董嘉良 ，康少平 ，康英姿 ，于公元 ，張艷君

（1.天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，天津 300070；2.河北北方學(xué)院）

2003年Zhao等[1]首先提出缺血后處理（ischemic postconditioning,I-postC）的概念，并且用實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺血后處理對再灌注后心肌具保護(hù)效果,但后處理的保護(hù)作用機(jī)制尚不明了。一氧化氮 (Nitric oxid,NO)對缺血-再灌注(I/R)損傷心肌有著十分重要的作用,但其作用一直存在“保護(hù)作用”和“毒性作用”兩種矛盾觀點(diǎn)[2-3]。本文通過比較缺血再灌注損傷與缺血后處理以及使用一氧化氮合酶（Nitric oxide synthas,NOS）激動劑與抑制劑時NO的量與NOS活性以及心臟損傷程度，探討NO在缺血后處理心肌保護(hù)效果中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性Wistar大鼠64只，體重300～350 g。隨機(jī)分為4組，缺血再灌注組（對照組）、缺血后處理組（實(shí)驗(yàn)組）、再灌注損傷+L-精氨酸組（L-Arg）（激動劑組）與缺血后處理+L-硝基精氨酸組（L-NNA）（抑制劑組）。每組16只，4只做心肌梗死面積測定，其余做NO含量、NOS活性及LDH活性測定。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 LC98高效液相色譜儀，可變波長光譜檢測器，BWALCN-2000雙通道色譜工作站，μ-Bondapak C18反相色譜柱，CF-2000D超純水器，UV-2450紫外/可見分光光度計(jì)，酸度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)步驟 乙醚麻醉大鼠，在其股動脈內(nèi)注入肝素抗凝（如未找到股動脈，直接肌肉注射）。迅速打開胸腔，取出心臟，制成Langendorff離體心臟模型。用95%O2與5%CO2混合氣平衡的37℃Kerbs液，經(jīng)主動脈灌注平衡10min，接取末3min灌流液,此為平衡末樣本。

（1）對照組：全心肌缺血30min，再灌注120min，接取灌注后前3min灌注液。灌流液為Kerbs液。(2)實(shí)驗(yàn)組：全心肌缺血30min，再灌注30 s，梗死30 s,重復(fù)3次后再灌注117min，接取灌注后前3min灌注液。灌流液為Kerbs液。（3）激動劑組：全心肌缺血30min，再灌注120min，接取灌注后前3min灌注液。灌流液為1mmol/LL-Arg的Kerbs液。（4）抑制劑組：全心肌缺血 30min，再灌注30 s，梗死30 s,重復(fù)3次后再灌注117min,接取灌注后前3min灌注液。灌流液為1mmol/LL-NNA的Kerbs液。灌注后前3min灌注液為處理后樣本。

1.3.3 NOS活性檢測 NOS可催化L-Arg生成中間產(chǎn)物對羥基-左旋精氨酸，繼續(xù)氧化后生成NO和L-瓜氨酸?？赏ㄟ^檢測L-瓜氨酸生成量計(jì)算NOS活性，用酶反應(yīng)體系中1min生成的L-瓜氨酸量來表示心臟中NOS活性（圖2）。

心臟勻漿后10 000 r/min離心30min，留取上清液并測定其濃度。1ml反應(yīng)體系（1mmol/LL-Arg 100 μl，1mmol/L CaCl2100 μl，50mmol/L Tris-HCl 700 μl，上清液 100 μl）37 ℃ 避光孵化 80min，用5%冰乙酸0.5ml終止反應(yīng)，用KOH滴定至pH 7.0，記錄總體積。10 000 r/min離心5min,取上清液上柱。流動相：6mmol/L H2SO4；流速0.5ml/min,檢測波長210 nm。

1.3.4 LDH活性測定 采用離體心臟灌流模式，杜絕其他器官干擾以提高其特異性。

LDH催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+。反應(yīng)中NADH脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD+，NADH在340 nm波長處有光吸收，而NAD+在此波長處無光吸收，因此可通過340 nm波長處光吸收的減少值，測定LDH的活性。

取2只石英比色杯，向其中一只比色杯中加入1ml53mmol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液 (pH 7.5)作為對照，向另一只比色杯中依次加入0.63mmol/L丙酸酮鈉溶液 0.9ml、11mmol/L NADH溶液0.1ml，加蓋搖勻后測定其光吸收值(A340nm)。向樣品杯中加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液100μl，迅速搖勻后，每隔30 s測A340nm，連續(xù)測定30min。以A340nm對反應(yīng)時間作圖，計(jì)算每分鐘A340nm的減少值。按下列公式計(jì)算LDH的活性：

1.3.5 心肌梗死面積 每組取大鼠4只觀察心肌梗死面積。將心臟置于2%的TTC磷酸緩沖液（pH 7.4）中染色，梗死區(qū)為白色，非梗死區(qū)為紅色。用Scion image軟件分析，計(jì)算梗死面積/總面積百分比。

2 結(jié)果

2.1 NO測定結(jié)果 平衡末，4組之間冠狀動脈循環(huán)液中NO含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對照組處理后與平衡末NO含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組后處理后與平衡末NO含量相比顯著升高；對照組處理后與實(shí)驗(yàn)組后處理后NO含量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；激動劑組再灌注后與平衡末NO含量相比顯著升高；激動劑組再灌注后與對照組處理后NO含量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；抑制劑組后處理后與平衡末NO含量相比顯著升高；抑制劑組后處理后與實(shí)驗(yàn)組后處理后NO含量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表 1）。

表1 4組兩個時段NO含量

表1 4組兩個時段NO含量

與各組平衡末比較*P、**P、★P均<0.05；與對照組處理后比較※P、※※P 均<0.05；與實(shí)驗(yàn)組處理后比較 ◆P<0.05

平衡末(nmol/L)11.380±2.173 8.625±3.323 9.173±2.715 9.974±3.017例數(shù)12 12 12 12處理后(nmol/L)11.904±4.251 19.373±5.319*※15.879±5.327**※※15.187±4.972★◆組別對照組實(shí)驗(yàn)組激動劑組抑制劑組

2.2 NOS活性與LDH活性測定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組、激動劑組及抑制劑組心肌組織NOS活性均明顯高于對照組；實(shí)驗(yàn)組心肌組織NOS活性高于激動劑組與抑制劑組。實(shí)驗(yàn)組、激動劑組及抑制劑組LDH活性均顯著低于對照組；實(shí)驗(yàn)組心肌組織LDH活性低于激動劑組與抑制劑組（表2）。

2.3 梗死面積比較 實(shí)驗(yàn)組與對照組梗死面積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；激動劑組及抑制劑組心肌梗死面積均低于對照組（表3）。

表 2 4組 NOS 活性、LDH 活性比較

表 2 4組 NOS 活性、LDH 活性比較

與對照組比較▲P、▲▲P、▲▲▲P 均<0.05,與實(shí)驗(yàn)組比較 ●P<0.05,與對照組比較★P、★★P、★★★P 均<0.05,與實(shí)驗(yàn)組比較 ◆P<0.05

NOS 活性（U/g）11.99±1.73 21.15±3.06▲16.14±1.94▲▲●16.79±2.17▲▲▲例數(shù)12 12 12 12 LDH 活性（U/g）115.3±23.8 29.1±5.6★57.9±9.4★★◆62.3±10.1★★★組別對照組實(shí)驗(yàn)組激動劑組抑制劑組

表 3 4組梗死面積比較

表 3 4組梗死面積比較

與對照組比較 ▲P、▲▲P、▲▲▲P 均<0.05,與實(shí)驗(yàn)組比較 ◆P<0.05

梗死面積（%）40.21±3.24 15.32±2.05▲25.18±2.37▲▲◆27.37±3.01▲▲▲例數(shù)4444組別對照組實(shí)驗(yàn)組激動劑組抑制劑組

3 討論

NO是由NOS在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、四氫生物喋呤(BH4)等輔基存在的條件下催化L-Arg末端胍基中的1個氨原子氧化而生成的。NOS是NO合成的關(guān)鍵酶，根據(jù)其存在的部位及作用機(jī)制的差異，分為原生型 NOS(constitutive NOS，cNOS)和誘生型 NOS（inducible NOS，iNOS 或 NOS2）2 類。cNOS為Ca2+/鈣調(diào)素信賴型，對其分子水平研究顯示源于內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)原的表達(dá)產(chǎn)物基因序列并不一樣，又分為內(nèi)皮型NOS（eNOS或NOS3)和神經(jīng)元型NOS（nNOS或NOS1），eNOS在生理?xiàng)l件下根據(jù)需要合成及釋放少量NO（pmol水平）。誘導(dǎo)型NOS（iNOS）系非Ca2+依賴性。生理?xiàng)l件下并無活性，一般情況不表達(dá)，當(dāng)受到刺激時（如內(nèi)毒素、TNF-α、IL-6等）迅速產(chǎn)生大量（nmol水平）NO，發(fā)揮效應(yīng)。

NO是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的強(qiáng)大舒血管物質(zhì),可通過彌散或載體轉(zhuǎn)運(yùn)至血管平滑肌,活化細(xì)胞內(nèi)鳥苷酸環(huán)化酶，使環(huán)磷鳥苷（cGMP）升高而擴(kuò)張血管；同時還具有抑制血小板和白細(xì)胞黏附、抑制平滑肌細(xì)胞增殖作用，在IRI中具有保護(hù)作用。缺血再灌注后幾分鐘內(nèi)NO生成量增加，NO對心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用，可使血管舒張，血小板和中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附作用減輕。此外，NO通過抑制半胱氨酸酶-3激活而在缺血再灌注時保護(hù)心肌抗凋亡。因此，NO合成的恢復(fù)或給予外源性NO很可能對缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。在貓和狗的多種缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸炎C實(shí)溶解在水樣介質(zhì)中的NO可以縮小梗死面積。NO前體L-精氨酸也被證實(shí)具有在體內(nèi)縮小梗死面積，在體外促進(jìn)心臟功能恢復(fù)的保護(hù)作用。通過NO合成增加所介導(dǎo)的L-精氨酸的心肌保護(hù)功能可被NOS抑制劑所阻滯。但NO在心肌缺血再灌注損傷中的作用有不同的報(bào)道。有報(bào)道認(rèn)為心肌缺血伴隨大量生成，NO與反應(yīng)，NO能迅速排除大量的氧自由基,兩者反應(yīng)生成ONOO-，從而使蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)膜損傷,導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡[5]。在缺血再灌注時,TNF-α、干擾素、IL-1等細(xì)胞因子增加，能誘導(dǎo)iNOS表達(dá)增加,NO合成增加，過多的NO對心肌的損害表現(xiàn)為：（1）NO與超氧陰離子反應(yīng)生成過氧亞硝酸鹽而損傷心肌。（2）與一些涉及細(xì)胞基礎(chǔ)代謝活動有關(guān)的酶（線粒體呼吸酶）活性中心結(jié)合，使酶失活。（3）直接負(fù)性肌力作用[6]。

雖然NO在I/R中的作用尚存在爭議，但近來多數(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)NO在缺血后處理對心肌的保護(hù)中起正面作用。Yang等[7]發(fā)現(xiàn)，NOS抑制劑可以抵消缺血后處理的心肌保護(hù)作用,而對單純?nèi)毖?再灌注組的心肌梗死范圍無影響。有研究稱上調(diào)NOS活性可引起NO合成增加，催化機(jī)體產(chǎn)生NO，保護(hù)血管[8]。Tsang等[9]在鼠的離體心模型實(shí)驗(yàn)中觀察到，缺血后處理組的eNOS的表達(dá)較對照組明顯增高，表明在缺血后處理心肌保護(hù)中NO起著重要作用。研究人員發(fā)現(xiàn)運(yùn)用多種方法促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性NO的產(chǎn)生，可減輕IRI[10-12]。

本實(shí)驗(yàn)中，平衡末期時4組心臟初始狀態(tài)相同，心臟灌流液中NO含量無差別。缺血再灌注組處理后由于再灌注損傷破壞了心臟內(nèi)皮細(xì)胞上的eNOS，使其產(chǎn)生的NO減少，而心肌損傷能夠激活大量原本無活性的iNOS，最終使NO含量與平衡期末的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。激動劑組處理后NO含量及NOS活性較缺血再灌注組高，是由于缺血再灌注導(dǎo)致心肌損傷，心臟內(nèi)皮細(xì)胞上的eNOS被破壞，但在激動劑L-Arg的作用下，使NOS活性與NO含量均高于再灌注組。缺血后處理組中由于后處理對心肌損傷有保護(hù)作用，使該組存留的eNOS較多，且心肌損傷激活了大量iNOS，導(dǎo)致其NO含量遠(yuǎn)高于再灌注組。抑制劑組中盡管后處理的保護(hù)作用使抑制劑組存留較多的eNOS，但在抑制劑L-NNA的作用下，該組NOS活性與NO含量均較后處理組低。LDH是臨床常用的表現(xiàn)心臟損傷程度的指標(biāo)，其活性隨心肌損傷加重而升高。由LDH與梗死面積結(jié)果可知：在接受再灌注損傷因素同時使用NOS激動劑L-Arg的激動劑組心肌損傷程度小于缺血再灌注組，表明LArg可能有一定的心肌保護(hù)作用；而同樣接受后處理因素下，使用抑制劑L-NNA的抑制劑組心肌損傷程度卻高于缺血后處理組，表明L-NNA可能會阻礙后處理對心肌的保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NOS激動劑L-Arg可提高NOS活性與NO含量，同時心肌也受到了一定的保護(hù)；而NOS抑制劑L-NNA不僅降低了NOS活性與NO含量，也減弱了后處理對心肌的保護(hù)作用。據(jù)此，我們推測使用NOS激動劑可保護(hù)再灌注損傷心肌，對臨床治療心?；颊哂幸欢ǖ闹笇?dǎo)意義。NO與NOS可以有效控制缺血再灌注對心肌細(xì)胞的損傷，在缺血后處理對再灌注損傷心肌保護(hù)機(jī)制中起著重要作用。NO及NOS對心肌保護(hù)作用的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1]Zhao ZQ,Crvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition ofmyocardial injury by ischemic postcon-ditioning during reperfusion;Comparison with ischemic preconditioning[J].AM JCirc Physiol,2003,285(254-2):H579

[2]Mehlhom U，Wilhelm B，Andreas K，eta1.Activation ofmyocardial constitutive nitric oxide synthase during coronary artery surgery[J].Eur JCardiothorac Surg，2000，17(3)：305

[3]WangWJ，Grzegorz S，Richard S.Peroxynitrite-inducedmyocardial injury ismediated throughmatrixmetalloproteinase-2[J].Cardiovasc Res，2002，53(1)：165

[4]EverettSA,DennisM F,TozerGM,etal.Nitric oxide in biological fluids：analysisofnitrate and nitrateby high-performance ion chromatography[J].JChromatogr A,1995,706(1/2):437

[5]Berges A,van Nassauw L,Timmermans JP,etal.Time-dependent expression pattern of nitric oxide and superoxide aftermyocardial infarction in rats[J].PharmacolRes,2007,55(1):72

[6]Lee Y,Aono M,Laskowitz D,et al.Apolipoprotein E protects against oxidative stress in mixed neuronal-glial cell culture by reducingglutamate toxicity[J].Neurochem Int,2004,44(2):107

[7]Yang XM,Proctor JB,Cui L,etal.Multip le,brief coronary occlusionsduringearly reperfusion p rotect rabbitheartsby targeting cell signaling pathways[J].Am CollCardiol,2004,44(5):1103

[8]Atsushi I,Shubha S,Corinne L,etal.Estradiol enhances recovery after myocardial infarction by augmenting incorporation of bone marrow-derived endothelialprogenitor cells into sitesof ischemiainduced neovascularization via endothelial nitric oxide synthasemediated activation ofmatrixmetalloproteinase-9[J].Circulation,2006,(113):1605

[9]Tsang A,Hausenloy DJ,Mocanu MM,et al.Postconditioning:A form of"modified reperfusion"p rotects themyocardium by activating the phosphatidylinositol3-inase-ktpathway[J].Circ Res,2004,95(3):230

[10]Kanko M,Ozden M,Maral H,et al.Effect of clopidogrel on nitric oxide levels in an ischemia reperfusion model[J].JCardiovasc Pharmacol,2006,48(1):797

[11]Esme H,Fidan H,Solak O,etal.Beneficialeffectsof supplemental nitric oxide donor given during reperfusion period in reperfusioninduced lung injury[J].Thorac Cardiovasc Surg,2006,54(7):477

[11]Altunkaya A,Oz E,Sivrikoz MC,et al.Role of the nitricoxide pathway in ischemia-reperfusion injury in isolated perfused guinea pig lungs[J].MolCel l Biochem,2006,290(122):9