蘇海燕，劉文天，王邦茂，張文治，蘇 心

（1.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院消化科，天津 300052；2.天津市環(huán)湖醫(yī)院）

生長抑素類似物（somatostatin analogue，SSTA）的抗腫瘤活性近年來倍受關注，許多研究探討了其抗增殖和誘導凋亡的作用機制[1]。本文將著重研究奧曲肽（octreotide,OCT）聯(lián)合細胞毒化療藥物長春新堿（VCR）的抗腫瘤效果及其作用機制，探討OCT是否能增強VCR的抗腫瘤活性，具有化療藥物增敏劑的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 人胃癌細胞系SGC-7901，由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院樊代明教授饋贈。胎牛血清（標準級），購自美國Hyclone公司。鼠抗人p53單克隆抗體，購自北京中山生物技術有限公司。生長抑素類似物--奧曲肽購自瑞士諾華公司。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細胞的培養(yǎng) 胃癌細胞SGC-7901培養(yǎng)于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640(含青霉素100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml)中 37 ℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，0.25%胰酶＋0.02%EDTA 消化，3～4 d傳代一次。

1.2.2 MTT實驗 取對數(shù)生長期的人胃癌細胞株SGC-7901，調(diào)整細胞濃度為 1×104/ml，接種于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，同時進行以下實驗。

1.2.2.1 OCT對胃癌細胞的抑制：實驗分組：（1）空白組，不含細胞和藥物。（2）對照組，含細胞不加藥物。（3）OCT組，每孔中加入OCT后其終濃度分別為1×10-3g/L、1×10-4g/L、1×10-5g/L、1×10-6g/L、1×10-7g/L、1×10-8g/L、1×10-9g/L。以上各組每個濃度均設 8 個平行復孔，培養(yǎng) 24 h 后加入 MTT（5mg/ml），培養(yǎng) 4 h，棄上清液，每孔加入DMSO，震蕩至MTT完全溶解，酶聯(lián)檢測儀600 nm處測吸光度，求抑制率。抑制率=（對照組OD-實驗組OD）/對照組OD×100%。

1.2.2.2 VCR對胃癌細胞的抑制：實驗分組：（1）空白組。（2）對照組。（3）VCR組，每孔中加入VCR后其終濃度分別為 1×10-4g/L、1×10-3g/L、2.5×10-3g/L、5×10-3g/L、7.5×10-3g/L、1×10-2g/L。方法同 1.2.2.1，求抑制率。

1.2.2.3 OCT聯(lián)合VCR對胃癌細胞的抑制：選擇濃度為1×10-5g/L的OCT，聯(lián)合5×10-3g/L的VCR，求抑制率。方法同1.2.2.1。

1.2.3 免疫組化法測定p53蛋白在胃癌細胞的表達

將實驗分為對照組、OCT 組（1×10-5g/L）、VCR組（5×10-3g/L）和 OCT+VCR 組，37 ℃，5%CO2孵育箱中培育24 h后棄去板中培養(yǎng)液，PBS沖洗，固定，室溫孵育，血清封閉，加鼠抗人p53單克隆抗體4℃過夜，次日加入山羊抗小鼠IgG，滴加SABC，加入DAB-H2O2顯色，顯微鏡觀察。在Olympus倒置光學顯微鏡下p53陽性細胞呈棕黃或棕黑色，與背景同色為陰性。而后200倍顯微鏡下計數(shù)5個視野，計算陽性細胞百分數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用t檢驗、方差分析、χ2檢驗進行處理。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對胃癌細胞增殖的影響

2.1.1 OCT對胃癌細胞的抑制 隨著OCT濃度由1×10-9g/L逐漸增加至1×10-5g/L時，其抑制率由7.9%逐漸增加至20.9%；但是繼續(xù)增加OCT濃度至1×10-3g/L，其抑制率反而下降至14.3%。即當濃度為1×10-5g/L時，OCT抑制率最大，其抑制率明顯高于對照組（P<0.05）。

2.1.2 VCR對胃癌細胞的抑制 隨著VCR濃度的增加，其抑制率也逐漸增加，由5.2%增加至53.6%，呈遞增趨勢。當VCR濃度為5μg/ml時，其抑制率為16.2%，為小于IC50的適宜濃度。

2.1.3 OCT聯(lián)合VCR對胃癌細胞的抑制 當OCT聯(lián)合VCR時，抑制率為42.3%，明顯高于VCR組，有統(tǒng)計學差異（P<0.05），見圖1。

2.2 OCT、VCR及OCT聯(lián)合VCR對胃癌細胞中p53蛋白表達的影響 OCT、VCR和OCT+VCR均可以上調(diào)p53的表達，與對照組相比有統(tǒng)計學差異（P<0.05），其中OCT+VCR聯(lián)合應用上調(diào)作用最明顯，見圖2。

3 討論

SSTA已用于許多臨床疾病的治療，如肝硬化食管靜脈曲張出血以及急性胰腺炎等，并取得良好療效。近年來，SSTA對腫瘤生長的抑制作用受到越來越多的關注，而且其副作用遠比臨床上常用的常規(guī)化療藥物低[2]。許多學者認為SSTA有可能成為惡性腫瘤生物治療新的、候選手段[3-5]。OCT為臨床中常用的人工合成的SSTA。

SSTA的抗腫瘤機制分為直接作用和間接作用。SSTA與存在于腫瘤細胞表面的生長抑素受體（somatostatin receptor,SSTR）結(jié)合發(fā)揮直接作用。SSTR亞型的研究顯示，SSTR3蛋白分布于正常胃黏膜的細胞膜、細胞質(zhì)或黏膜下間質(zhì)組織，在胃癌細胞膜上也有SSTR3蛋白表達。還有研究顯示胃癌腫瘤組織中存在5種SSTR亞型的表達，并以SSTR2的表達最為顯著[6-7]。多種腫瘤表達SSTR，SSTA與不同亞型SSTR具有高親和力，這是應用SSTA治療腫瘤的分子基礎[8]。SGC7901是人低分化胃腺癌細胞，已知其細胞膜表達SSTR2，3[9-10]。SSTA還可以抑制某些對腫瘤細胞生長有促進作用的激素和生長因子的分泌與釋放，如胰島素樣生長因子、表皮生長因子、胃泌素膽囊收縮素及胰島素等，抑制腫瘤血管形成以及誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮間接抗腫瘤作用。

本研究結(jié)果顯示，OCT作用于胃癌細胞系SGC-7901，隨著其濃度的增加抑制率也增加，當其濃度達到1×10-5g/L時，抑制率達到最大，為20.9%。但是如果濃度繼續(xù)增加，其抑制率反而下降，提示OCT對SGC-7901的抑制具有飽和性，這也間接提示了SGC-7901表面存在與OCT結(jié)合的SSTR。

實驗中，我們選取了不需體內(nèi)轉(zhuǎn)化的胃癌常用的植物抗癌藥VCR進行研究。為了便于觀察，我們選取了較低濃度的VCR（5×10-3g/L），在該濃度時其抑制率為16.2%。聯(lián)合OCT后其抑制率上升至42.3%。該結(jié)果提示二者聯(lián)合應用，可使VCR的抑制胃癌細胞生長的作用明顯增強。由此看出，OCT可能具有了VCR增敏劑的作用。

p53蛋白是細胞周期的“分子警察”，也是在DNA損傷后誘導凋亡的因子。一方面，p53蛋白通過上調(diào)p 21蛋白來介導細胞周期停滯，細胞周期停滯可以為DNA修復贏得時間；另一方面，如果細胞內(nèi)損傷已無法修復，則p53蛋白促進細胞凋亡。p53蛋白在細胞中的積累和活動引起了細胞凋亡，可以消除損傷細胞向癌細胞發(fā)展[11]。許多化療和放療均依賴p53誘導的凋亡途徑。本實驗結(jié)果顯示，OCT可以上調(diào)p53的表達，通過誘導細胞凋亡，達到抑制腫瘤細胞生長的目的。因此，我們推測OCT調(diào)控凋亡基因，可能是其抑癌的機制之一。已有研究表明化療藥物在體內(nèi)同樣誘導細胞凋亡，本實驗也證實了這一點。OCT聯(lián)合VCR后，增強了VCR上調(diào)p53的作用，使其陽性細胞指數(shù)由24.8%上升至30.8%。因此OCT在細胞凋亡水平可以增強VCR對腫瘤細胞的抑制作用。

OCT聯(lián)合應用較低濃度的VCR，可以達到與高濃度VCR相同的抑制胃癌細胞的效果，同時可以增強其誘導細胞凋亡的作用，這就為一種治療胃癌新方法的引入提供了細胞水平的實驗基礎。

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