謝沙潔, 王方軍, 晏 丹, 周廣東, 葉明亮, 鄒漢法＊

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家色譜研究分析中心,遼寧大連116023;2.組織工程國(guó)家工程研究中心,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整形外科,上海200011)

毛細(xì)管整體柱在線二維分離系統(tǒng)應(yīng)用于人體軟骨的蛋白質(zhì)組分析

謝沙潔1, 王方軍1, 晏 丹2, 周廣東2, 葉明亮1, 鄒漢法1＊

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家色譜研究分析中心,遼寧大連116023;2.組織工程國(guó)家工程研究中心,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整形外科,上海200011)

將已建立的7cm柱長(zhǎng)的磷酸基團(tuán)強(qiáng)陽(yáng)離子交換富集整體柱與85cm柱長(zhǎng)的C12烷基反相整體柱結(jié)合的在線二維分離平臺(tái)應(yīng)用于軟骨提取蛋白的蛋白質(zhì)組分析。對(duì)20μg軟骨提取蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行14個(gè)鹽梯度的分級(jí),然后對(duì)14個(gè)餾分進(jìn)行反相色譜梯度分離及串聯(lián)質(zhì)譜鑒定,成功地鑒定得到了7 434個(gè)獨(dú)立肽段對(duì)應(yīng)的1 901個(gè)非冗余蛋白質(zhì)。對(duì)所鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行定位分類,結(jié)果表明鑒定到的大部分蛋白質(zhì)是來(lái)自于軟骨細(xì)胞內(nèi)部的低豐度蛋白質(zhì),這對(duì)于許多關(guān)節(jié)類疾病的研究有重要意義。

整體柱;在線二維分離;蛋白質(zhì)組學(xué);軟骨組織

Abstract:In Shotgun proteome analysis,where nano-flow is adopted to increase the sensitivity as w ell as extrem ely com p licated samples such as proteolytic digest are inevitably confronted,monolithic capillary columns are widely used to improve the liquid Chromatography separation performance.It is known that cartilage contains extensive amounts of extracellular matrix(ECM),in which collagens and aggrecans being the most abundant macromolecules.It is obvious that the high content of ECM components causes a challenge in the comprehensive proteome analysis of cartilage.In this study,a7cm×150μmi.d.phosphate strong cation exchange(SCX)monolithic capillary column was coup led with an85cm×75μmi.d.C12reversed-phase monolithic capillary column for online two-dim ensional separation of20μg tryp tic digest of proteins extracted from hum an cartilage.After14salt steps fractionation and following gradient separation coup led with tandem mass spectrometry detection,finally7 434unique pep tides,corresponding to1 901distinct proteins were positively identified.Then,the identified proteins were analyzed by Gene Ontology(GO),and it was found that most of the identified proteins were com e from articular chondrocytes with low abundance,which is important for the researches of articular diseases.

Key words:monolithic column;online two-dimensional separation;proteomics;cartilage tissue

“鳥(niǎo)槍法”(Shotgun)蛋白質(zhì)組學(xué)是將蛋白質(zhì)混合物先進(jìn)行酶解,然后通過(guò)鑒定酶解后的肽段來(lái)鑒定蛋白質(zhì)的一種“從下至上”(bottom up)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略[1-3]。毛細(xì)管納升液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(μHPLC-MS/MS)是“鳥(niǎo)槍法”蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)核心,通過(guò)毛細(xì)管液相色譜對(duì)微量蛋白質(zhì)酶解樣品的高效分離,極大地提高了質(zhì)譜對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定分析的能力[4]。在蛋白質(zhì)組學(xué)樣品中具有重要生物學(xué)意義的蛋白質(zhì)往往是低豐度蛋白質(zhì),進(jìn)一步提高毛細(xì)管液相色譜的分離能力對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定具有重要意義。多維液相色譜分離是最強(qiáng)大的液相色譜分離模式[5-7],而在線多維液相色譜分離又具有高效快速、樣品用量小、樣品損失少、無(wú)樣品污染等諸多優(yōu)點(diǎn)。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,對(duì)于微量的蛋白質(zhì)樣品,在線多維分離具有更大的優(yōu)勢(shì)[8-10]。

Yates等[11-13]在同一根100μm的毛細(xì)管中以先后順序分別填充了反相(RP)分離填料和強(qiáng)陽(yáng)離子交換(SCX)填料,將蛋白質(zhì)的酶解物先上樣到SCX部分,然后通過(guò)不同的鹽梯度將富集在SCX部分的肽段分級(jí)沖洗到RP部分,再分別進(jìn)行反相梯度分離和串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè),從而實(shí)現(xiàn)了在線二維分離和串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)聯(lián)用,對(duì)蛋白質(zhì)樣品具有強(qiáng)大的分離鑒定能力。這種方法也被稱為“多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(M uD PIT)”的方法,在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。但是由于Yates等人應(yīng)用的是毛細(xì)管填充柱,分離柱的反壓大,上樣速度慢;而且為了保證反相部分的分離能力,強(qiáng)陽(yáng)離子交換填料填充部分不能太長(zhǎng),上樣能力受到限制的同時(shí)也降低了第一維的分級(jí)分辨率[14]。相對(duì)于填充柱而言,整體柱具有的多孔結(jié)構(gòu)使其具有很高的滲透性和傳質(zhì)速率,從而實(shí)現(xiàn)高效快速分離。近年來(lái),毛細(xì)管整體柱已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到納升毛細(xì)管液相色譜中,極大地推動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展[15-21]。

關(guān)節(jié)軟骨包括軟骨細(xì)胞(～1%,體積分?jǐn)?shù))和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),其中ECM的主要組成部分包括膠原蛋白和蛋白聚糖。由于大量細(xì)胞外基質(zhì)的存在,要對(duì)軟骨細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行充分的提取就必須對(duì)軟骨組織進(jìn)行充分的切片或研磨。但軟骨組織被充分破壞后將導(dǎo)致大量的膠原和蛋白聚糖進(jìn)入提取液,由于其豐度非常高,將極大地影響液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)蛋白質(zhì)樣品中低豐度蛋白質(zhì)的分析鑒定[22]?，F(xiàn)階段人們對(duì)軟骨組織蛋白質(zhì)的組成了解不多,對(duì)軟骨蛋白的大規(guī)模鑒定到現(xiàn)在為止還是一個(gè)難題。在已有的文獻(xiàn)報(bào)道中,采用雙向電泳方法的軟骨蛋白質(zhì)組分析只鑒定了不到200個(gè)蛋白質(zhì)[23,24]。

我們以帶有磷酸基團(tuán)的SCX整體柱為富集柱,以帶有C12基團(tuán)的整體柱為反相分離柱組成二維分離系統(tǒng),以串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測(cè)手段構(gòu)建了一套自動(dòng)在線多維分離-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)[14,25,26]。本文將該系統(tǒng)應(yīng)用于軟骨蛋白質(zhì)組分分析,通過(guò)對(duì)20 μg軟骨提取蛋白質(zhì)的胰蛋白酶酶解物進(jìn)行分析,在假陽(yáng)性率(FPR)小于1%的情況下共鑒定得到了7 434個(gè)獨(dú)立肽段(unique pep tide),對(duì)應(yīng)于1 901個(gè)非冗余蛋白質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

2-(甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯(EGM P)、亞甲基雙丙烯酰胺(bis-acrylam ide)、二甲基亞砜(DMSO)、十二醇、二甲基甲酰胺(DM F)、十二烷基甲基丙烯酸酯(LMA)、二甲基丙烯酸乙二酯(EDMA)和γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)均購(gòu)于美國(guó)Sigm a公司;偶氮二異丁腈(A IBN)購(gòu)于上海第四試劑廠;胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Prom ega公司;二硫蘇糖醇(D TT)、碘代乙酰胺(IAA)和蛋白酶抑制劑購(gòu)于北京Sino-Am erican生物技術(shù)公司;75 μm和150μm內(nèi)徑毛細(xì)管購(gòu)于美國(guó)Polym icro公司;乙腈為色譜純,購(gòu)于美國(guó)M erck公司;實(shí)驗(yàn)用水為M illi-Q超純水。

Surveyor HPLC液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)熱電公司),配有脫氣機(jī)和四元液相泵。3種分離流動(dòng)相為:流動(dòng)相A,0.1%甲酸水溶液;流動(dòng)相B,0.1%甲酸乙腈溶液;流動(dòng)相C,1mol/L醋酸銨溶液(pH 3)。流動(dòng)相從液相色譜流出后通過(guò)一個(gè)三通閥分流,使其達(dá)到分離所需的200nL/m in的流速。LTQ線性離子阱質(zhì)譜(美國(guó)熱電公司),配有納升電噴霧離子源和一個(gè)六通閥。

1.2 軟骨蛋白的提取和酶解

100m g人體軟骨(上海第九人民醫(yī)院提供)放置于研缽中,加入液氮,充分多次研磨。然后將研磨后的軟骨粉末轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中,加入1mL含有6mol/L鹽酸胍、0.1mol/L Tris和蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)提取液(pH7.4),在室溫下充分振蕩2h。將離心管在9 100r/m in(6 000g)離心5m in,上清液轉(zhuǎn)移到10mL離心管中并用氯仿/甲醇沉淀法將上清液中的蛋白質(zhì)沉淀出來(lái)。離心出來(lái)的沉淀物在用甲醇清洗后復(fù)溶于1mL含8mol/L尿素和0.05mol/L Tris(pH8.1)的變性試劑中,蛋白質(zhì)濃度通過(guò)B radford方法進(jìn)行測(cè)定。然后該蛋白質(zhì)樣品在37℃用D TT還原2h,并在避光的環(huán)境下用IAA對(duì)打開(kāi)的二硫鍵進(jìn)行封端40m in。隨后用0.05mol/L的Tris溶液(pH8.1)將溶液的尿素濃度稀釋到1mol/L。最后加入胰蛋白酶(其質(zhì)量為蛋白質(zhì)總量的1/25),并在37℃下保持24h。所得到的胰蛋白酶酶解物用實(shí)驗(yàn)室自制的C18固相萃取柱進(jìn)行除鹽純化并復(fù)溶于0.1%的甲酸水溶液中。該樣品儲(chǔ)存于-20℃冰箱中待用。

1.3 整體柱的制備

兩種整體柱的制作與以前報(bào)道的方法一致[14,16,25]。制作強(qiáng)陽(yáng)離子交換毛細(xì)管整體柱時(shí),將80μL EGM P、60m g亞甲基雙丙烯酰胺、270μL DMSO、200μL十二醇、50μL DM F和2m g A IBN混合并超聲振蕩15m in。配制的聚合溶液通過(guò)虹吸進(jìn)入150μm內(nèi)徑毛細(xì)管,將毛細(xì)管兩端用硅橡膠封口,然后放入60℃水浴反應(yīng)12h;最后用甲醇沖洗出未反應(yīng)的聚合單體及致孔劑即可。制作反相毛細(xì)管整體柱時(shí),將100μL LMA、100μL EDMA、170μL正丙醇、130μL1,4-丁二醇、20μL水和2 m g A IBN混合,然后通過(guò)虹吸進(jìn)入75μm內(nèi)徑毛細(xì)管,其余步驟與SCX整體柱制作步驟相同。對(duì)于反相毛細(xì)管整體柱,在制作完成后還要在沖水的情況下在柱子的出水端用丁烷焰拉制一個(gè)內(nèi)徑約為5 μm的電噴霧針頭。

1.4 樣品自動(dòng)進(jìn)樣及液相色譜分離

樣品自動(dòng)進(jìn)樣及在線二維分離系統(tǒng)如圖1所示。7cm長(zhǎng)的150μm內(nèi)徑SCX整體柱通過(guò)四通閥和六通閥與85cm長(zhǎng)的75μm內(nèi)徑RP柱相連,RP分離柱通過(guò)電噴霧針頭直接與質(zhì)譜偶聯(lián),電噴霧的電壓通過(guò)鉑絲加在四通閥的一個(gè)出口上。在上樣時(shí),六通閥處于實(shí)線位置,蛋白酶解樣品以10 μL/m in的流速上樣到SCX整體柱上,廢液通過(guò)六通閥排出;分析時(shí)六通閥切換至虛線位置開(kāi)啟分流通路,流動(dòng)相通過(guò)三通閥分流后以200nL/m in的流速通過(guò)兩種整體柱進(jìn)行分離。

在進(jìn)行在線二維分離時(shí),先將20μg軟骨提取蛋白的胰蛋白酶酶解物自動(dòng)上樣到SCX整體柱上,然后將流動(dòng)相A(0.1%甲酸水溶液)和流動(dòng)相C(pH值為3的1mol/L醋酸銨水溶液)以不同的比例混合得到不同濃度的NH4Ac鹽溶液流動(dòng)相,14種不同濃度的鹽溶液以200nL/m in的流速將SCX整體柱上富集的肽段分級(jí)洗脫到RP整體柱上。分離梯度設(shè)置:循環(huán)1由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成的混合流動(dòng)相以0%B到8%B洗脫2m in,從8%B到30%B洗脫90m in,從30%B到0%B洗脫2m in,然后整個(gè)系統(tǒng)用100%A平衡25m in。接下來(lái)的12個(gè)分離循環(huán)都為250m in,其設(shè)置如下:先用X%(以流動(dòng)相C比例計(jì))的混合流動(dòng)相(由流動(dòng)相A和C混合所得)沖洗5m in,100%A平衡10 m in,然后由流動(dòng)相A和B組成的RP分離梯度進(jìn)行分離,其梯度程序?yàn)?從0%B到8%B洗脫5m in,從8%B到30%B洗脫205m in,從30%B到0%B洗脫5m in,然后整個(gè)系統(tǒng)用100%A平衡20 m in;其中5分鐘的X%設(shè)置為:循環(huán)2,5%;循環(huán)3,10%;循環(huán)4,15%;循環(huán)5,20%;循環(huán)6,25%;循環(huán)7,30%;循環(huán)8,35%;循環(huán)9,40%;循環(huán)10,45%;循環(huán)11,50%;循環(huán)12,60%;循環(huán)13,80%。最后一個(gè)分離循環(huán)設(shè)置為:100%C沖洗10m in,100%A平衡10m in,然后由流動(dòng)相A和B組成的RP分離梯度進(jìn)行分離,其梯度程序?yàn)?從0%B到8%B洗脫5m in,從8%B到30%B洗脫205m in,從30%B到80%B洗脫10m in,保持80%B沖洗10m in,然后整個(gè)系統(tǒng)用100%A平衡25m in[14,25]。

圖2是20μg軟骨提取蛋白的胰蛋白酶酶解物經(jīng)14個(gè)鹽梯度分級(jí)后反相色譜梯度分離的質(zhì)譜檢測(cè)基峰圖。

圖1 整體柱在線二維分離系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the on line multidimensional separation system using monolithic capillary columns

1.5 質(zhì)譜檢測(cè)條件及數(shù)據(jù)庫(kù)搜索

LTQ質(zhì)譜在正離子模式下操作,離子傳輸毛細(xì)管的溫度為200℃,噴霧電壓為1.8kV,歸一化碰撞能量為35%。所有一級(jí)譜(MS)和二級(jí)譜(MS/MS)在Data Dependent Analysis(DDA)模式下操作。一個(gè)一級(jí)譜掃描后對(duì)其中強(qiáng)度最高的6個(gè)峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。系統(tǒng)的操作和數(shù)據(jù)的采集都使用Xcalibur軟件(v1.4,熱電公司)完成。

圖2 20μg軟骨提取蛋白質(zhì)的胰蛋白酶酶解物14個(gè)循環(huán)在線二維色譜分離的納升電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)基峰圖Fig.2 Base peak chromatograms of a14-cycle on line two-d imensional analysis of20μg cartilage proteins tryptic digest

所收集的MS/MS譜圖通過(guò)SEQU EST程序(B ioW orks3.2,熱電公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。為了評(píng)價(jià)檢索結(jié)果的假陽(yáng)性率,將人IPI(InternationalProtein Index)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(v3.17)(包含60 236個(gè)蛋白質(zhì)條目)的反庫(kù)與正庫(kù)合并。半胱氨酸殘基在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索過(guò)程中帶有57.021 5D a的固定修飾;甲硫氨酸殘基在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索過(guò)程中帶有15.994 9D a的可變修飾。肽段在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索中應(yīng)用兩端完全酶解限制,允許2個(gè)漏切位點(diǎn)。對(duì)母離子的質(zhì)量偏差允許為2D a,對(duì)碎片離子的質(zhì)量偏差允許為1D a。Xcorr函數(shù)值設(shè)定為對(duì)于單電荷肽段大于1.9,雙電荷肽段大于2.2,三電荷肽段大于3.75。ΔCn值設(shè)置為0.3,保證鑒定的FPR小于1%。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離與蛋白質(zhì)鑒定效果

從圖2中可以看出富集于SCX整體柱上的肽段被充分地分級(jí)為14個(gè)餾分,每個(gè)餾分肽段的基峰強(qiáng)度都是較為一致的,證明了在線二維色譜分離的有效性。另外也可以看到,當(dāng)用1mol/L的醋酸銨沖洗時(shí)(圖2循環(huán)14)所得到的峰的數(shù)目明顯比其他組分少,說(shuō)明富集到SCX整體柱上的肽段已經(jīng)基本上被完全洗脫下來(lái)了。將所收集到的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)用SEQU EST按照實(shí)驗(yàn)部分所述的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,最后鑒定得到了7 434個(gè)獨(dú)立肽段和1 901個(gè)非冗余蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)簇,每一個(gè)蛋白質(zhì)簇中包含的多個(gè)可能蛋白質(zhì)只記為一個(gè)鑒定到的非冗余蛋白質(zhì))。其中,由兩段或兩段以上肽段所鑒定到的蛋白質(zhì)有1 112個(gè),占鑒定蛋白質(zhì)總數(shù)的58.5%。該數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于以往文獻(xiàn)所報(bào)道的已鑒定得到的軟骨蛋白質(zhì)數(shù)目,充分證明了該在線二維分離系統(tǒng)在大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定中的優(yōu)勢(shì)。為了證明該在線二維分離串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)的重現(xiàn)性,相同的實(shí)驗(yàn)又重復(fù)進(jìn)行了一次。在相同的數(shù)據(jù)篩選條件下,成功鑒定到了7 487個(gè)獨(dú)立肽段和2 014個(gè)非冗余蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)簇)。由兩段或兩段以上肽段所鑒定到的蛋白質(zhì)有1 129個(gè),占鑒定蛋白質(zhì)總數(shù)的56.1%。在兩次實(shí)驗(yàn)中都得到鑒定的獨(dú)立肽段和非冗余蛋白質(zhì)的數(shù)目分別為5 229和1 458個(gè),占到了實(shí)驗(yàn)鑒定總數(shù)的70.3%和76.7%。

圖3是14個(gè)鹽梯度上新鑒定到的獨(dú)立肽段和非冗余蛋白質(zhì)數(shù)目的分布情況,從中可以看出實(shí)驗(yàn)中鑒定到的肽段和蛋白質(zhì)充分對(duì)稱地分布于14個(gè)鹽梯度上。最后一個(gè)1mol/L的鹽梯度上鑒定到的蛋白質(zhì)和肽段數(shù)目都明顯變少,再次證明了富集到的肽段已經(jīng)基本上洗脫完全了。14個(gè)鹽梯度上肽段和蛋白質(zhì)的分布結(jié)果與圖2中所得到的基峰圖的分布結(jié)果是一致的,也說(shuō)明了該在線二維分離的有效性,SCX整體柱與RP整體柱良好的正交性對(duì)肽段和蛋白質(zhì)的鑒定有很大的幫助。

圖3 經(jīng)14個(gè)鹽梯度在線二維分離新鑒定到的(a)肽段和(b)蛋白質(zhì)的分布圖Fig.3 Distribution of the newly identified(a)unique peptides and(b)distinct proteins by the14 salt steps in on line two-dimensional separation

第一維分離與第二維分離的正交性是決定二維分離能力的關(guān)鍵因素。在以往的研究中,SCX與RP的填充柱被廣泛地應(yīng)用于離線和在線多維分離中,取得了很好的結(jié)果[5-10]。在本工作中,我們應(yīng)用了7cm長(zhǎng)的SCX整體柱,提高了分級(jí)的分辨率[27]。基峰圖和鑒定到的肽段和蛋白質(zhì)在14個(gè)鹽梯度上的對(duì)稱分布都很好地說(shuō)明了這一點(diǎn)。另外,由于整體柱良好的滲透性,在反相梯度分離中應(yīng)用了85cm長(zhǎng)的C12有機(jī)整體柱,保證了第二維的分離能力,這也是該系統(tǒng)能很好地分離肽段、鑒定得到1 901個(gè)軟骨蛋白質(zhì)的原因之一。

2.2 蛋白質(zhì)分類分析

軟骨組織中存在著大量的細(xì)胞外介質(zhì),其中主要是膠原蛋白和蛋白聚糖,它們是提取出來(lái)的蛋白質(zhì)中的主要成分。大量的高豐度蛋白質(zhì)極大地阻礙了廣泛存在的低豐度蛋白質(zhì)的鑒定,這也是軟骨蛋白鑒定的難點(diǎn)所在。在本工作中,我們通過(guò)整體柱和在線二維分離的應(yīng)用極大地提高了系統(tǒng)的分離能力,從而成功地鑒定到了1 901個(gè)軟骨蛋白質(zhì)。采用蛋白質(zhì)分類軟件Gene O ntology(GO)對(duì)所鑒定到的蛋白質(zhì)按其來(lái)源進(jìn)行分類,結(jié)果見(jiàn)表1?？梢钥闯?豐度排名前30位的高豐度蛋白質(zhì)來(lái)自于細(xì)胞外基質(zhì)的有16種而只有9種來(lái)自軟骨細(xì)胞內(nèi),說(shuō)明細(xì)胞外基質(zhì)中的高豐度蛋白質(zhì)在樣品中是大量存在的;但對(duì)所鑒定得到的所有軟骨蛋白來(lái)說(shuō),有938種蛋白質(zhì)來(lái)自于軟骨細(xì)胞內(nèi)部,只有68種來(lái)自于細(xì)胞外基質(zhì)。該表充分說(shuō)明了雖然高豐度的蛋白質(zhì)大量存在,但是由于該二維系統(tǒng)的分離能力,軟骨細(xì)胞內(nèi)部的低豐度蛋白質(zhì)也得到了充分的鑒定,這對(duì)于研究許多軟骨疾病如關(guān)節(jié)炎等都是非常有幫助的[22-24]。

表1 蛋白質(zhì)在軟骨組織中的來(lái)源分類表Table1 Categorization of the identified cartilage proteins based on cellular component

3 結(jié)論

本文將7cm長(zhǎng)的SCX整體柱和85cm長(zhǎng)的RP整體柱所構(gòu)建的在線自動(dòng)二維分離平臺(tái)應(yīng)用于軟骨蛋白質(zhì)組分析。20μg軟骨提取蛋白質(zhì)的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物經(jīng)μLC-MS/MS分離鑒定分析,最后成功地鑒定得到了7 434個(gè)獨(dú)立肽段和1 901個(gè)非冗余蛋白質(zhì)。據(jù)我們的文獻(xiàn)調(diào)研,這是迄今有關(guān)軟骨蛋白質(zhì)組學(xué)大規(guī)模鑒定的最好結(jié)果。根據(jù)生物信息學(xué)的分析,大部分鑒定到的蛋白質(zhì)都是來(lái)自于軟骨細(xì)胞內(nèi)部的低豐度蛋白質(zhì),這對(duì)于許多關(guān)節(jié)類疾病的研究有重要意義。

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Application of on line two-dimensional separation system using monolithic columns for proteome analysis of human cartilage

XIE Shajie1,WANG Fangjun1,YAN D an2,ZHOU Guangdong2,YE Mingliang1,ZOU Hanfa1＊
(1.Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry,National Chromatographic R.& A.Center,Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023,China;2.National Tissue Engineering Center of China,Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shangha i 9th People’s Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200011,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0140-06

＊通訊聯(lián)系人:鄒漢法,博士生導(dǎo)師,研究員.Tel:(0411)84379610,Fax:(0411)84379620,E-m ail:hanfazou@dicp.ac.cn.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Nos.20675081,20735004).

2009-08-11

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00140