謝沙潔, 王方軍, 晏 丹, 周廣東, 葉明亮, 鄒漢法＊

(1.中國科學院大連化學物理研究所,中國科學院分離分析化學重點實驗室,國家色譜研究分析中心,遼寧大連116023;2.組織工程國家工程研究中心,上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整形外科,上海200011)

毛細管整體柱在線二維分離系統(tǒng)應用于人體軟骨的蛋白質(zhì)組分析

謝沙潔1, 王方軍1, 晏 丹2, 周廣東2, 葉明亮1, 鄒漢法1＊

(1.中國科學院大連化學物理研究所,中國科學院分離分析化學重點實驗室,國家色譜研究分析中心,遼寧大連116023;2.組織工程國家工程研究中心,上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整形外科,上海200011)

將已建立的7cm柱長的磷酸基團強陽離子交換富集整體柱與85cm柱長的C12烷基反相整體柱結合的在線二維分離平臺應用于軟骨提取蛋白的蛋白質(zhì)組分析。對20μg軟骨提取蛋白的酶解產(chǎn)物進行14個鹽梯度的分級,然后對14個餾分進行反相色譜梯度分離及串聯(lián)質(zhì)譜鑒定,成功地鑒定得到了7 434個獨立肽段對應的1 901個非冗余蛋白質(zhì)。對所鑒定到的蛋白質(zhì)進行定位分類,結果表明鑒定到的大部分蛋白質(zhì)是來自于軟骨細胞內(nèi)部的低豐度蛋白質(zhì),這對于許多關節(jié)類疾病的研究有重要意義。

整體柱;在線二維分離;蛋白質(zhì)組學;軟骨組織

Abstract:In Shotgun proteome analysis,where nano-flow is adopted to increase the sensitivity as w ell as extrem ely com p licated samples such as proteolytic digest are inevitably confronted,monolithic capillary columns are widely used to improve the liquid Chromatography separation performance.It is known that cartilage contains extensive amounts of extracellular matrix(ECM),in which collagens and aggrecans being the most abundant macromolecules.It is obvious that the high content of ECM components causes a challenge in the comprehensive proteome analysis of cartilage.In this study,a7cm×150μmi.d.phosphate strong cation exchange(SCX)monolithic capillary column was coup led with an85cm×75μmi.d.C12reversed-phase monolithic capillary column for online two-dim ensional separation of20μg tryp tic digest of proteins extracted from hum an cartilage.After14salt steps fractionation and following gradient separation coup led with tandem mass spectrometry detection,finally7 434unique pep tides,corresponding to1 901distinct proteins were positively identified.Then,the identified proteins were analyzed by Gene Ontology(GO),and it was found that most of the identified proteins were com e from articular chondrocytes with low abundance,which is important for the researches of articular diseases.

Key words:monolithic column;online two-dimensional separation;proteomics;cartilage tissue

“鳥槍法”(Shotgun)蛋白質(zhì)組學是將蛋白質(zhì)混合物先進行酶解,然后通過鑒定酶解后的肽段來鑒定蛋白質(zhì)的一種“從下至上”(bottom up)的蛋白質(zhì)組學研究策略[1-3]。毛細管納升液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(μHPLC-MS/MS)是“鳥槍法”蛋白質(zhì)組學的技術核心,通過毛細管液相色譜對微量蛋白質(zhì)酶解樣品的高效分離,極大地提高了質(zhì)譜對復雜樣品進行蛋白質(zhì)鑒定分析的能力[4]。在蛋白質(zhì)組學樣品中具有重要生物學意義的蛋白質(zhì)往往是低豐度蛋白質(zhì),進一步提高毛細管液相色譜的分離能力對低豐度蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定具有重要意義。多維液相色譜分離是最強大的液相色譜分離模式[5-7],而在線多維液相色譜分離又具有高效快速、樣品用量小、樣品損失少、無樣品污染等諸多優(yōu)點。在蛋白質(zhì)組學研究中,對于微量的蛋白質(zhì)樣品,在線多維分離具有更大的優(yōu)勢[8-10]。

Yates等[11-13]在同一根100μm的毛細管中以先后順序分別填充了反相(RP)分離填料和強陽離子交換(SCX)填料,將蛋白質(zhì)的酶解物先上樣到SCX部分,然后通過不同的鹽梯度將富集在SCX部分的肽段分級沖洗到RP部分,再分別進行反相梯度分離和串聯(lián)質(zhì)譜的檢測,從而實現(xiàn)了在線二維分離和串聯(lián)質(zhì)譜檢測聯(lián)用,對蛋白質(zhì)樣品具有強大的分離鑒定能力。這種方法也被稱為“多維蛋白質(zhì)鑒定技術(M uD PIT)”的方法,在蛋白質(zhì)組學研究中得到了廣泛的應用。但是由于Yates等人應用的是毛細管填充柱,分離柱的反壓大,上樣速度慢;而且為了保證反相部分的分離能力,強陽離子交換填料填充部分不能太長,上樣能力受到限制的同時也降低了第一維的分級分辨率[14]。相對于填充柱而言,整體柱具有的多孔結構使其具有很高的滲透性和傳質(zhì)速率,從而實現(xiàn)高效快速分離。近年來,毛細管整體柱已經(jīng)被廣泛地應用到納升毛細管液相色譜中,極大地推動了蛋白質(zhì)組學的發(fā)展[15-21]。

關節(jié)軟骨包括軟骨細胞(～1%,體積分數(shù))和細胞外基質(zhì)(ECM),其中ECM的主要組成部分包括膠原蛋白和蛋白聚糖。由于大量細胞外基質(zhì)的存在,要對軟骨細胞中的蛋白質(zhì)進行充分的提取就必須對軟骨組織進行充分的切片或研磨。但軟骨組織被充分破壞后將導致大量的膠原和蛋白聚糖進入提取液,由于其豐度非常高,將極大地影響液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對蛋白質(zhì)樣品中低豐度蛋白質(zhì)的分析鑒定[22]?，F(xiàn)階段人們對軟骨組織蛋白質(zhì)的組成了解不多,對軟骨蛋白的大規(guī)模鑒定到現(xiàn)在為止還是一個難題。在已有的文獻報道中,采用雙向電泳方法的軟骨蛋白質(zhì)組分析只鑒定了不到200個蛋白質(zhì)[23,24]。

我們以帶有磷酸基團的SCX整體柱為富集柱,以帶有C12基團的整體柱為反相分離柱組成二維分離系統(tǒng),以串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測手段構建了一套自動在線多維分離-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)[14,25,26]。本文將該系統(tǒng)應用于軟骨蛋白質(zhì)組分分析,通過對20 μg軟骨提取蛋白質(zhì)的胰蛋白酶酶解物進行分析,在假陽性率(FPR)小于1%的情況下共鑒定得到了7 434個獨立肽段(unique pep tide),對應于1 901個非冗余蛋白質(zhì)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

2-(甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯(EGM P)、亞甲基雙丙烯酰胺(bis-acrylam ide)、二甲基亞砜(DMSO)、十二醇、二甲基甲酰胺(DM F)、十二烷基甲基丙烯酸酯(LMA)、二甲基丙烯酸乙二酯(EDMA)和γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)均購于美國Sigm a公司;偶氮二異丁腈(A IBN)購于上海第四試劑廠;胰蛋白酶購于美國Prom ega公司;二硫蘇糖醇(D TT)、碘代乙酰胺(IAA)和蛋白酶抑制劑購于北京Sino-Am erican生物技術公司;75 μm和150μm內(nèi)徑毛細管購于美國Polym icro公司;乙腈為色譜純,購于美國M erck公司;實驗用水為M illi-Q超純水。

Surveyor HPLC液相色譜系統(tǒng)(美國熱電公司),配有脫氣機和四元液相泵。3種分離流動相為:流動相A,0.1%甲酸水溶液;流動相B,0.1%甲酸乙腈溶液;流動相C,1mol/L醋酸銨溶液(pH 3)。流動相從液相色譜流出后通過一個三通閥分流,使其達到分離所需的200nL/m in的流速。LTQ線性離子阱質(zhì)譜(美國熱電公司),配有納升電噴霧離子源和一個六通閥。

1.2 軟骨蛋白的提取和酶解

100m g人體軟骨(上海第九人民醫(yī)院提供)放置于研缽中,加入液氮,充分多次研磨。然后將研磨后的軟骨粉末轉移到1.5mL的離心管中,加入1mL含有6mol/L鹽酸胍、0.1mol/L Tris和蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)提取液(pH7.4),在室溫下充分振蕩2h。將離心管在9 100r/m in(6 000g)離心5m in,上清液轉移到10mL離心管中并用氯仿/甲醇沉淀法將上清液中的蛋白質(zhì)沉淀出來。離心出來的沉淀物在用甲醇清洗后復溶于1mL含8mol/L尿素和0.05mol/L Tris(pH8.1)的變性試劑中,蛋白質(zhì)濃度通過B radford方法進行測定。然后該蛋白質(zhì)樣品在37℃用D TT還原2h,并在避光的環(huán)境下用IAA對打開的二硫鍵進行封端40m in。隨后用0.05mol/L的Tris溶液(pH8.1)將溶液的尿素濃度稀釋到1mol/L。最后加入胰蛋白酶(其質(zhì)量為蛋白質(zhì)總量的1/25),并在37℃下保持24h。所得到的胰蛋白酶酶解物用實驗室自制的C18固相萃取柱進行除鹽純化并復溶于0.1%的甲酸水溶液中。該樣品儲存于-20℃冰箱中待用。

1.3 整體柱的制備

兩種整體柱的制作與以前報道的方法一致[14,16,25]。制作強陽離子交換毛細管整體柱時,將80μL EGM P、60m g亞甲基雙丙烯酰胺、270μL DMSO、200μL十二醇、50μL DM F和2m g A IBN混合并超聲振蕩15m in。配制的聚合溶液通過虹吸進入150μm內(nèi)徑毛細管,將毛細管兩端用硅橡膠封口,然后放入60℃水浴反應12h;最后用甲醇沖洗出未反應的聚合單體及致孔劑即可。制作反相毛細管整體柱時,將100μL LMA、100μL EDMA、170μL正丙醇、130μL1,4-丁二醇、20μL水和2 m g A IBN混合,然后通過虹吸進入75μm內(nèi)徑毛細管,其余步驟與SCX整體柱制作步驟相同。對于反相毛細管整體柱,在制作完成后還要在沖水的情況下在柱子的出水端用丁烷焰拉制一個內(nèi)徑約為5 μm的電噴霧針頭。

1.4 樣品自動進樣及液相色譜分離

樣品自動進樣及在線二維分離系統(tǒng)如圖1所示。7cm長的150μm內(nèi)徑SCX整體柱通過四通閥和六通閥與85cm長的75μm內(nèi)徑RP柱相連,RP分離柱通過電噴霧針頭直接與質(zhì)譜偶聯(lián),電噴霧的電壓通過鉑絲加在四通閥的一個出口上。在上樣時,六通閥處于實線位置,蛋白酶解樣品以10 μL/m in的流速上樣到SCX整體柱上,廢液通過六通閥排出;分析時六通閥切換至虛線位置開啟分流通路,流動相通過三通閥分流后以200nL/m in的流速通過兩種整體柱進行分離。

在進行在線二維分離時,先將20μg軟骨提取蛋白的胰蛋白酶酶解物自動上樣到SCX整體柱上,然后將流動相A(0.1%甲酸水溶液)和流動相C(pH值為3的1mol/L醋酸銨水溶液)以不同的比例混合得到不同濃度的NH4Ac鹽溶液流動相,14種不同濃度的鹽溶液以200nL/m in的流速將SCX整體柱上富集的肽段分級洗脫到RP整體柱上。分離梯度設置:循環(huán)1由流動相A和流動相B組成的混合流動相以0%B到8%B洗脫2m in,從8%B到30%B洗脫90m in,從30%B到0%B洗脫2m in,然后整個系統(tǒng)用100%A平衡25m in。接下來的12個分離循環(huán)都為250m in,其設置如下:先用X%(以流動相C比例計)的混合流動相(由流動相A和C混合所得)沖洗5m in,100%A平衡10 m in,然后由流動相A和B組成的RP分離梯度進行分離,其梯度程序為:從0%B到8%B洗脫5m in,從8%B到30%B洗脫205m in,從30%B到0%B洗脫5m in,然后整個系統(tǒng)用100%A平衡20 m in;其中5分鐘的X%設置為:循環(huán)2,5%;循環(huán)3,10%;循環(huán)4,15%;循環(huán)5,20%;循環(huán)6,25%;循環(huán)7,30%;循環(huán)8,35%;循環(huán)9,40%;循環(huán)10,45%;循環(huán)11,50%;循環(huán)12,60%;循環(huán)13,80%。最后一個分離循環(huán)設置為:100%C沖洗10m in,100%A平衡10m in,然后由流動相A和B組成的RP分離梯度進行分離,其梯度程序為:從0%B到8%B洗脫5m in,從8%B到30%B洗脫205m in,從30%B到80%B洗脫10m in,保持80%B沖洗10m in,然后整個系統(tǒng)用100%A平衡25m in[14,25]。

圖2是20μg軟骨提取蛋白的胰蛋白酶酶解物經(jīng)14個鹽梯度分級后反相色譜梯度分離的質(zhì)譜檢測基峰圖。

圖1 整體柱在線二維分離系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the on line multidimensional separation system using monolithic capillary columns

1.5 質(zhì)譜檢測條件及數(shù)據(jù)庫搜索

LTQ質(zhì)譜在正離子模式下操作,離子傳輸毛細管的溫度為200℃,噴霧電壓為1.8kV,歸一化碰撞能量為35%。所有一級譜(MS)和二級譜(MS/MS)在Data Dependent Analysis(DDA)模式下操作。一個一級譜掃描后對其中強度最高的6個峰進行二級質(zhì)譜分析。系統(tǒng)的操作和數(shù)據(jù)的采集都使用Xcalibur軟件(v1.4,熱電公司)完成。

圖2 20μg軟骨提取蛋白質(zhì)的胰蛋白酶酶解物14個循環(huán)在線二維色譜分離的納升電噴霧質(zhì)譜檢測基峰圖Fig.2 Base peak chromatograms of a14-cycle on line two-d imensional analysis of20μg cartilage proteins tryptic digest

所收集的MS/MS譜圖通過SEQU EST程序(B ioW orks3.2,熱電公司)進行數(shù)據(jù)庫檢索。為了評價檢索結果的假陽性率,將人IPI(InternationalProtein Index)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(v3.17)(包含60 236個蛋白質(zhì)條目)的反庫與正庫合并。半胱氨酸殘基在數(shù)據(jù)庫搜索過程中帶有57.021 5D a的固定修飾;甲硫氨酸殘基在數(shù)據(jù)庫搜索過程中帶有15.994 9D a的可變修飾。肽段在數(shù)據(jù)庫搜索中應用兩端完全酶解限制,允許2個漏切位點。對母離子的質(zhì)量偏差允許為2D a,對碎片離子的質(zhì)量偏差允許為1D a。Xcorr函數(shù)值設定為對于單電荷肽段大于1.9,雙電荷肽段大于2.2,三電荷肽段大于3.75。ΔCn值設置為0.3,保證鑒定的FPR小于1%。

2 結果與討論

2.1 色譜分離與蛋白質(zhì)鑒定效果

從圖2中可以看出富集于SCX整體柱上的肽段被充分地分級為14個餾分,每個餾分肽段的基峰強度都是較為一致的,證明了在線二維色譜分離的有效性。另外也可以看到,當用1mol/L的醋酸銨沖洗時(圖2循環(huán)14)所得到的峰的數(shù)目明顯比其他組分少,說明富集到SCX整體柱上的肽段已經(jīng)基本上被完全洗脫下來了。將所收集到的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)用SEQU EST按照實驗部分所述的方法進行數(shù)據(jù)庫檢索,最后鑒定得到了7 434個獨立肽段和1 901個非冗余蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)簇,每一個蛋白質(zhì)簇中包含的多個可能蛋白質(zhì)只記為一個鑒定到的非冗余蛋白質(zhì))。其中,由兩段或兩段以上肽段所鑒定到的蛋白質(zhì)有1 112個,占鑒定蛋白質(zhì)總數(shù)的58.5%。該數(shù)目遠遠多于以往文獻所報道的已鑒定得到的軟骨蛋白質(zhì)數(shù)目,充分證明了該在線二維分離系統(tǒng)在大規(guī)模蛋白質(zhì)組學鑒定中的優(yōu)勢。為了證明該在線二維分離串聯(lián)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)的重現(xiàn)性,相同的實驗又重復進行了一次。在相同的數(shù)據(jù)篩選條件下,成功鑒定到了7 487個獨立肽段和2 014個非冗余蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)簇)。由兩段或兩段以上肽段所鑒定到的蛋白質(zhì)有1 129個,占鑒定蛋白質(zhì)總數(shù)的56.1%。在兩次實驗中都得到鑒定的獨立肽段和非冗余蛋白質(zhì)的數(shù)目分別為5 229和1 458個,占到了實驗鑒定總數(shù)的70.3%和76.7%。

圖3是14個鹽梯度上新鑒定到的獨立肽段和非冗余蛋白質(zhì)數(shù)目的分布情況,從中可以看出實驗中鑒定到的肽段和蛋白質(zhì)充分對稱地分布于14個鹽梯度上。最后一個1mol/L的鹽梯度上鑒定到的蛋白質(zhì)和肽段數(shù)目都明顯變少,再次證明了富集到的肽段已經(jīng)基本上洗脫完全了。14個鹽梯度上肽段和蛋白質(zhì)的分布結果與圖2中所得到的基峰圖的分布結果是一致的,也說明了該在線二維分離的有效性,SCX整體柱與RP整體柱良好的正交性對肽段和蛋白質(zhì)的鑒定有很大的幫助。

圖3 經(jīng)14個鹽梯度在線二維分離新鑒定到的(a)肽段和(b)蛋白質(zhì)的分布圖Fig.3 Distribution of the newly identified(a)unique peptides and(b)distinct proteins by the14 salt steps in on line two-dimensional separation

第一維分離與第二維分離的正交性是決定二維分離能力的關鍵因素。在以往的研究中,SCX與RP的填充柱被廣泛地應用于離線和在線多維分離中,取得了很好的結果[5-10]。在本工作中,我們應用了7cm長的SCX整體柱,提高了分級的分辨率[27]。基峰圖和鑒定到的肽段和蛋白質(zhì)在14個鹽梯度上的對稱分布都很好地說明了這一點。另外,由于整體柱良好的滲透性,在反相梯度分離中應用了85cm長的C12有機整體柱,保證了第二維的分離能力,這也是該系統(tǒng)能很好地分離肽段、鑒定得到1 901個軟骨蛋白質(zhì)的原因之一。

2.2 蛋白質(zhì)分類分析

軟骨組織中存在著大量的細胞外介質(zhì),其中主要是膠原蛋白和蛋白聚糖,它們是提取出來的蛋白質(zhì)中的主要成分。大量的高豐度蛋白質(zhì)極大地阻礙了廣泛存在的低豐度蛋白質(zhì)的鑒定,這也是軟骨蛋白鑒定的難點所在。在本工作中,我們通過整體柱和在線二維分離的應用極大地提高了系統(tǒng)的分離能力,從而成功地鑒定到了1 901個軟骨蛋白質(zhì)。采用蛋白質(zhì)分類軟件Gene O ntology(GO)對所鑒定到的蛋白質(zhì)按其來源進行分類,結果見表1?？梢钥闯?豐度排名前30位的高豐度蛋白質(zhì)來自于細胞外基質(zhì)的有16種而只有9種來自軟骨細胞內(nèi),說明細胞外基質(zhì)中的高豐度蛋白質(zhì)在樣品中是大量存在的;但對所鑒定得到的所有軟骨蛋白來說,有938種蛋白質(zhì)來自于軟骨細胞內(nèi)部,只有68種來自于細胞外基質(zhì)。該表充分說明了雖然高豐度的蛋白質(zhì)大量存在,但是由于該二維系統(tǒng)的分離能力,軟骨細胞內(nèi)部的低豐度蛋白質(zhì)也得到了充分的鑒定,這對于研究許多軟骨疾病如關節(jié)炎等都是非常有幫助的[22-24]。

表1 蛋白質(zhì)在軟骨組織中的來源分類表Table1 Categorization of the identified cartilage proteins based on cellular component

3 結論

本文將7cm長的SCX整體柱和85cm長的RP整體柱所構建的在線自動二維分離平臺應用于軟骨蛋白質(zhì)組分析。20μg軟骨提取蛋白質(zhì)的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物經(jīng)μLC-MS/MS分離鑒定分析,最后成功地鑒定得到了7 434個獨立肽段和1 901個非冗余蛋白質(zhì)。據(jù)我們的文獻調(diào)研,這是迄今有關軟骨蛋白質(zhì)組學大規(guī)模鑒定的最好結果。根據(jù)生物信息學的分析,大部分鑒定到的蛋白質(zhì)都是來自于軟骨細胞內(nèi)部的低豐度蛋白質(zhì),這對于許多關節(jié)類疾病的研究有重要意義。

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Application of on line two-dimensional separation system using monolithic columns for proteome analysis of human cartilage

XIE Shajie1,WANG Fangjun1,YAN D an2,ZHOU Guangdong2,YE Mingliang1,ZOU Hanfa1＊
(1.Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry,National Chromatographic R.& A.Center,Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023,China;2.National Tissue Engineering Center of China,Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shangha i 9th People’s Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200011,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0140-06

＊通訊聯(lián)系人:鄒漢法,博士生導師,研究員.Tel:(0411)84379610,Fax:(0411)84379620,E-m ail:hanfazou@dicp.ac.cn.

國家自然科學基金項目(Nos.20675081,20735004).

2009-08-11

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00140