于 躍，楊 柳，郭秀英，高建華，孟 林

（天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，天津 300070）

東北鶴虱 (Lappula Echinata Gilib，LEG)為紫草科一年生草本植物東北鶴虱果實(shí)，盛產(chǎn)于我國華北、東北等地區(qū)。其性味苦、辛、平，入脾、胃、肝三經(jīng)，具有驅(qū)蟲、抗炎、抗腹瀉的作用，可治療蟲積腹痛[1]。民間用其果實(shí)或全草水煎治療各種腹瀉，尤其對慢性腹瀉、老年性腹瀉、某些疾病如糖尿病、腫瘤等伴發(fā)的腹瀉有明顯作用。已有研究證明其水提取物具有抗炎[2]、緩解平滑肌痙攣[3]、調(diào)節(jié)胃腸水平衡[4]等作用，但未見LEG-I對機(jī)體免疫系統(tǒng)作用的報(bào)道。本文通過觀察脾淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期變化、細(xì)胞因子IL-2和TNF-α分泌，探討LEG-I對機(jī)體免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 LEG，產(chǎn)地為我國黑龍江省，種子類藥材，呈卵形，長約3～3.5mm，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物學(xué)教研室于嘉彬教授鑒定。取干燥的LEG，粉碎至20目，水煎煮，過濾除藥渣后合并藥液，以水提醇沉法及Sevag法收集并除蛋白，所得提取物過濾，經(jīng)減壓旋蒸，透析，最后冷凍干燥，得到粉末狀淡黃色提取物L(fēng)EG-I，-20℃保存。臨用前LEG-I用PBS緩沖液配制成1mg/ml儲(chǔ)備液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，可4℃保存，實(shí)驗(yàn)中再以PBS緩沖液稀釋成所需濃度。

1.1.2 試劑 ConAⅣ型，美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽（Methyl thiazolyl tetrazole,MTT），瑞士 Fluka公司；二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide,DMSO），美國Amresco公司；Mouse IL-2測定試劑盒，晶美生物工程有限公司，生產(chǎn)批號20071125；碘化丙啶染料，美國Sigma公司；核糖核酸酶A（Ribonuclease A,RNaseA），美國 Sigma 公司；胰蛋白酶，Gibco，批號：200706321；放線菌素D，美國Sigma公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 近交系清潔級BALB/C小鼠，體重（20±0.25）g，4～5 周齡，雌雄不拘，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所（批準(zhǔn)文號：SCXK津2005-0001）。L929細(xì)胞株由天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院惠贈(zèng)，常規(guī)復(fù)蘇傳代，應(yīng)用時(shí)調(diào)整至所需濃度。

1.1.4 儀器 Model680型酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；Epics-XL型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 取BALB/C小鼠1只，無菌條件下常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)測定細(xì)胞存活率為90%以上，細(xì)胞計(jì)數(shù)，RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/m l。取懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔160μl。實(shí)驗(yàn)分為對照組（每孔加入20μl RPMI-1640培養(yǎng)液）、藥物單獨(dú)刺激組（每孔加入20μl LEG-I，其終濃度為3.125～100μg/ml）、ConA單獨(dú)刺激組（每孔加入 20μl ConA，使其終濃度為5μg/ml）以及藥物協(xié)同ConA刺激組（每孔加入20μl LEG-I，其終濃度為0.781～100μg/ml和 20μl ConA，其終濃度為 5μg/ml），各孔用RPMI-1640培養(yǎng)液補(bǔ)足體積至200μl。每組每濃度做6復(fù)孔。于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)68 h，取出培養(yǎng)板每孔加20μl5mg/ml的MTT溶液，放于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出后將孔板離心1 500 r/min 15min，小心吸棄上清，每孔加入100μlDMSO，振蕩5min，于酶標(biāo)儀上測OD570nm值，并計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化刺激指數(shù) （stimulation index，SI），SI=實(shí)驗(yàn)孔OD570nm值/對照孔OD570nm值。

1.2.2 對小鼠脾淋巴細(xì)胞周期分布的影響 按上述方法制備小鼠脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，細(xì)胞加入 24 孔板中，每孔 0.8ml，空白組補(bǔ)加RPMI-1640培養(yǎng)液0.2ml，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的 LEG-I0.2ml使其終濃度為（100 μg/m l），ConA組加入0.2mlConA使其終濃度為5μg/m l，于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，收獲細(xì)胞至離心管內(nèi)。將收集細(xì)胞離心1 000 r/min，5min，棄去上清，冷PBS洗細(xì)胞兩次，離心1 000 r/min，5min。70%乙醇4℃固定過夜，上機(jī)前，離心收集細(xì)胞，并用PBS洗細(xì)胞，棄上清，加入500μlRNaseA（終濃度為100μl/m l），37 ℃作用30min，再加入50μl/ml碘化丙啶染液500μl室溫避光染色30min，吹散細(xì)胞后用300目尼龍濾膜過濾，然后以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，每個(gè)樣品收集10 000個(gè)細(xì)胞的參數(shù)，分析結(jié)果以處于G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞的百分率表示，根據(jù)公式PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%計(jì)算增殖指數(shù)（proliferation index,PI）。

1.2.3 對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α的影響 無菌收集小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/ml，于96孔板中，每孔加入160μl細(xì)胞懸液，藥物單獨(dú)刺激組加入20μl不同濃度LEG-I（25、50、100μg/ml），ConA協(xié)同刺激組每孔除加入上述不同濃度的LEG-I外，各孔還需加入20μlConA（終濃度為5μg/ml），陽性對照組加入終濃度為5μg/ml的ConA 20μl，空白組加入20μlRPMI-1640培養(yǎng)液，各孔加入RPMI-1640液補(bǔ)足體積至200μl。每組平行作6孔重復(fù)。于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，1 500 r/min離心10min，收集上清，-20℃凍存。0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的TNF敏感的鼠成纖維細(xì)胞系L929細(xì)胞2min后，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗兩次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，加入96孔板中（每孔100μl），孵箱過夜。棄上清，加入脾細(xì)胞培養(yǎng)上清100μl和20μl放線菌素D（終濃度為1mg/L），培養(yǎng)20 h。于倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞殺傷情況。以MTT法測定殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活力。

1.2.4 對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響 脾淋巴細(xì)胞懸液制備及分組方法同上，各實(shí)驗(yàn)組給藥濃度分別為 6.25、25、100 μg/m l。細(xì)胞于 37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，1 500 r/min離心10min，收集上清，-20℃凍存。標(biāo)本中IL-2含量測定按試劑盒說明書步驟進(jìn)行。結(jié)果判斷：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD450nm值作縱坐標(biāo)，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS15.0繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)曲線函數(shù)值計(jì)算個(gè)標(biāo)本的濃度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果均以表示。多樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（ONEWAY ANOVA），方差齊者采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’s T3法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 在脾細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的LEG-I作用72 h后，LEG-I在體外有直接激活靜止小鼠脾細(xì)胞增殖的作用，其OD570nm和SI值明顯高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LEG-I在劑量為3.125～100μg/ml范圍內(nèi)表現(xiàn)為絲裂原特性，并且有劑量依賴關(guān)系，其中100μg/ml LEG-I作用于靜止小鼠脾淋巴細(xì)胞后，其刺激指數(shù)SI值與ConA組相當(dāng)，淋巴細(xì)胞增殖率約為83.3%。見表1。

表1 LEG-I對靜止小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖的影響(,n=6)

表1 LEG-I對靜止小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖的影響(,n=6)

與空白對照組相比*P<0.05,**P<0.01;與ConA單獨(dú)刺激組相比，#P<0.01

OD570nm 0.215±0.002 0.413±0.012**0.223±0.004*#0.262±0.007**#0.300±0.004**#0.310±0.005**#0.335±0.006**#0.394±0.018**濃度 (μg/m l)5.000 3.125 6.250 12.500 25.000 50.000 100.000 SI 1.000±0.012 1.919±0.055**1.037±0.017*#1.220±0.034**#1.395±0.022**#1.440±0.024**#1.559±0.028**#1.833±0.081**組別空白對照組ConA單獨(dú)刺激組LEG-I單獨(dú)刺激組

表2顯示，不同濃度LEG-I對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)具有明顯的促進(jìn)作用，與ConA組相比，其OD570nm和SI值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中100μg/ml LEG-I作用于活化的小鼠脾淋巴細(xì)胞后，淋巴細(xì)胞增殖率約為276.4%。說明LEG-I與ConA具有協(xié)同刺激作用。

表2 LEG-I對被ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖的影響(,n=6)

表2 LEG-I對被ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖的影響(,n=6)

與空白對照組相比*P<0.01;與ConA單獨(dú)刺激組相比#P<0.05,##P<0.01

組別空白對照組ConA單獨(dú)刺激組LEG-I協(xié)同ConA OD570nm 0.219±0.011 0.467±0.024*0.524±0.016*#0.532±0.007*#0.539±0.005*#0.575±0.029*##0.713±0.044*##0.722±0.042*##0.732±0.025*##0.826±0.035*##濃度 (μg/m l)5.000 0.781 1.562 3.125 6.250 12.500 25.000 50.000 100.000 SI 1.000±0.053 2.131±0.110*2.388±0.072*#2.429±0.033*#2.455±0.024*#2.620±0.134*##3.251±0.199*##3.291±0.193*##3.339±0.114*##3.764±0.162*##

2.2 對小鼠脾淋巴細(xì)胞周期分布的影響 未刺激的對照組淋巴細(xì)胞多處于G0/G1期，其增殖指數(shù)PI為14.60%，經(jīng)ConA刺激48 h后，與對照組相比，G0/G1期細(xì)胞數(shù)減少，分裂期的細(xì)胞明顯增加，增殖指數(shù)PI為28.90%，明顯高于對照組（圖1）；經(jīng)LEG-I作用48 h后，進(jìn)入S期和G2/M期的小鼠脾淋巴細(xì)胞分別為16.00%和7.90%，增殖指數(shù)（23.90%）高于空白對照組。說明LEG-I可促進(jìn)淋巴細(xì)胞DNA的合成，使細(xì)胞進(jìn)入分裂期。

2.3 對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α的影響 L929細(xì)胞是一類對TNF-α敏感的細(xì)胞株，L929細(xì)胞抑制率越高，表明小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α量越多。單獨(dú)給與LEG-I后，與對照組相比，25、50及100μg/ml LEG-I均不能增加對L929細(xì)胞抑制率（P>0.05）（圖2），說明3組不同劑量LEG-I均不能有效促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α。

LEG-I與ConA協(xié)同刺激后，與ConA組相比，3組不同劑量LEG-I均可增加L929細(xì)胞抑制率，如圖3A可以看出，100μg/ml LEG-I與ConA協(xié)同刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞48 h，其上清液作用于L929細(xì)胞20 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞體積縮小，胞漿濃縮，折光性差。而空白組（如圖3B）L929細(xì)胞呈多角形生長，胞質(zhì)均勻，折光性強(qiáng)。這一結(jié)果表明，LEG-I可增加ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞TNF-α分泌，并且具有一定的劑量依賴性。

2.4 對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響 表3顯示，小鼠脾淋巴細(xì)胞可自發(fā)性分泌一定量水平的IL-2，加入不同濃度LEG-I后，對靜止的小鼠脾細(xì)胞上清中IL-2的分泌無明顯增加作用，與空白對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。經(jīng)過ConA刺激后，小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2明顯升高，與空白對照組相比，有顯著性差異。3個(gè)劑量組LEG-I均可提高ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2分泌水平，與ConA組相比，其增長率分別為3.39%、22.75%、34.42%。并且在6.25～100μg/ml范圍內(nèi)，其刺激作用具有濃度依賴性，隨LEG-I濃度升高，IL-2分泌水平提高。

回歸方程：(A vsC)C=422.37×A-84.731，r=0.995 5

表3 LEG-I對靜止和ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響( ,n=6)

表3 LEG-I對靜止和ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響( ,n=6)

與空白對照組相比*P<0.01；與ConA單獨(dú)刺激組相比#P<0.05，##P<0.01

IL-2(pg/m l)23.28±3.26 175.16±6.54*26.17±4.21 25.88±4.21 26.83±3.07 181.10±1.37*#215.01±6.30*##235.45±3.24*##濃度(μg/ml)5.00 6.25 25.00 100.00 6.25 25.00 100.00組別空白對照組ConA單獨(dú)刺激組LEG-I單獨(dú)刺激組LEG-I+ConA協(xié)同組

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了LEG-I對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及對TNF-α和IL-2分泌的影響。實(shí)驗(yàn)中，LEG-I可有效刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,在3.125～100μg/ml濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴效應(yīng)。由此提示，LEG-I可能是淋巴細(xì)胞的致有絲分裂原或具有絲裂原樣作用，可直接啟動(dòng)淋巴細(xì)胞表面受體活化，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，提高機(jī)體的免疫能力。ConA是常用的誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生增殖的有絲分裂原[5]，LEG-I能增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對刺激物ConA的反應(yīng)性，在0.781～100μg/ml劑量范圍內(nèi)具有劑量依賴關(guān)系，說明LEG-I與有絲分裂原具有協(xié)同刺激脾淋巴細(xì)胞增殖作用。

正常小鼠淋巴細(xì)胞在未接受抗原刺激時(shí)多處于G0期[6]，給藥組小鼠脾淋巴細(xì)胞較空白組G0/G1期細(xì)胞比例降低，而S期和G2/M期細(xì)胞比例增加，提示LEG-I主要作用于小鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期的S期和M期，促進(jìn)淋巴細(xì)胞DNA合成，使細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)入分裂增殖期。

正常小鼠脾淋巴細(xì)胞可分泌一定生理水平的TNF-α，LEG-I對正常小鼠脾淋巴細(xì)胞TNF-α的產(chǎn)生幾乎無影響，但可增加脾細(xì)胞在ConA刺激后產(chǎn)生TNF-α的量，生成的TNF-α可能參與巨噬細(xì)胞活化，誘生多種免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，如IL-1、IL-6、CSF等，刺激T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK活性，調(diào)節(jié)B細(xì)胞分化、增殖等[7-8]。LEG-I有可能通過上述途徑實(shí)現(xiàn)其免疫調(diào)節(jié)作用。

類似的結(jié)果也出現(xiàn)于此，LEG-I對靜止期淋巴細(xì)胞IL-2分泌無調(diào)節(jié)作用，卻顯著增加ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2分泌水平，在6.25～100μg/ml劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴性。IL-2是T淋巴細(xì)胞的自分泌或旁分泌生長因子，可作用于自身或鄰近T細(xì)胞表面的IL-2受體，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖活化，活化的T淋巴細(xì)胞可進(jìn)一步提高機(jī)體IL-2水平，形成正反饋效應(yīng)，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高機(jī)體免疫能力。故LEG-I增強(qiáng)小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能，推測可能與其促進(jìn)IL-2產(chǎn)生有關(guān)。

綜上，LEG-I能促進(jìn)靜息狀態(tài)及ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)淋巴細(xì)胞DNA合成，使細(xì)胞進(jìn)入分裂增殖期，促進(jìn)ConA活化小鼠脾淋巴細(xì)胞TNF-α及IL-2分泌，表明LEG-I具有免疫激活或免疫增強(qiáng)作用。

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