孔 艷，付建茹，鄭少雄

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，天津 300211）

糖尿?。―M）是一種幾乎影響全身各系統(tǒng)的慢性疾病，也被公認(rèn)為男性性功能障礙的原因之一，可導(dǎo)致生育低下，影響男性患者的生殖功能[1]，可多層次地影響精子生成的內(nèi)分泌環(huán)境、精子生成的過(guò)程及損害勃起和射精[2]，動(dòng)物模型數(shù)據(jù)表明，糖尿病雄性動(dòng)物的繁殖力是顯著下降的[3-4]，精子的質(zhì)量也發(fā)生了損害[4-5]。DM與不育有關(guān)的諸多因素中包括一個(gè)重要的因素——內(nèi)分泌因素[6]。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）作為一種核內(nèi)多肽，對(duì)細(xì)胞由G1期向S期過(guò)渡起著重要的調(diào)節(jié)作用[7]，參與脫氧核糖核酸合成、復(fù)制、切割、修復(fù)，已被用來(lái)定量分析睪丸組織生殖細(xì)胞DNA合成，有效反映細(xì)胞增殖活性[8]。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是一個(gè)由1 186個(gè)氨基酸組成的分子量為170kDa的跨膜糖蛋白，能與EGF等因子結(jié)合，傳遞到細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)，加速核酸和蛋白質(zhì)的合成,促進(jìn)多種細(xì)胞分裂增殖、分化，對(duì)睪丸發(fā)育和精子發(fā)生有重要作用[7]。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)建立糖尿病模型探討PCNA及EGFR作為兩種影響生殖功能的因子，對(duì)正常及不同病程糖尿病SD大鼠睪丸功能的影響，并觀察睪丸形態(tài)，為DM雄性生殖功能障礙的發(fā)病機(jī)制和治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠30只，自由飲水進(jìn)食，隨機(jī)分為正常組（A組）10只,予生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)組20只，每日給予高脂高糖乳劑灌胃。兩組每日均自由進(jìn)食飼料，6周后實(shí)驗(yàn)組空腹12 h后予小劑量鏈脲佐菌素 (STZ，Sigma公司)按30mg／kg體重尾靜脈注射誘導(dǎo)2型糖尿病模型。而正常對(duì)照組大鼠均予等量無(wú)菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液尾靜脈注射。以FPG≥16.7mmol/L為診斷糖尿病大鼠的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠于第8周造模成功。后繼續(xù)維持高糖高脂飲食，并分為DM 4周組（B組）和DM 8周組（C組）大鼠各10只，分別于4周后、8周后處死。

1.2 試劑 鼠抗大鼠PCNA，兔抗大鼠EGFR,ABC試劑盒及DAB顯色劑、胰島素放免試劑盒、睪酮測(cè)定試劑盒、血脂4項(xiàng)試劑盒均購(gòu)于天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司。小劑量STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 指標(biāo)測(cè)定 斷尾取血，用羅氏血糖儀測(cè)定血糖值(每次測(cè)血糖前一天晚上禁食，次日晨9時(shí)測(cè)空腹血糖)；腹主動(dòng)脈取血離心收集血清置于-70℃冰箱中待測(cè)胰島素、糖化血清蛋白等。放免法檢測(cè)血清胰島素；比色法檢測(cè)血清糖化血清蛋白；化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清睪酮。

1.4 切片制備 頸脫臼處死后，取雙側(cè)睪丸，稱重，10%甲醛固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋，制成連續(xù)5μm的切片，裱于覆有APES的載玻片上。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 切片經(jīng)脫蠟，蒸餾水沖洗，PBS沖洗3min/次，共3次，打孔液浸泡10min，3%H2O2去離子水孵育5~10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性，PBS沖洗，熱修復(fù)15min，復(fù)溫至室溫后消化液37℃進(jìn)行消化10min,PBS沖洗3min/次，共3次，山羊血清封閉30min。棄去上層液，務(wù)須沖洗，按常規(guī)ABC染色方法進(jìn)行以下步驟：PCNA一抗?jié)舛葹?∶50，標(biāo)本置濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜；然后滴加生物素化二抗（1∶200）37 ℃孵育 30 min；最后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素（1∶200），37℃孵育30min，DAB顯色后蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水片。每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)3張切片，每張切片檢查10個(gè)高倍視野,隨機(jī)選取組織結(jié)構(gòu)保存較好的曲細(xì)精管,計(jì)算免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。EGFR按常規(guī)ABC染色方法進(jìn)行，EGFR一抗?jié)舛葹?∶50，標(biāo)本置濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜；然后滴加生物素化二抗（1∶200）37℃孵育30min；最后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素（1∶200），37℃孵育30min，DAB顯色后蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水片。每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)3張切片,每張切片檢查10個(gè)高倍視野，隨機(jī)選取組織結(jié)構(gòu)保存較好的曲細(xì)精管，計(jì)算免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

1.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，方差分析、SNK法比較3組間的差異、線性相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 3組間的血脂值比較 見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠的血脂水平比較,mmol/L)

表1 3組大鼠的血脂水平比較,mmol/L)

與正常組比較*P＜0.05；與正常組，糖尿病組內(nèi)比較**P＜0.05；糖尿病組內(nèi)比較#P＜0.05

TG 1.198±0.232 1.484±0.286*1.777±0.379**9.021 0.001 n 10 10 10 HDL 0.821±0.178 1.002±0.259 1.333±0.319**10.077 0.001 TC 1.969±0.192 3.209±0.793*3.199±0.803*11.643＜0.05組別A組B組C組FP LDL 0.411±0.089 0.536±0.234#0.349±0.067#4.032 0.029 VLDL 0.850±0.103 1.367±0.481*1.089±0.271 6.361 0.005

2.2 3組間糖化血清蛋白、血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)及體重比較 見(jiàn)表2。隨著病程的增加，糖化血清蛋白升高，3組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；糖尿病大鼠空腹血糖水平、胰島素抵抗指數(shù)高于正常組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但4周組與8周組大鼠沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；正常組與4周組大鼠空腹胰島素水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而8周組大鼠的胰島素水平較正常組及4周組大鼠升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；糖尿病大鼠的體重低于正常組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但4周組與8周組大鼠比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 3組大鼠的糖化血清蛋白、血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)及體重比較

表2 3組大鼠的糖化血清蛋白、血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)及體重比較

與正常組比較*P＜0.05；與正常組，糖尿病組內(nèi)比較**P＜0.05

n 10 10 10組別A組B組C組FP胰島素（uIU/m l）10.390±2.798 11.890±2.675 14.360±1.952**6.416 0.005胰島素抵抗指數(shù)2.529±0.678 11.937±3.026*14.032±3.658*48.959＜0.05血糖（mmol/L）5.500±0.422 22.520±2.089*21.920±4.457*114.646＜0.05體重（g）454.800±24.082 301.800±37.676*291.200±31.051*84.839＜0.05糖化血清蛋白（mmol/L）73.240±9.204 123.360±14.806**151.22±10.000**115.974＜0.05

2.3 3組間睪丸重量、PCNA、EGFR及睪酮比較 見(jiàn)表3。隨著病程的增加，糖尿病組睪丸重量、睪丸組織PCNA、EGFR免疫陽(yáng)性細(xì)胞百分率值、血清睪酮較正常組下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而4周組與8周組大鼠之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但PCNA、EGFR與血糖的變化趨勢(shì)是相反的，PCNA與血糖之間的相關(guān)系數(shù)是r=-0.665，EGFR與血糖之間的相關(guān)系數(shù)是r=-0.540，兩者與血糖均呈負(fù)相關(guān)。PCNA、EGFR與睪丸重量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.496（P=0.009），r=0.454（P=0.012）。PCNA 與血清睪酮水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 r=0.538（P=0.002），EGFR與血清睪酮水平無(wú)相關(guān)性（P=0.086），PCNA及EGFR在睪丸組織中表達(dá)分別見(jiàn)圖1、2。

表3 3組大鼠睪丸重量、睪酮、PCNA及EGFR免疫陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較

表3 3組大鼠睪丸重量、睪酮、PCNA及EGFR免疫陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較

與正常組比較*P＜0.05

n 10 10 10組別A組B組C組FP睪丸重量(g)3.350±0.207 2.790±0.536*3.000±0.205*6.443 0.005 EGFR(%)0.283±0.037 0.245±0.028*0.225±0.026*9.408 0.001 PCNA(%)0.268±0.0 27 0.229±0.027*0.212±0.017*14.258＜0.05睪酮(ng/ml)2.934±2.218 0.153±0.048*0.481±0.152*11.801＜0.05

免疫陽(yáng)性產(chǎn)物位于細(xì)胞核,陽(yáng)性顆粒為淺黃色至棕黃色,通常呈顆粒狀,小部分呈彌散狀。免疫陽(yáng)性細(xì)胞包括精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞,少數(shù)支持細(xì)胞也有著色。免疫組化示糖尿病組較正常組棕黃色較深；8周組較4周組大鼠睪丸組織PCNA表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顏色幾乎相當(dāng)。

正常和糖尿病大鼠睪丸精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均呈陽(yáng)性反應(yīng)，且免疫陽(yáng)性產(chǎn)物呈細(xì)顆粒狀，彌散分布于細(xì)胞漿或包膜下，部分在細(xì)胞核上也有分布，但間質(zhì)細(xì)胞免疫陽(yáng)性較其他細(xì)胞為弱。免疫組化示糖尿病組較正常組棕黃色較深；但8周組大鼠較4周組大鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顏色相差不是很大。

3 討論

DM患者常有睪丸功能異常,特別是血中游離睪酮水平降低,雌二醇水平反而升高,而且隨著病程的延長(zhǎng)而加重，內(nèi)分泌功能的異常是常見(jiàn)可治的性功能障礙或生殖功能障礙的發(fā)病原因之一[6]。糖尿病對(duì)睪丸組織PCNA表達(dá)起負(fù)相作用，而且隨糖尿病病程進(jìn)展即血糖升高,PCNA表達(dá)呈明顯下降趨勢(shì),說(shuō)明糖尿病可以損傷睪丸功能[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明糖尿病4周及8周組大鼠睪丸組織的PCNA表達(dá)的陽(yáng)性率顯著低于正常組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，糖尿病4周組和8周組間PCNA的表達(dá)陽(yáng)性率雖然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是睪丸組織中PCNA的變化與血糖是呈負(fù)相關(guān)的。生長(zhǎng)因子如EGF、TGF-α，下丘腦、腺垂體或激素受體異常也可能是男性功能障礙的原因之一，糖尿病神經(jīng)病變所致的男性功能障礙更為常見(jiàn)[9]。部分男性不育患者體內(nèi)激素水平之所以正常，是由于大量的調(diào)節(jié)因子如生長(zhǎng)因子對(duì)維持正常生殖能力發(fā)揮了重要的作用，因此局部生長(zhǎng)因子不適當(dāng)?shù)暮铣珊歪尫旁诤艽蟪潭壬嫌绊懩行孕韵俚淖苑置诤?或旁分泌途徑，進(jìn)而可能導(dǎo)致睪丸功能障礙[10]。

PCNA在睪丸生精細(xì)胞胞核內(nèi)表達(dá),且主要見(jiàn)于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞，精子細(xì)胞少見(jiàn)。它既促進(jìn)精原細(xì)胞的有絲分裂,又促進(jìn)精母細(xì)胞的減數(shù)分裂,從而加速精子的生成。睪丸內(nèi)細(xì)胞增殖對(duì)補(bǔ)充足夠的生精細(xì)胞和體細(xì)胞、維持正常成年人生精是非常重要的[11]。在糖尿病對(duì)精子影響研究中發(fā)現(xiàn)DM大鼠的睪丸直徑、平均曲細(xì)精管直徑及PCNA指數(shù)明顯下降，病理學(xué)顯示糖尿病大鼠睪丸組織生殖細(xì)胞塌陷和彌漫缺乏[9]。Seethalakshmi等[12]研究顯示糖尿病大鼠睪丸重量顯著下降。另有報(bào)道，與正常人相比，糖尿病患者的血漿睪酮水平是降低的[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示糖尿病組睪丸重量、血清睪酮水平較正常組下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，4周組較8周組大鼠比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但PCNA與睪丸重量及睪酮水平具有正相關(guān)性。D’Andrea等[14]應(yīng)用免疫病理法檢測(cè)暴露在有毒物質(zhì)環(huán)境中大鼠睪丸組織的PCNA PI（增值指數(shù)），發(fā)現(xiàn)它能敏感、可靠、早期評(píng)估與大鼠睪丸增生程度有關(guān)的毒性作用。臨床研究顯示正常人睪丸的PCNA PI平均值約86.5%，而不育患者即生殖細(xì)胞無(wú)精子產(chǎn)生，PI為0[15]。因?yàn)镻CNA與精子密度密切相關(guān)，其合成減少可能是患者精子發(fā)生紊亂的原因，因此它是檢測(cè)不育患者生殖細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的有用的分子標(biāo)記，并可作為患者臨床治療前后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[16]。

EGFR作為T(mén)GF-α和EGF的一種雙重受體，能促進(jìn)睪丸細(xì)胞增殖，維持正常睪丸大小。此外生長(zhǎng)刺激激素，如卵泡刺激素和睪酮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α和EGFR表達(dá)[17]。生精過(guò)程中，EGF與EGFR結(jié)合影響靶細(xì)胞——Sertoli和Leydig細(xì)胞的功能，從而改變雄激素的合成或其他因子的分泌，或通過(guò)旁分泌方式調(diào)節(jié)管周肌樣細(xì)胞與生殖細(xì)胞相互作用。EGF可抑制Sertoli細(xì)胞中芳香化酶將睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇，維持局部高濃度的睪酮[18]；EGF可影響Leydig細(xì)胞分泌睪酮的能力，能提高線粒體中細(xì)胞色素P450對(duì)膽固醇底物的利用,增加3β2羥甾脫氫酶的活性,顯著促使Δ52孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為孕酮,促進(jìn)睪酮合成[19]。EGFR對(duì)精子生成、睪丸支持細(xì)胞和管周細(xì)胞之間相互作用有重要影響，并影響精子細(xì)胞生殖力、胚胎質(zhì)量和懷孕[20]。EGFR還可通過(guò)改變直接刺激因子的基因表達(dá)，間接激發(fā)精原細(xì)胞增殖，也可以作為額外的內(nèi)分泌因子，與內(nèi)分泌因素如卵泡刺激素共同來(lái)調(diào)節(jié)精原細(xì)胞增殖；與EGFR相關(guān)的受體有ErbB1、ErbB2、ErbB4等，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路有MAPK級(jí)聯(lián)和PI3K級(jí)聯(lián)途徑[21]。羊駝EGF和EGFR細(xì)胞特異性表達(dá)在發(fā)育中和青春期后睪丸組織，這種特定時(shí)期的表達(dá)顯示出其在睪丸發(fā)育和功能調(diào)節(jié)方面具有重要的作用[22]。大鼠EGFR基因的剔除已經(jīng)證明睪丸的發(fā)育發(fā)生了改變[23]。有推斷EGFR的減少使EGF與受體結(jié)合減少，第二信使cAMP和第三信使c-Fos均減少，以致核轉(zhuǎn)錄和核基因PCNA的表達(dá)減弱[24]。

本項(xiàng)研究受實(shí)驗(yàn)設(shè)施、SD大鼠例數(shù)等實(shí)驗(yàn)條件的限制及溫度、濕度等環(huán)境因素影響，沒(méi)有觀察到4周與8周組間大鼠睪丸PCNA及EGFR表達(dá)的差別。從文獻(xiàn)報(bào)道[25]推測(cè)是由于一種抗氧化蛋白-金屬硫蛋白Metallothionein(MT)的過(guò)表達(dá)能夠保護(hù)B細(xì)胞的DNA免受損傷，影響DM大鼠成?？赡軐?dǎo)致DM病程組4周和8周大鼠的血糖、胰島素水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但我們?nèi)匀豢傻贸鼋Y(jié)論：PCNA及EGFR在糖尿病大鼠睪丸表達(dá)減少，在一定程度上影響了睪丸生精和睪酮分泌，并使睪丸重量下降，并且隨糖尿病病情的加重而惡化，導(dǎo)致不同程度的生殖系統(tǒng)功能障礙。

[1]Salama M,TsujiM,Tamura M,et al.Impact of aging and diabetes mellitus on the expression of the proliferating cell nuclear antigen in rat testicular tissue[J].Arch Androl,1998,40(2):95

[2]Sexton WJ,Jarow JP.Effect of diabetesmellitus upon male reproductive function[J].Urology,1997,49(4):508

[3]Ballester J,MunozMC,Dominguez J,etal.Insulin-dependent diabetes affects testicular function by FSH-and LH-linked mechanisms[J].JAndrol,2004,25(5):706

[4]ScaranoWR,Messias AG,Oliva SU,etal.Sexual behaviour,sperm quantity and quality after short-term streptozotocininduced hyperglycaemia in rats[J].Int JAndrol,2006,29(4):482

[5]Amaral S,Moreno AJ,SantosMS,etal.Effectsofhyperglycemia on sperm and testicular cells of Goto-Kakizaki and streptozotocintreated ratmodels fordiabetes[J].Theriogenology,2006,66(9):2056

[6]白炳生，姚凱聲，單立剛.糖尿病所致雄性生殖功能障礙的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2008，3(30):199

[7]岳鳳鳴,杜心欣,高福祿,等.糖尿病對(duì)小鼠睪丸組織中PCNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)男科學(xué)雜志,2001,15(3):154

[8]Cameron DF,Rountree RE,ShultzD,etal.Sustained hyperglycemia results in testicular dysfunction and reduced fertility potential in BBWOR diabetic rats[J].Am JPhysiol,1990,259(6 Pt1):E881

[9]Altay B,Cetinkalp S,Doganavsargil B,etal.Streptozotocin-induced diabetic effects on spermatogenesis with proliferative cell nuclear antigen immunostainingofadult rat testis[J].Fertil Steril,2003,80(2):828

[10]Kassab M,Abd-Elmaksoud A,AliMA.Localization of the epidermal growth factor (EGF)and epidermal growth factor receptor(EGFR)in thebovine testis[J].JMolHistol,2007,38(3):207

[11]Schmahl J,Eicher EM,Washburn LL,etal.Sry induced cellproliferation in themousegonad[J].Development,2000,127(6):65

[12]Seethalakshmi L,Menon M,Diamond D.The effect of streptozotocininduced diabetes on the neuroendocrine male reproductive tractaxisof theadult rat[J].JUrol,1987,138(1):190

[13]IAndo S,RubensR,RottiersR.Androgen plasma levels inmale diabetics[J].JEndocrinol Invest,1984,7(1):21

[14]D’Andrea MR,Lawrence D,Nagele RG,etal.PCNA indexing asa preclinical immunohistochemical biomarker for testicular toxicity[J].JBiotech Histochem,2008,83(5):211

[15]Zeng L,Kong XT,Su JW,etal.Evaluation of germ-cell kinetics in infertilepatientswith proliferating cellnuclear antigen proliferating index[J].JAsian JAndrol,2001,3(1):63

[16]Salama N,TsujiM,Tamura M,etal.Proliferating cell nuclear antigen in testes of infertilemen with varicocele--preliminary results of interrelationship with sperm countbeforeand after varicocelectomy[J].Scand JUrolNephrol,2003,37(1):48

[17]Cupp AS,Skinner MK.Expression,action,and regulation of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor duringembryonic and perinatal rat testisdevelopment[J].JAndrol,2001,22(6):1019

[18]于軍橋,邵繼春,王久源.表皮生長(zhǎng)因子及其受體對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的影響[J].四川生理科學(xué)雜志，2002，24(1):4

[19]SordoulletC,Chauvin MA,Hendrick JC,etal.Sites of interaction between epidermal growth factor and transforminggrowth factor beta in the control of steroidogenesis in cultured porcine leydig cells[J].Endocrinology,1992,130(3):1352

[20]Erdog贊ru T,Gülkesen KH,BahceciM,etal.The roleofexpression of extracellularmatrix proteins and epidermal growth factor receptor activity on fertilization capacity of testicular harvested spermatozoa[J].Andrologia,2002,34(2):98

[21]AbéK,Eto K,AbéS.Epidermal growth factormediates spermatogonial proliferation in newt testis[J].JReprod Biol Endocrinol,2008,6(6):7

[22]He J,Dong C,You R,etal.Localization of epidermal growth factor(EGF)and its receptor(EGFR)duringpostnatal testisdevelopmentin thealpaca(Lamapacos)[J].JAnimalReprod Sci,2009,116(1/2):155

[23]Levine E,Miyashiro L,Skinner MK.Role of transforming growth factor alpha related ligands and the epidermal growth factor receptor in embryonic testisdevelopment[J].BiolReprod,2000,62(2):477

[24]高福祿，岳鳳鳴，龐曉靜，等.db/db自發(fā)型糖尿病小鼠睪丸EGFR，c-Fos表達(dá)研究[J].解剖學(xué)雜志，2001，24(6):532

[25]Chen H,Carlson EC,Pellet L,et al.Overexpression ofmetallothionein in pancreatic beta-cells reduces streptozotocin induced DNA damageand diabetes[J].Diabetes,2001,50(9):2040