武慧麗 ，李 新 ，王紀(jì)佐

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)科，天津 300211；2.武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）

隨著介入治療成為心肌梗死、動(dòng)脈栓塞及缺血性腦血管病得力的治療手段，缺血再灌注損傷日益受到關(guān)注。心肌梗死后，缺血再灌注損傷發(fā)生于再灌注早期，主要病理變化是血管內(nèi)皮功能失調(diào)、心肌收縮功能下降、心肌細(xì)胞壞死和凋亡。12 h內(nèi)梗死區(qū)，尤其是收縮帶有凋亡心肌細(xì)胞存在，提示缺血再灌注損傷的主要病理表現(xiàn)是細(xì)胞凋亡。2003年Zhao等[1]首先用犬心肌缺血再灌注模型，于再灌注開始時(shí)連續(xù)3次，每次30 s再灌注，30 s閉塞，發(fā)現(xiàn)其可減輕再灌注損傷，限制梗死范圍，減輕缺血心肌的組織水腫和中性粒細(xì)胞積聚，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。此法對(duì)缺血/再灌注心肌的保護(hù)作用被命名為“缺血后適應(yīng)（ischemic postconditioning，IP）”。已有大量研究證實(shí)IP對(duì)缺血再灌注的心肌有保護(hù)作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)IP可能對(duì)缺血腦組織也有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過提高腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）后的抗氧化能力，保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)與功能，從而減輕I/R對(duì)腦組織的損傷[2-3]。IP能否影響I/R損傷腦組織中細(xì)胞凋亡，尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動(dòng)脈線拴法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，研究IP對(duì)大鼠局灶性腦I/R損傷后細(xì)胞凋亡的影響及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 P38單克隆抗體、Caspase-3單克隆抗體購(gòu)自Santa CruzCA公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/兔抗小鼠IgG購(gòu)自鼎國(guó)生物制品公司；Western blotting檢測(cè)試劑盒，BCA試驗(yàn)盒，TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試驗(yàn)盒，化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量250~300 g，由武警醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、腦缺血再灌注組（I/R）和缺血后適應(yīng)組（IP），每組10只動(dòng)物。

1.2.2 動(dòng)物模型的制備 Longa法[4]制作大鼠局灶性腦I/R模型：大鼠稱重，腹腔注射體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛300mg/kg麻醉，做頸部正中切口，暴露右頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈距其始端約2mm處做一小切口，將3-0尼龍線一端烤成小球形經(jīng)切口處插入頸外動(dòng)脈，再經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈至大腦中動(dòng)脈始端，栓塞大腦中動(dòng)脈，造成局灶性腦缺血，大鼠腦缺血90min后，拔出尼龍線，恢復(fù)腦組織供血，24 h后取材。Sham組大鼠在尼龍線小球端插入至大腦中動(dòng)脈始端后，立即拔出。IP組在缺血90min后再灌注開始時(shí)將尼龍線拔出5mm，恢復(fù)腦血流20 s；再將尼龍線放進(jìn)5mm，阻塞腦血流20 s，按上述時(shí)間循環(huán)3次后進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間血流再灌注。

1.2.3 神經(jīng)病學(xué)評(píng)分 手術(shù)后功能缺損按Longa5分制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：0分，無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1分，不能完全伸展左前肢；2分，向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，行走時(shí)向左側(cè)傾倒；4分，不能自行行走，有意識(shí)障礙。累積1分以上即為成功模型。動(dòng)物蘇醒后，觀察缺血?jiǎng)游锏纳窠?jīng)功能缺失癥狀。

1.2.4 取材 腦缺血再灌注24 h后，用10%水合氯醛(300mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。每組5只大鼠開胸經(jīng)左心室至主動(dòng)脈插管，并以止血鉗固定，剪開右心耳，先快速灌注生理鹽水100ml左右，然后灌注4℃的4%多聚甲醛磷酸緩沖液400~600ml。斷頭取腦，腦組織置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定1~2 h，再放入30%蔗糖溶液浸泡沉底。恒冷箱切片機(jī)冠狀連續(xù)切片，片厚10μm，用于凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。其余5只大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取腦，于冰上分離缺血側(cè)頂葉皮層腦組織，用冰生理鹽水沖洗后，迅速置于液氮罐中低溫保存用于免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè) P38、Caspase-3 的蛋白表達(dá)。

1.2.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 腦組織按1.2.4處理，制成10μm的冰凍切片，按試劑盒說明進(jìn)行操作。光鏡下，腦組織切片中細(xì)胞呈棕色者為陽性細(xì)胞。高倍鏡下隨機(jī)選取每張切片梗死周邊組織5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率，取平均值。凋亡細(xì)胞百分率=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 Western blotting 采用常規(guī)Western blotting檢測(cè)方法進(jìn)行操作。等量蛋白樣品經(jīng)10%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離后,以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用新鮮配制的含3%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）封閉，然后加入P38兔單克隆抗體 (1∶500)，Caspase-3 鼠單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃反應(yīng)過夜。將膜取出，用PBS洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(山羊抗兔/兔抗小鼠IgG)孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法或X-線片記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差分析有顯著差異時(shí)，進(jìn)一步用q檢驗(yàn)作兩兩比較，P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 缺血后適應(yīng)對(duì)神經(jīng)病學(xué)評(píng)分的影響 I/R組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，大多表現(xiàn)為不同程度的左側(cè)前肢屈曲、向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，行走時(shí)向左側(cè)傾倒。Sham組大鼠有3只出現(xiàn)左前肢輕度屈曲癥狀。IP組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀比I/R組明顯減輕。各組評(píng)分相比較，差異有顯著性（P<0.01），見表1。

2.2 缺血后適應(yīng)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 Sham組偶見凋亡細(xì)胞，I/R組缺血區(qū)可見較多凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核著色深，主要見于梗死灶周圍，與Sham組比較有顯著差異（P<0.01）。IP組凋亡細(xì)胞百分率明顯減少，胞核顏色明顯變淺，與I/R組比較差異顯著（P<0.01），見表 l。

表1 缺血后適應(yīng)對(duì)神經(jīng)病學(xué)評(píng)分和細(xì)胞凋亡的影響

2.3 缺血后適應(yīng)對(duì)P38和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 P38和Caspase-3蛋白表達(dá)在Sham組呈較低水平。I/R組大鼠，局灶性腦缺血再灌注后，兩種蛋白表達(dá)均明顯升高。在IP組，兩種蛋白表達(dá)較I/R組均明顯降低，但仍高于Sham組。表明缺血后適應(yīng)明顯減少缺血后再灌注腦組織中P38和Caspase-3的表達(dá)，見圖1。

3 討論

缺血后適應(yīng)是機(jī)體對(duì)缺血性損傷的一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，它可以通過抑制活性氧的產(chǎn)生[5]、抑制炎癥反應(yīng)[6]、減少凋亡的發(fā)生[5]，減輕缺血心肌細(xì)胞的損傷。有文獻(xiàn)報(bào)道[2-3，7]在腦的缺血后適應(yīng)研究中，缺血后適應(yīng)提高腦組織對(duì)缺血缺氧的耐受性,減少神經(jīng)元凋亡，抑制p53、Bax表達(dá)，增加線粒體Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、SOD 活性，對(duì)腦缺血再灌注產(chǎn)生保護(hù)作用。近年來研究表明，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與腦缺血－再灌注損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[8]。P38是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要成員之一，是將胞外信息傳遞到胞核的重要介導(dǎo)者。Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3參與了腦缺血后神經(jīng)元損傷的病理過程[9]。缺血后適應(yīng)減少大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用機(jī)制是否與抑制P38和Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大鼠腦缺血再灌注后凋亡細(xì)胞數(shù)量、P38和Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高，而缺血后適應(yīng)組凋亡細(xì)胞數(shù)量、P38和Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著低于缺血再灌注組。P38及Caspase-3在缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡中起著重要的作用。本研究結(jié)果提示缺血后適應(yīng)抑制缺血后腦組織中P38蛋白表達(dá)，從而可能減輕MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡；另一方面缺血后適應(yīng)可減少Caspase-3蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，減輕腦缺血再灌注損傷的程度。

缺血后適應(yīng)的干預(yù)過程簡(jiǎn)單，臨床可操作性強(qiáng)，無疑對(duì)介入動(dòng)脈取栓，縮小梗死面積，減少對(duì)重要臟器的損害，改善生活質(zhì)量，提高患者的生存率具有重要意義，因此具有良好的臨床應(yīng)用前景。腦血管的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及腦組織對(duì)缺血的耐受特性，使腦缺血后適應(yīng)的實(shí)施時(shí)間窗及實(shí)施方法尚有待于深入研究，然而對(duì)于腦梗死早期血管成形術(shù)或介入治療血管再通過程中，后適應(yīng)可能有助于減少再灌注損傷，從而提高再灌注治療的療效。

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