將新鮮土壤樣品碾碎,充分混勻,分別稱取5個土壤樣品0.5 g各3份,按 Fast DNA Spin Kit for Soil (Qbiogen,Carlsbad,CA.U.S.A)試劑盒說明提取樣品總DNA。將每個樣品的3份DNA混合到一起用DNA濃度測定儀(Nanodrop?ND-1000 UV-Vis Spectrophoto-meter,Nanodrop Technologies)測定所提取的DNA濃度。

1.3 16S rRNA基因全長擴增

使用 16S rDNA片段擴增通用引物 27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′)和 1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)從基因組總DNA中擴增16S rDNA片段。PCR擴增體系及程序參見文獻[8]。

1.4 克隆文庫建立

用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Agarose gel DNA purification kit,TaKaRa Biotechnology,Dalian,China)對16S rDNA擴增產(chǎn)物進行割膠,純化。然后將回收產(chǎn)物16S rDNA片段p GEM T-easy克隆載體(Promega)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞 Escherichia coliJM109 Competentcells(TaKaRa Biotechnology,Dalian, China)中。從兩個文庫各挑取150個陽性克隆,挑取少量菌體作為模板,擴增每個克隆的16S rRNA基因。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶 HaeⅢ和 HhaⅠ進行酶切,再用2%瓊脂糖凝膠電泳分析限制性片段,然后對電泳圖譜進行限制性酶切片段長度多態(tài)性(ARDRA)分析。將兩種酶切圖譜相同的克隆歸為同一種發(fā)育類型,即同一種操作分類單元(OTU)。

1.5 克隆文庫庫容

應(yīng)用 Rarefaction分析軟件(http://www.uga. edu/strata/software/Software.html)對克隆文庫的庫容飽和度進行分析,以檢測建立的克隆文庫是否已經(jīng)足夠全面地代表了MOB群落的多樣性。

1.6 測序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

挑取ARDRA分型歸為一類的克隆接種于含有100μg·mL-1氨芐的液體LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)20 h后送往測序公司(諾賽基因,北京)。所得序列通過DNAMAN軟件進行處理,然后在National Center for Biotechnology(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/)數(shù)據(jù)庫中比對分析,尋找親緣關(guān)系最近的序列,用DNAMAN軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣庫上方土壤微生物群落

在氣庫上方1.0 m和2.0 m土壤樣品的16S rRNA基因克隆文庫DGS1和DGS2中各選擇了150個陽性克隆子,通過 HaeⅢ和 HhaⅠ雙酶切分型分別得到了40個和39個OTU。Rarefaction分析曲線(圖2)顯示當陽性克隆子達到150個時曲線趨于水平,說明克隆文庫能夠反映樣品微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖2 克隆文庫DGS1和DGS2 Rarefaction分析曲線Fig.2 Rarefaction analysis curves of clone libraries DGS1 and DGS2

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 3、圖4)可知,克隆文庫DGS1中優(yōu)勢菌群為單胞菌 (Gemmatimonadetes) 28%、綠彎菌(Chlorof lexi)23%和放線菌(Actinobacterium)21%;克隆文庫DGS2菌群分布較平均,其主要菌群有 Chlorof lexi19%、硫氧化菌(Sulfur-oxidizing)12%、酸酐菌(Acidobacteria)10%、Gemmatimonadetes10%。所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中對比分析,結(jié)果表明,大多數(shù)序列(＞80%)和GenBank中已有的16S rDNA序列同源性小于97%,說明該樣品微生物系統(tǒng)中微生物資源比較新穎,很多屬于新的種。

2.2 討論

應(yīng)用16S rRNA基因克隆建庫方法對天然氣庫上方土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進行了初步研究。兩土壤樣品微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異,但微生物種類數(shù)(OTUs)較為接近。以前關(guān)于油氣微生物勘探(MPOG)報道指出油氣田上方土壤中的烴氧化菌中甲烷氧化菌的數(shù)量較其它非油氣田上方多[9,10]。但是本研究中兩個氣庫上方土壤樣品克隆文庫中沒有發(fā)現(xiàn)烴氧化菌,證明烴氧化菌在氣庫上方土壤中并非以優(yōu)勢菌的地位存在。因此要了解油氣田與非油氣田上方土壤中烴氧化菌的差異,必須找到烴氧化菌的特異性引物,從而排除其它微生物的干擾。

大港油田地處渤海之濱是一片鹽堿地,土壤的平均p H值為7.5。兩個克隆文庫中的主要微生物種群為 Chlorof lexi、Gemmatimonadetes、A cidobacteria、 Actinobacterium。海洋沉積物以及鹽堿沼澤土壤微生物也包含這些微生物[11～13]。這一結(jié)果證明土壤中的微生物菌群主要是由土壤的地理位置以及土壤的理化性質(zhì)決定。不同油氣田由于其所屬地層的化學(xué)和物理條件不同,其土壤中所含的微生物差異較大。因此, MPOG工作必須開展中前期的土壤微生物調(diào)查。

圖3 16S rRNA基因克隆文庫DGS1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of sequences of the 16S rRNA gene of clone library DGS1

圖4 16S rRNA基因克隆文庫DGS2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of sequences of the 16S rRNA gene of clone library DGS2

3 結(jié)論

通過基于16S rRNA基因克隆文庫的方法研究了天然氣庫上方土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)。構(gòu)建了16S rDNA克隆文庫DGS1和DGS2,并對其150個陽性克隆進行限制性酶切片段長度多樣性分析(ARDRA)。結(jié)果表明,克隆文庫DGS1有40個操作分類單元(OTU),克隆文庫DGS2有39個OTU,克隆文庫DGS1中優(yōu)勢菌群為芽單胞菌(Gemmatimonadetes) 28%、綠彎菌(Chlorof lexi)23%和放線菌(Actinobacterium)21%;克隆文庫DGS2菌群分布較平均,其中有 Chlorof lexi19%、硫氧化菌 (Sulfur-oxidizing) 12%、酸酐菌(Acidobacteria)10%、Gemmatimonade-tes10%。天然氣庫上方土壤微生物多樣性的分子分析為開展微生物油氣勘探(MPOG)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

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Study on Microbial Community in Soil Above A G as Reservoir

ZHANG Fan1,SHE Yue-hui2,KONGShu-qiong2,SHU Fu-chang2,YU G ao-ming2,HOU Du-jie1
(1.School ofEnergy Resources,China University of Geosciences(Beijing),Beijing100083,China; 2.College of Chemistry and Environmental Engineering,Yangtze University,J ingzhou434023,China)

16S rRNA gene clone library construction was used to analyze the microbial communities of soil sampled from above a known Ban876 gas reservoir.Two clone libraries DGS1 and DGS2 were constructed. There were 150 clones from the two libraries respectively for amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA).40 Taxanomic operational units(OTUs)were found in library DGS1,and 39 OTUs were found in library DGS2.Sequence analysis of the representative clone of each OTU showed that dominant bacteria of the DGS1 were affiliated withGemmatimonadetes28%,Chlorof lexi23%,Actinobacterium21%;andChlorof lexi 19%,Sulfur-oxidizing 12%,Acidobacteria10%,Gemmatimonadetes10%for DGS2,which provides foundation for application of MPOG(Microbial prospecting of oil and gas).

gas reservoir;16S rRNA gene;clone library;microbial community;microbial prospecting of oil and gas(MPOG)

Q 939 Q 785

A

1672-5425(2010)06-0054-05

中石油集團公司中青年創(chuàng)新基金資助項目(07E1025)

2010-03-19

張凡(1980-),女,湖北咸寧人,博士研究生,研究方向:石油微生物學(xué);

侯讀杰,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail: bjbios001@126.com。