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        大米草多糖的提取及其單糖組成的GC-MS分析

        2010-10-23 03:02:18徐年軍何艷麗嚴(yán)小軍
        海洋科學(xué) 2010年9期
        關(guān)鍵詞:單糖半乳糖多糖

        徐年軍, 何艷麗, 武 敏, 嚴(yán)小軍

        (寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院, 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315211)

        大米草多糖的提取及其單糖組成的GC-MS分析

        徐年軍, 何艷麗, 武 敏, 嚴(yán)小軍

        (寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院, 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315211)

        分析了海洋灘涂生物大米草(Spartina anglica)中的多糖成分和單糖組成, 為這種生物資源的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。利用水提醇沉、Sevag法脫蛋白得到純大米草多糖, 經(jīng)三氟乙酸降解、糖腈乙酸酯衍生,最后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)分析大米草多糖中的單糖組成。結(jié)果表明大米草單糖組成為鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖, 其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是: 4.13%, 3.02%, 11.94%, 8.89%,6.82%, 27.18%, 38.00%。大米草多糖是一種可利用的食品資源, 其主要成分半乳糖、葡萄糖都是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的單糖, 大米草多糖可深入研究開(kāi)發(fā)其生物活性用作保健食品。

        大米草(Spartina anglica); 多糖; 單糖組成; GC-MS分析

        大米草(Spartina anglica)是一種具有生態(tài)影響的海洋灘涂植物, 目前對(duì)我國(guó)沿海生態(tài)和生物多樣性、灘涂養(yǎng)殖等造成了較大的負(fù)面影響。但大米草是一種具有頑強(qiáng)生命力的植物, 其有效的控制和生態(tài)防除是一個(gè)世界性的難題[1]。同時(shí)大米草在沿海灘涂防風(fēng)護(hù)堤、促淤造田等方面也具有一定的正面生態(tài)效應(yīng)[2]。在這種情況下, 對(duì)大米草生物資源的開(kāi)發(fā)利用是一種最佳的選擇[3]。

        大米草生物量大、用途很多, 大米草多糖和黃酮類活性物質(zhì)可用作保健食品。關(guān)于大米草多糖的新聞報(bào)道很多, 主要涉及多糖的提取等, 如上海壽琪多糖食品研究所與福州中衛(wèi)多糖科技公司合作進(jìn)行了大米草多糖的提取并申請(qǐng)了相關(guān)的專利。但大米草生物活性物質(zhì)的研究報(bào)道很少, 大米草多糖理化性質(zhì)及單糖組成分析方面的研究未見(jiàn)報(bào)道[4]。作者首次研究了大米草多糖的單糖成分分析, 為大米草多糖的開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        新鮮大米草(Spartina anglica)于2005年4月采于浙江象山縣鶴浦沿海灘涂。大米草洗凈后去除根部,將莖葉剪碎后備用。

        1.2 儀器和試劑

        單糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich公司, 本實(shí)驗(yàn)中所用的主要有赤蘚糖(erythrose)、鼠李糖(rhamnose)、核糖(ribose)、阿拉伯糖(arabinose)、巖藻糖(fucose)、木糖(xylopyranose)、甘露糖(mannose)、葡萄糖(glucose)、半乳糖(lactose)和肌醇(inositol)。試劑盒 HMDS(Hexamethyldisilazane, 六甲基二硅胺烷)+TMCS, 3:1(Sylon HT)購(gòu)自美國(guó) Supelco 公司, 其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。主要分析儀器有島津公司的氣相色譜-質(zhì)譜儀(Shimadzu QP2010 GC-MS), Supelco 公司生產(chǎn)的30 m×0.25 mm×0.25 μm SPB-50色譜柱; Thermo公司的Multiskan MK3型酶標(biāo)儀等。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 大米草多糖的提取純化

        新鮮大米草樣品40 g于60oC烘干12 h, 液氮冷凍后碾碎, 于90oC恒溫水浴浸提5 h, 過(guò)濾, 濾渣重復(fù)提取2次, 合并提取液, 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100 mL。加入乙醇于冰箱中過(guò)夜沉淀, 沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次, 60 mL水溶解。按Sevag法[5]除蛋白質(zhì), 透析除去雜質(zhì)。加適量蒸餾水溶解, 冷凍干燥, 得大米草多糖共64 mg。

        1.3.2 大米草多糖的進(jìn)一步純化

        將得到的大米草多糖樣品進(jìn)行 Sephadex DEAE A50凝膠柱層析(2.2 cm×20 cm), 蒸餾水和1 mol/L NaCl恒速洗脫, 等體積自動(dòng)接收, 硫酸苯酚法[6]檢測(cè)洗脫樣品中的總糖含量, 繪制洗脫曲線, 根據(jù)洗脫樣品峰截取第8~18管(每管4 mL, SPI), SPI為大米草多糖主要組分, 為均一多糖。

        1.3.3 多糖降解時(shí)間的確定

        在4個(gè)反應(yīng)瓶中各自加入15 μL的2 g/L的大米草多糖溶液, 氮?dú)獯蹈珊蠓謩e加入1 mL的2 mol/mL的三氟乙酸, 120oC分別油浴45、60、75、90 min, 獲得4個(gè)降解單糖樣品, 加入甲醇1 mL(3次), 減壓蒸餾徹底去除三氟乙酸。

        1.3.4 醛糖衍生化

        單糖標(biāo)準(zhǔn)品和降解單糖樣品分別加入10 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶, 密封條件下在90oC加熱反應(yīng)30 min生成糖肟, 加入1:1的醋酸酐后90oC油浴30 min生成具有揮發(fā)性的糖腈乙酸酯衍生物, 氮?dú)獯蹈珊笥枚燃淄槎ㄈ? GC-MS進(jìn)樣分析。每個(gè)樣品作3個(gè)平行樣。

        1.3.5 酮糖衍生化

        酮糖衍生化直接用試劑盒, 待測(cè)樣品加入六甲基二硅胺烷(HMDS)80oC油浴60 min后生成可揮發(fā)的衍生物, 氮?dú)獯蹈珊笳和槎ㄈ? 直接進(jìn)行GC-MS分析。每個(gè)樣品作3個(gè)平行樣分析。

        1.3.6 GC-MS檢測(cè)條件

        主要實(shí)驗(yàn)條件參照Ye等[7]。GC條件: 進(jìn)樣口溫度為250, ℃載氣為99.99%的高純氦, 柱流速1 mL/min, 初始柱前壓26.3 kPa, 柱起始溫度100, ℃保持3.5 min, 以15/min℃升至160, ℃保持20 min,再以15/min℃升至200, ℃保持15 min, 再以20/min℃升至280, ℃保持5 min。分流進(jìn)樣, 分流比為9.6。

        MS條件: 用電子轟擊(Electron Impact, EI)源分析, 電子能量為70 eV, 離子源溫度200, ℃接口溫度250℃。選取全程離子碎片掃描(SCAN)模式時(shí), 質(zhì)量掃描范圍為50~600, 溶劑延遲3.5 min。選取特征離子碎片掃描(SIM)模式時(shí), 醛糖選用145 m/z、酮糖選用217 m/z為定量時(shí)的目標(biāo)離子, 另選兩個(gè)離子作為定性時(shí)的參考離子。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 大米草多糖的提取率

        本實(shí)驗(yàn)為了保證提取樣品的純度, 提取率不是很高, 僅為0.16%。提取過(guò)程中的主要損失步驟包括酒精沉淀、有機(jī)溶劑去蛋白、乙醇洗滌及層析柱純化等。不同的提取方法, 特別是多糖提取過(guò)程中的脫蛋白的方法很多, Sevag法是比較經(jīng)典的方法, 目前已經(jīng)廣泛用于生物樣品中糖復(fù)合物的提純及提取過(guò)程中蛋白質(zhì)的去除[6]。

        大米草多糖的提取未見(jiàn)有專業(yè)文獻(xiàn)報(bào)道。新聞報(bào)道中只提到雙酶水解法和超低溫冷凍干燥技術(shù)獲得大米草多糖, 但具體的提取方法未見(jiàn)報(bào)道。相關(guān)的專利中大米草多糖的提純方法(申請(qǐng)?zhí)枺?00410069331.7)主要采用浸泡、酶解法獲得大米草多糖, 采用超濾膜分離技術(shù)將大米草濃縮液過(guò)濾,從而使大米草多糖的純度提高了 60%以上, 沒(méi)有對(duì)大米草多糖進(jìn)行進(jìn)一步純化, 沒(méi)有獲得提取率等參數(shù)。

        本文采用的提取方法具有較好的重復(fù)性, 特別是提取的純度高, 可用于進(jìn)行單糖組成分析和結(jié)構(gòu)分析, 在隨后的實(shí)驗(yàn)中也采用這種提取方法, 均獲得了較滿意的結(jié)果。

        2.2 大米草多糖的純度測(cè)定

        大米草多糖用 Sephadex G-100柱層析法檢測(cè),得到了一個(gè)主要的洗脫峰, 根據(jù)其對(duì)稱性特點(diǎn)判斷其為均一多糖。紫外分光光度法檢測(cè)表明大米草多糖無(wú)蛋白質(zhì)存在。

        2.3 大米草多糖酸降解時(shí)間的確定

        在運(yùn)用三氟乙酸對(duì)大米草多糖進(jìn)行降解時(shí), 研究了不同時(shí)間梯度下(45, 60, 75, 90 min)所獲得的大米草單糖組成差異, 結(jié)果其組成和含量無(wú)顯著差異(P<0.05), 本文取含量相對(duì)較高的 60 min作為最佳降解時(shí)間。

        2.4 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS色譜分析

        由于酮糖分析中未檢測(cè)到酮糖, 本文僅列出 10種醛糖的檢測(cè)及其定量結(jié)果。

        圖 1為用 SIM 模式檢測(cè)得到的 10種醛糖的GC-MS色譜圖, 圖示了10種單糖的出峰時(shí)間, 其中1為赤蘚糖, 2為鼠李糖, 3為核糖, 4為阿拉伯糖, 5為巖藻糖, 6為木糖, 7為甘露糖, 8為葡萄糖, 9為半乳糖, 10為肌醇,其出峰時(shí)間分別是15.47, 30.77, 30.99 , 31.77 ,31.88 , 32.67, 43.61, 44.96, 46.01, 48.22 min。根據(jù)其質(zhì)譜裂解峰分別對(duì)其對(duì)應(yīng)的峰進(jìn)行了確認(rèn)。

        2.5 大米草單糖的GC-MS色譜分析

        運(yùn)用同樣的方法對(duì)大米草多糖進(jìn)行單糖組成分析(圖2)。結(jié)果運(yùn)用GC-MS分析方法, 從大米草單糖中共檢測(cè)出7個(gè)明顯的波峰, 根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜(圖1)的出峰時(shí)間對(duì)比, 以及對(duì)該峰的質(zhì)譜鑒定, 可判斷出大米草單糖組成為鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。根據(jù)各峰面積比計(jì)算其相對(duì)百分含量, 分別為 4.13%, 3.02%, 11.94%,8.89%, 6.82%, 27.18%, 38.00%。

        結(jié)果表明大米草多糖的單糖成分中主要是半乳糖(38.00%), 葡萄糖(27.18%)和阿拉伯糖(11.94%),共占單糖總量的77.12%。而這3種糖都是人類食品中主要的單糖成分, 表明大米草多糖是一種很好的多糖資源, 可用于開(kāi)發(fā)相關(guān)的保健食品或藥品。

        圖1 標(biāo)準(zhǔn)單糖的GC-MS色譜圖Fig. 1 GC-MS chromatogram of standard monosaccharides

        圖2 大米草單糖的GC-MS色譜圖Fig. 2 GC-MS chromatogram of the monosaccharides from Spartina anglicaa.赤蘚糖, b.鼠李糖, c.核糖, d.阿拉伯糖, e.木糖, f.甘露糖, g.葡萄糖, h.半乳糖, i.肌醇a. Erythrose, b. Rhamnose, c. Ribose, d. Arabinose, e.Xylopyranose, f. Mannose, g. Glucose, h. Lactose, i. inositol

        2.6 GC-MS進(jìn)行單糖分析的優(yōu)點(diǎn)

        目前對(duì)多糖的單糖組成分析主要用氣相色譜法(GC)[8]、高效液相色譜(HPLC)[9]或者高效毛細(xì)管電泳(HPCE)分析。一般認(rèn)為, GC、HPLC、HPCE在定量方面具有一定的優(yōu)勢(shì), 但在定性方面卻存在不足:?jiǎn)渭円揽繒r(shí)間定性不夠準(zhǔn)確, 特別是有雜質(zhì)峰干擾的情況下, 無(wú)法準(zhǔn)確判斷色譜圖中的峰是屬于樣品峰, 還是屬于雜質(zhì)峰。相對(duì) GC-MS, 氣相色譜所獲得的色譜峰缺乏選擇性, 雜質(zhì)峰混在樣品峰中勢(shì)必帶來(lái)峰面積的增加, 樣品處理過(guò)程中的雜質(zhì)也容易引起積分面積的變化, 給樣品制備和定量帶來(lái)了一定的困難。GC-MS在單糖組成的定性方面具有特效、快速的特點(diǎn), 依靠其 FID圖譜的峰面積定量具有和直接用GC的色譜圖同樣的效果[10,11]。

        2.7 大米草多糖成分分析的意義

        大米草是一種具有負(fù)生態(tài)效應(yīng)的海洋灘涂生物,對(duì)其開(kāi)發(fā)利用具有很重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)生態(tài)意義,許多報(bào)紙上都介紹了上海壽琪多糖食品有限公司在大米草多糖提取上的成功事例。但到現(xiàn)在為止, 該技術(shù)還未見(jiàn)有新的進(jìn)展, 主要因?yàn)榇竺撞荻嗵蔷烤褂惺裁礃拥纳锘钚赃€不是很清楚, 相關(guān)的應(yīng)用性基礎(chǔ)研究還有很多工作有待完成。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)大米草多糖進(jìn)行了一年多的研究, 發(fā)現(xiàn)了大米草多糖降解產(chǎn)物對(duì)羥基自由基具有較強(qiáng)的清除活性, 對(duì)α-葡萄糖苷酶也具有一定的抑制活性(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。而對(duì)大米草多糖的組成分析是深入了解大米草多糖的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成的必要步驟。接下來(lái)的工作我們準(zhǔn)備用不同方法降解大米草多糖, 研究其降解產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系, 為大米草開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

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        Extraction of polysaccharides from Spartina anglica and analysis of the monosaccharide composition by gas chromatography-mass spectrometry

        XU Nian-jun, HE Yan-li, WU Min, YAN Xiao-jun
        (Applied Marine Biotechnology Key Laboratory of the Ministry of Education, College of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

        Mar., 9, 2010

        Spartina anglica; polysaccharides; monosaccharide composition; GC-MS

        To study the polysaccharides and analysis their monosaccharide compositions of the Spartina anglica, purified polysaccharides were obtained by hot water extraction, ethanol precipitation, and de-protein by Sevag method. The polysaccharides were hydrolyzed to monosaccharides by 2 mol/mL trifluoroacetic acid in 120℃ oil-bath for 1h. The derived monosaccharides were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The S. anglica polysaccharides consisted of rhamnose, ribose, arabinose, xylopyranose, mannose, glucose, lactose, with their relative percentages being 4.13%, 3.02%, 11.94%, 8.89%, 6.82%, 27.18%, and 38.00%, respectively. It is predicted that the polysaccharides of the S. anglca are a potential food resource, with the main monosaccharides, i.e. lactose and glucose, being of very high nutritional value. Further study for their applications in functional foods is warranted.

        Q539

        A

        1000-3096(2010)09-0015-04

        2010-03-09;

        2010-04-23

        浙江省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(2005B149); 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y507263); 浙江省錢(qián)江人才計(jì)劃項(xiàng)目(2007R10038); 寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2007A610071)

        徐年軍(1973-), 男, 湖北赤壁人, 博士, 研究員, 主要從事海洋生物活性物質(zhì)研究,電話: 0574-87600458, E-mail: xunianjun@nbu.edu.cn

        (本文編輯: 張培新)

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