米 璇, 朱若華

(首都師范大學(xué)化學(xué)系,北京100048)

毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法分離測定中藥半枝蓮中的7種有效成分

米 璇, 朱若華＊

(首都師范大學(xué)化學(xué)系,北京100048)

建立了毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜同時(shí)分析檢測中藥半枝蓮藥材及其膏劑中黃芩素、柚皮素、漢黃芩素、野黃芩苷、芹菜素、木犀草素和原兒茶酸7種有效成分的方法。半枝蓮樣品中7種有效成分經(jīng)甲醇超聲提取。實(shí)驗(yàn)考察了運(yùn)行緩沖溶液的pH值和濃度、添加劑、檢測波長、分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間等重要參數(shù)對目標(biāo)物分離的影響。得到的優(yōu)化條件為:運(yùn)行緩沖液50mmol/L硼砂-0.20mol/L硼酸溶液(pH8.4),含8.5mmol/L十二烷基硫酸鈉(SDS),分離電壓25kV,檢測波長260nm和335nm。在此條件下,7種組分于12m in內(nèi)達(dá)到基線分離。各組分在8×10-6～3.2×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996 5～0.999 9;檢出限為7.0×10-8～2.0×10-6mol/L;回收率均大于85%。該方法提取簡便、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、靈敏度高,可以用于中藥半枝蓮中7種有效成分的定量檢測。

膠束電動(dòng)色譜;半枝蓮;有效成分;中草藥

Abstract:A method of capillary micellar electrokinetic chromatography with a diode array detector was developed for the simultaneous determ ination of7active ingredients(baicalein,naringenin,wogonin,scutellarin,apigenin,luteolin,and protocatechuic acid)in Scutella riabarbata D.D on and its ointment.The7ingredients in samples were extracted with m ethanol in an ultrasonic bath.The important factors,such as pH,running buffer concentration,additive,detection wavelength,separation voltage and injection time,were optimized.Under the optimum conditions,the7 analytes were separated within12m in at a separation voltage of25kV in a50 mmol/L borate-0.20mol/L boric acid buffer(pH8.4)containing8.5mmol/L sodium dodecyl sulfate(SDS).The detection was carried out at260nm and335nm.N otably,the linearity ranged from8×10-6to3.2×10-4mol/L with the correlation coefficients(r2)at the range of 0.996 5-0.999 9.The detection limits(S/N=3)ranged from7.0×10-8mol/L to2.0×10-6mol/L for all the7analytes.The recoveries of the7active ingredients were all over85%.This method is of good sensitivity,simple preparation,good rep roducibility and reliability.It was successfully applied to the analysis of the7active ingredients in Scutella riabarbata D.D on and its ointment.

Key words:micellar electrokinetic chromatography(M EKC);Scutella riabarbata D.D on;active ingredients;Chinese medicinal herb

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物Scu tella ria ba rba ta D.D on的干燥全草[1],別名通經(jīng)草、紫連草、并頭草、牙刷草、小韓信草等。其性辛、苦、寒,入肺、肝、腎,具有清熱解毒、化淤利尿的功效,用于治療疔瘡腫毒、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌撲腫痛、水腫、黃疸等[2]。半枝蓮作為臨床常用中藥,廣泛應(yīng)用于抗炎、抗癌等方面,是近年來國內(nèi)外抗腫瘤中藥的研究熱點(diǎn)之一。但是對于其藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ),特別是關(guān)于抗腫瘤作用的有效成分及其機(jī)制的研究并不深入。這些原因使得半枝蓮多以草藥煎劑出現(xiàn),并未開發(fā)出療效明確的單體成分劑型。因此,系統(tǒng)研究半枝蓮的化學(xué)有效成分,從而尋找其抗癌活性物質(zhì)具有很大的意義。

半枝蓮中主要含有各種黃酮類化合物(如野黃芩苷等)、芳香酸類成分(如原兒茶酸)及多種萜類、脂肪族化合物和多糖類成分[3]。研究表明,半枝蓮中黃酮類化合物如野黃芩苷、漢黃芩素、黃芩苷和黃芩素有明顯的抗炎解熱活性[4];木犀草素、芹菜素、漢黃芩素、柚皮素抗腫瘤活性顯著[5]。除了黃酮類化合物外,有機(jī)酸類化合物(如原兒茶酸)顯著抑菌,并有收斂和促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇抗癌、抗炎的7種有效成分黃芩素(baicalein)、柚皮素(naringenin)、漢黃芩素(w ogonin)、野黃芩苷(scutellarin)、芹菜素(ap igenin)、木犀草素(luteolin)和原兒茶酸(p rotocatechuic acid)進(jìn)行分析研究(見圖1)。此類成分的測定方法有薄層色譜法[6]、紫外-分光光度法[7]、氣相色譜法[8]、高效液相色譜法[9,10],但這些方法分析時(shí)間長、成本高、樣品處理較繁瑣。毛細(xì)管電泳法具有高效、快速、樣品用量少、容易清洗等優(yōu)點(diǎn),在中藥有效成分分析中已得到了廣泛的應(yīng)用[11-13]。半枝蓮中野黃芩苷的測定雖已有毛細(xì)管電泳法的報(bào)道[14],但未見毛細(xì)管電泳法同時(shí)測定半枝蓮中7種有效成分的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜-二極管陣列檢測法對半枝蓮藥材中7種有效成分進(jìn)行分離測定,分離效果好,方法可靠、簡便。

圖1 半枝蓮中7種有效抗癌成分的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of seven anticancer active ingredients in Scutella riabarbata D.D on

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Beckman Coulter P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀(美國Beckm an公司),配有二極管陣列檢測器(DAD);未涂層熔融石英毛細(xì)管(60cm×75μm,有效長度50cm)(河北永年銳灃色譜器件公司);XK962B型快速混勻器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司);KQ-250B超聲波提取器(昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)。

黃芩素、漢黃芩素、野黃芩苷、芹菜素、原兒茶酸對照品、半枝蓮藥材(中國藥品生物制品檢定所);柚皮素、木犀草素對照品(上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心);半枝蓮膏劑(首都師范大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室);十二烷基硫酸鈉(SDS)、硼砂、硼酸、甲醇等試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 溶液的配制

對照品溶液:精密稱取黃芩素、柚皮素、木犀草素對照品0.8m g,漢黃芩素、芹菜素對照品0.9 m g,野黃芩苷對照品1.4m g和原兒茶酸對照品0.5m g,分別加1.0mL甲醇溶解、混勻,配制成3 mmol/L的7種對照品儲(chǔ)備液,于-20℃冰箱內(nèi)避光保存。實(shí)驗(yàn)中根據(jù)需要稀釋取用。

半枝蓮樣品溶液:精密稱取半枝蓮藥材粉末0.250 0g,置于具塞錐形瓶中,加甲醇10mL超聲提取4h,提取完畢后低溫離心10m in后取出上清液,添加甲醇定容于10.0mL棕色容量瓶中,過0.22μm微孔濾膜后即得半枝蓮供試品溶液。

半枝蓮膏劑溶液:精密稱取半枝蓮膏劑0.001 0 g,加入1.0mL甲醇超聲提取4h,然后低溫離心10 m in后取出上清液,添加甲醇定容1.0mL,過0.22 μm微孔濾膜后即得半枝蓮膏劑供試品溶液。

1.3 電泳操作條件

分離運(yùn)行緩沖液為50mmol/L硼砂-0.20 mol/L硼酸溶液(pH8.4),含8.5mmol/L SDS,分離溫度25℃,分離電壓25kV,進(jìn)樣壓力3.45kPa(0.5psi),進(jìn)樣時(shí)間5s,檢測波長260nm和335 nm,電流65μA。每進(jìn)樣4次后更換緩沖溶液。每次進(jìn)樣前分別用0.10mol/L N aOH溶液、二次水和運(yùn)行緩沖液依次沖洗1,1和3m in。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細(xì)管電泳條件的優(yōu)化

2.1.1 緩沖溶液及其pH的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了N a2B4O7-HAc,N a2B4O7-N aOH,N a2B4O7-H3BO3等幾種分離介質(zhì)不同配比和濃度對分離的影響,結(jié)果顯示,使用N a2B4O7-H3BO3緩沖液基線平穩(wěn)、噪聲較小、信號靈敏且峰形較好,因此選擇其作為緩沖體系。

進(jìn)一步考察了pH7.0～9.5范圍內(nèi)的N a2B4O7-H3BO3緩沖液對分離的影響,結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著緩沖液pH值的增大,遷移時(shí)間有所增加,同時(shí)分離度也增大。pH8.4時(shí),分離度達(dá)到最大。隨著pH繼續(xù)升高,峰形變差,峰展寬嚴(yán)重,7種組分達(dá)不到完全分離。因此本實(shí)驗(yàn)選擇緩沖溶液的pH為8.4。

圖2 緩沖溶液pH對遷移時(shí)間的影響Fig.2 Effect of buffer pH on the migration time

2.1.2 緩沖液濃度的選擇

考察了pH8.4的N a2B4O7-H3BO3緩沖溶液中硼砂濃度在30～80mmol/L范圍內(nèi)對電泳的影響,結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著硼砂濃度的增大,遷移時(shí)間和分離度增大,當(dāng)硼砂濃度高于50 mmol/L時(shí),電流的升高使焦耳熱明顯增大,區(qū)帶展寬嚴(yán)重,噪聲增加。綜合考慮各方面的因素,本實(shí)驗(yàn)選擇50mmol/L N a2B4O7-0.20mol/L H3BO3作為最佳電泳介質(zhì)。

圖3 硼砂濃度對遷移時(shí)間的影響Fig.3 Effect of borate concentrationon the migration time

2.1.3 添加劑的選擇

圖4 SDS濃度對遷移時(shí)間的影響Fig.4 Effect of SDS concentration on the migration times

添加表面活性劑SDS,考察SDS濃度在5～45 mmol/L范圍內(nèi)對分離度的影響,結(jié)果如圖4所示。當(dāng)運(yùn)行緩沖液中不含SDS時(shí),黃芩素和漢黃芩素?zé)o法分離;加入SDS,漢黃芩素和芹菜素的遷移時(shí)間明顯后移,且兩組分得到有效分離。實(shí)驗(yàn)表明,使用膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜,在緩沖溶液中添加8.5mmol/L或40mmol/L SDS均可達(dá)到7種成分基線分離,但加入40mmol/L SDS分離半枝蓮樣品時(shí),在目標(biāo)組分出峰時(shí)間處有其他組分干擾,影響對目標(biāo)組分的分析,故本實(shí)驗(yàn)選擇添加8.5mmol/L SDS。

實(shí)驗(yàn)還比較了添加乙醇、乙腈和甲醇等有機(jī)添加劑對分離的影響。結(jié)果顯示,有機(jī)添加劑對本實(shí)驗(yàn)中7種目標(biāo)組分的分離效果不明顯且延長了遷移時(shí)間,故本實(shí)驗(yàn)不添加有機(jī)添加劑。

2.1.4 檢測波長、分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間的選擇

綜合7種有效成分的最大吸收波長,本實(shí)驗(yàn)選擇在260nm波長下檢測黃芩素、漢黃芩素、芹菜素、木犀草素和原兒茶酸,在335nm波長下檢測柚皮素和野黃芩苷。

隨著操作電壓的增加,電滲流和電泳流速的絕對值都增加,遷移時(shí)間縮短;但在過高的電壓下,柱內(nèi)焦耳熱增加,柱效和分離度反而降低。在16～27 kV范圍內(nèi)研究了工作電壓對7種組分分離的影響,結(jié)果表明,隨著電壓的升高,分析物的遷移時(shí)間明顯減短,但當(dāng)分離電壓超過25kV時(shí),焦耳熱增大,噪聲增大明顯,分離度降低。在工作電壓小于或等于25kV時(shí),對照品和實(shí)際樣品中7種組分都能夠?qū)崿F(xiàn)有效分離。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)選擇25kV分離電壓。

本實(shí)驗(yàn)采用壓力進(jìn)樣,考察了在3.45kPa下進(jìn)樣時(shí)間為3～10s對分離的影響。結(jié)果表明,目標(biāo)物的峰高隨著進(jìn)樣時(shí)間的延長而增加,當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間大于5s時(shí),峰高增幅下降,峰展寬嚴(yán)重。因此本實(shí)驗(yàn)選擇進(jìn)樣時(shí)間為5s。在優(yōu)化的CE條件下,7種有效成分對照品的色譜圖見圖5。

2.2 樣品提取方法的選擇

半枝蓮中7種有效組分的常用提取方法有索氏提取法[15]、超聲提取法[16]和回流法。本實(shí)驗(yàn)考察了使用索氏提取法和超聲提取法的提取效果。其中索氏提取法分為兩種方式,一種方式為使用石油醚先行脫脂,至無色后棄去醚液,繼續(xù)使用甲醇提取揮干后的藥渣;另一種方式為直接使用甲醇索氏提取至提取液無色;之后均濃縮、過濾、定容。結(jié)果顯示前者的提取效果優(yōu)于后者。但采用索氏提取法耗時(shí)、耗溶劑,且需濃縮,步驟繁瑣。而使用超聲提取法簡便快捷,且超聲波的強(qiáng)烈振動(dòng)、擊碎作用可將樣品打成極細(xì)小的微粒,均勻地分散于溶劑中,使提取效率較高,因此本實(shí)驗(yàn)最終選用超聲提取法。還考察了不同的提取時(shí)間對7種組分提取效率的影響。結(jié)果顯示,隨著提取時(shí)間的增長,提取率增大,但當(dāng)提取時(shí)間超過4h后,提取率增大不明顯,故本實(shí)驗(yàn)選擇4h為最佳提取時(shí)間。

圖5 7種有效成分對照品在優(yōu)化條件下的CE譜圖Fig.5 CE e lectrophe rogram of7an ticance r active ingredien t con tro ls(4mm o l/L)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍和檢出限

分別準(zhǔn)確配制0.3,0.7,3,8,40,80,160,320μmol/L的7種有效組分對照品溶液,在最佳條件下進(jìn)樣測定,每個(gè)濃度測定3次。以峰面積y對樣品濃度x進(jìn)行線性回歸,結(jié)果表明各組分在一定的濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好?；貧w方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)以及檢出限(S/N=3)見表1。

表1 7種有效成分的線性關(guān)系和檢出限(S/N=3)Tab le1 L inea r relationships and detection limits(S/N=3)of7active ingredients

2.3.2 實(shí)際樣品及加標(biāo)回收率的測定

稱取半枝蓮藥材粉末和半枝蓮膏劑,分別加入12,8和4μmol/L水平的7種有效組分對照品,按1.2節(jié)方法制備供試品溶液,根據(jù)樣品加標(biāo)后峰高增高定性,外標(biāo)法定量,進(jìn)行樣品測定和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。樣品和樣品加標(biāo)的毛細(xì)管電泳譜圖如圖6所示,半枝蓮藥材和半枝蓮膏劑中7種有效成分的回收率及含量分別見表2和表3。因半枝蓮膏劑經(jīng)過專門提取制備,故其中7種有效成分的含量均高于其在半枝蓮初提物中的含量;實(shí)驗(yàn)測得半枝蓮膏劑中總黃酮和野黃芩苷含量同首都師范大學(xué)中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室使用紫外-可見分光光度計(jì)(總黃酮)和高效液相色譜(野黃芩苷)所測結(jié)果相比較,含量基本一致。實(shí)驗(yàn)獲得良好的回收率,表明方法準(zhǔn)確、可靠。

圖6 (a)半枝蓮藥材樣品及(b)加標(biāo)5μm o l/L的半枝蓮樣品的C E譜圖Fig.6 Electropherograms of(a)Scutella riabarbata D.Don sample and(b)Scutella riabarbata D.D on sample sp iked with5μm o l/L for each con trol

表2 實(shí)際樣品中7種有效組分的加標(biāo)回收率和方法的精密度(n=6)Tab le2 Recoveries and precisions of7active ingredients in real samples(n=6)%

表3 實(shí)際樣品中7種有效成分的含量Table3 Con ten ts of7active ingredien ts in rea l samp lesm g/g

3 結(jié)論

本文采用超聲波提取,毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜-二極管陣列檢測法同時(shí)分析檢測半枝蓮藥材及其膏劑中黃芩素、柚皮素、漢黃芩素、野黃芩苷、芹菜素、木犀草素和原兒茶酸7種有效抗癌成分。方法的提取步驟簡單、效率高,回收率穩(wěn)定;靈敏度較高,結(jié)果重現(xiàn)性良好,可用于中藥半枝蓮中有效成分的研究。

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Simultaneous determination of7active ingredients in Scuellaria barbata D.D on by capillary micellar electrokinetic chromatography

MI Xuan,ZHU Ruohua＊
(Department of Chemistry,Capita l Normal University,Beijing 100048,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0209-06

＊通訊聯(lián)系人:朱若華,教授,主要從事藥物分析工作.Tel:(010)68903047,E-m ail:zhurh@m ail.cnu.edu.cn.

國家自然科學(xué)基金資助課題(No.20875065)和北京市教委資助項(xiàng)目(No.K M200610028007).

2009-07-30

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00209