楊 敏，楊樹(shù)科，王 炯，楊 偉，王紅斌*

(云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650031)

離子色譜法測(cè)定白菜中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽及總磷、總氮

楊 敏，楊樹(shù)科，王 炯，楊 偉，王紅斌*

(云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650031)

以白菜為例建立超聲輔助提取(UAE)離子色譜法(IC)測(cè)定蔬菜中硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽、總氮、總磷含量的方法，并對(duì)白菜各部位的硝酸鹽、亞硝酸鹽及磷酸鹽含量的分布進(jìn)行研究。結(jié)果表明：當(dāng)進(jìn)樣量為20 μL，使用Na2CO3-NaHCO3為淋洗液，NO2－、NO3－、PO43－、總氮(TN)、總磷(TP)的最小檢出限分別為0.015、0.014、0.030、0.014、0.061mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.9990～0.9999，RSD為0.22%～0.94%，回收率為80.0%～110.0%。該法簡(jiǎn)便快速、精密度和準(zhǔn)確度高，15min就可完成白菜中硝酸鹽與亞硝鹽、磷酸鹽含量的分析。

離子色譜；超聲；白菜；氮；磷

Abstract：Chinese cabbage was used as the sample to establish a method for determining nitrate, nitrite, phosphate, total phosphorus (TP) and total nitrogen (TN) through ultrasound-assisted extraction and ion chromatography (UAE-IC). The distribution of these compounds in different parts of Chinese cabbage was also investigated. The detection limits for nitrate,nitrite, phosphate, TP and TN were 0.015, 0.014, 0.030, 0.014 mg/L and 0.061 mg/L, respectively, at a sample injection volume of 20 μL using an elution system composed of Na2CO3 and NaHCO3. The determination coefficients of the developed linear equations of these analytes and the precision relative standard deviations (RSDs) were in the range of 0.9990 to 0.9999 and 0.22% to 0.94%. The spike recovery rates of these analytes were between 80.0% and 110.0%. This method is characteristic of simple operation, fast detection, and accurate and reliable results.

Key words：ion chromatography；ultrasound；Chinese cabbage；nitrogen；phosphorus

近年來(lái)，蔬菜的安全性問(wèn)題備受人們關(guān)注，我國(guó)已對(duì)無(wú)公害蔬菜中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量作了限量標(biāo)準(zhǔn)[1]：葉菜類亞硝酸鹽≤4.0mg/kg、硝酸鹽≤3000mg/kg。蔬菜是人體硝酸鹽的主要來(lái)源，人體攝入的硝酸鹽有70%～80%來(lái)自蔬菜[2]，在正常情況下，蔬菜從土壤中吸收的硝酸鹽在體內(nèi)經(jīng)硝酸還原酶的作用，轉(zhuǎn)化為氨和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]。此外，在體內(nèi)細(xì)菌的作用下硝酸鹽可還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽可與仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸結(jié)合，形成亞硝胺，亞硝酸鹽可使血液的載氧能力下降，導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥；亞硝胺會(huì)誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變。因此，對(duì)蔬菜中無(wú)機(jī)鹽的控制，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的重要研究課題。

超聲輔助萃取(ultrasonic-assisted extraction，UAE)是利用空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、機(jī)械攪拌、強(qiáng)化擴(kuò)散、乳化作用、凝聚作用等理化特性對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行提取，具有快速、常溫、能耗低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)[4]而越來(lái)越受到人們的重視。本實(shí)驗(yàn)利用梅花布點(diǎn)法對(duì)白菜進(jìn)行采樣，超聲提取，SPE-C18小柱凈化，離子色譜法分析白菜中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽、總氮(TN)、總磷(TP)，旨在為白菜中氮、磷的測(cè)定提供方法學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮白菜 昆明市呈貢縣郎家營(yíng)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

KNO3、KNO2、KH2PO4、Na2HPO4(均為優(yōu)級(jí)純)；K2S2O8、NaOH(均為分析純)。

標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1000mg/L)：硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽、總磷磷酸鹽(Na2HPO4)等溶液用超純水配制，于4℃條件下保存；氧化液：0.074mol/L過(guò)硫酸鉀和0.075mol/L氫氧化鈉混合溶液[5]。使用時(shí)用超純水稀釋至所需濃度，配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

ICS-1500型離子色譜儀、DS6溫控電導(dǎo)檢測(cè)器、IonPac AS14(250mm×4.0mm)離子交換柱、IonPac AG14(50mm×4.0mm)保護(hù)柱、ASRS-300自動(dòng)再生抑制器、chromeleon工作站(軟件帶空白扣除) 美國(guó)戴安公司；AS10200AD超聲波清洗機(jī) 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；0.45μm微孔過(guò)濾器、SPE-C18固相萃取小柱、尼龍0.22μm微孔濾膜 天津富集科技有限公司。

1.2 色譜條件

儀器平衡時(shí)間為10～15min；柱溫為30℃；定量進(jìn)樣環(huán)為20μL；淋洗液為3.5mmol/L Na2CO3+1.0mmol/L NaHCO3；抑制器電流為24mA；流速為1.2mL/min，以峰面積定量。

采動(dòng)應(yīng)力對(duì)巷道底板的變形量影響很大，五陽(yáng)礦76采區(qū)2號(hào)專用回風(fēng)巷在相鄰工作面開(kāi)采超前支承應(yīng)力的作用下，巷道底板載荷急劇增加。取巷道寬度b=5.0 m，埋深H=560 m，P為1.5γH，得出五陽(yáng)采區(qū)2號(hào)專用回風(fēng)巷底鼓破壞滿足上述條件④，說(shuō)明其底板會(huì)發(fā)生如圖5d所示的破壞形式，即全斷面擠壓流動(dòng)底鼓。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品的提取(硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽)

取新鮮白菜樣品，用自來(lái)水洗凈后用蒸餾水沖洗，再用超純水沖洗，晾干。準(zhǔn)確稱取20.00g樣品放于研缽中，研磨至勻漿，然后加入適量超純水(控制在90mL以下)，制成勻漿系統(tǒng)，超聲波提取0～30min后，0.45μm濾膜過(guò)濾，取全部濾液定容于100mL容量瓶中。樣品取主體濃度(中間部分)10mL于50mL容量瓶中稀釋定容，待去除干擾物。

1.3.2 TN、TP的提取[6-7]

取上述采樣的白菜，經(jīng)清洗、晾干后，四分法取樣20.00g，研磨、超聲提取后，加入氧化液2.5mL，同時(shí)以試劑空白作參比，密封后放入高壓蒸汽消毒器中，加熱至120℃時(shí)維持30min，取出冷卻至室溫，0.45μm濾膜過(guò)濾，取濾液定容于100mL容量瓶中，從中取10mL溶液于50mL容量瓶中稀釋定容，待去除干擾物。

1.3.3 樣品的凈化

蔬菜汁中含有許多大分子有機(jī)物、色素和一些影響待測(cè)離子出峰的無(wú)機(jī)離子，不僅會(huì)污染分離柱，還會(huì)縮短柱的使用壽命，降低靈敏度。SPE-C18固相萃取小柱不含陰、陽(yáng)離子交換位點(diǎn)，能強(qiáng)保留疏水性物質(zhì)。因此，用經(jīng)活化(甲醇)的SPE-C18小柱凈化樣品，棄去前10mL，收集后2mL樣品溶液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，測(cè)定。

1.4 測(cè)定方法

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定[8]。分別用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配混合標(biāo)準(zhǔn)系列，以質(zhì)量濃度對(duì)電導(dǎo)響應(yīng)值做線性回歸進(jìn)行定量計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品離子色譜圖

亞硝酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽的三元標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1(a)、2(a)可知，標(biāo)準(zhǔn)品的基線平穩(wěn)、峰形對(duì)稱、分離效果好。蔬菜中基體組成復(fù)雜，干擾物質(zhì)多，會(huì)使出峰時(shí)間延遲，峰拖尾，變形，由圖1(b)、2(b)可見(jiàn)，用本實(shí)驗(yàn)的樣品前處理方法和色譜條件，各離子都得到了較好的分離。比較圖1、2可知，用碳酸鈉、碳酸氫鈉(pH=9.5±2)為淋洗液體系，TP的定性和定量以計(jì)，保留時(shí)間均為10.5min。

圖1 離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of nitrate, nitrite and phosphate

圖2 TN、TP離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of total phosphorus and total nitrogen

2.2 線性范圍、精密度和檢出限

依上述1.2節(jié)色譜條件，待測(cè)各離子的線性范圍、精密度(RSD)、回歸方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

表1 5種物質(zhì)的線性范圍、精密度、回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear range, precision, regression equation and correlation coefficient of five materials

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 Results of recovery experiments (n=6)%

2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)[9-15]

同時(shí)進(jìn)行所有樣品的制備，向其中一份菜莖(總共2份)中加入混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)，使成為0.50、0.70、0.90mg/kg 3個(gè)質(zhì)量濃度梯度，每個(gè)梯度6個(gè)平行樣品，經(jīng)前處理過(guò)柱凈化后測(cè)其加標(biāo)回收率，結(jié)果如表2所示。

由回收率統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知：使用超聲提取，C18小柱凈化測(cè)定蔬菜中的氮和磷，不僅提取速度快，而且加標(biāo)回收率都在80%～110%之間，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.4 提取條件的優(yōu)化

蔬菜中的無(wú)機(jī)陰離子易溶于水形成離子態(tài)，連續(xù)性超聲水提在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)污染、提取速度快，使用IonPac AS14色譜分離柱易實(shí)現(xiàn)前處理和分離。按文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道的方法，對(duì)顯著性影響因素超聲時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化選擇。

取蔬菜樣品，分別在0、10、15、20、25、30min時(shí)間段里用菜莖進(jìn)行超聲實(shí)驗(yàn)。

圖3 硝酸鹽超聲輔助萃取曲線Fig.3 UAE curve of nitrate

圖4 亞硝酸鹽超聲輔助萃取曲線Fig.4 UAE curve of nitrite

圖5 磷酸鹽超聲輔助萃取曲線Fig.5 UAE curve of phosphate

從圖3～5可以看出，超聲時(shí)間在20min內(nèi)，硝酸鹽、亞硝酸鹽和磷酸鹽隨萃取時(shí)間增加萃取量增加，20min后萃取量基本不再增加，本實(shí)驗(yàn)選擇萃取時(shí)間25min。

2.5 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)前處理好的腐葉，分別保存0、2、4、6、10、12h后進(jìn)行IC測(cè)定，其含量變化如圖6～8所示。

由圖6可知，儲(chǔ)備后，硝酸鹽含量在0～2h下降，2～4h微升，4～10h上升稍快，10～12h下降。而圖7中亞硝酸鹽含量的變化基本與之相反，這說(shuō)明在微生物的作用下，硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽[18]。圖8中磷酸鹽樣品在0～4h含量逐漸減少，4～9h上升，9～12h含量無(wú)變化，但高于現(xiàn)測(cè)的水平。

圖6 硝酸鹽穩(wěn)定性曲線Fig.6 Stability curve of nitrate

圖7 亞硝酸鹽穩(wěn)定性曲線Fig.7 Stability curve of nitrite

圖8 磷酸鹽穩(wěn)定性曲線Fig.8 Stability curve of phosphate

2.6 樣品的測(cè)定

2.6.1 不同部位樣品的測(cè)定

表3 樣品中不同部位含量的測(cè)定Table 3 Contents of nitrate, nitrite and phosphate in different parts of Chinese cabbage mg/kg

由表3可知，除了腐葉中亞硝酸鹽含量超標(biāo)[1]，正常可食部分中，硝酸鹽集中在菜莖、亞硝酸鹽集中在菜葉，磷酸鹽集中在菜根。

取不同部位的樣品四分法取樣進(jìn)行TN、TP測(cè)定，TN含量為509.95mg/kg，TP含量為1080mg/kg。

2.6.2 15個(gè)樣品的測(cè)定

用梅花布點(diǎn)法[19]和隨機(jī)取樣法分別采集昆明市呈貢縣郎家營(yíng)菜地和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)15個(gè)樣品，在優(yōu)化條件下用相同的樣品前處理方法和色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 15個(gè)樣品含量的測(cè)定Table 4 Contents of nitrate, nitrite, phosphate, TP and TN in 15 samples mg/kg

待測(cè)樣品中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽經(jīng)超聲提取后，溶于水相，以形式存在，經(jīng)IC分析可知：15個(gè)樣品中除農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)樣品的亞硝酸鹽含量大于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)(4.0mg/kg)外，其他樣品均低于限量標(biāo)準(zhǔn)，總體平均值在3.78mg/kg。硝酸鹽含量均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量(3000mg/kg)。磷酸根是人體合成細(xì)胞壁的基礎(chǔ)物質(zhì)，蔬菜中的磷酸鹽安全、無(wú)毒，對(duì)人體有補(bǔ)鈣、補(bǔ)鐵、補(bǔ)鋅等作用，是人體從食物中獲取的主要途徑。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)用UAE-IC法對(duì)白菜中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽、TN、TP進(jìn)行了分析測(cè)定研究，在樣品的預(yù)處理過(guò)程中，選擇了適宜的前處理、提取、凈化方法，避免了不必要的待測(cè)組分流失。在樣品測(cè)定過(guò)程中，選擇了合適的稀釋倍數(shù)、淋洗液及濃度、流量，獲得了較好的分離效果。相關(guān)系數(shù)和回收率都很好。表明了該檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易行、結(jié)果可靠、適用于大批量進(jìn)樣。可為其他植物中無(wú)機(jī)陰離子的快速檢測(cè)提供參考。

[1] GB 18406—2001 農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無(wú)公害蔬菜安全要求[S].

[2] 賓士友, 阮月燕, 蔡耕鳴. 廣西蔬菜水果硝酸鹽含量狀況與控制措施[J]. 廣西農(nóng)學(xué)報(bào), 2006, 21(1):23-25.

[3] 賈麗. 蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的分析[C]. 杭州:第十一屆全國(guó)離子色譜學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)論文集, 2006:31-34.

[4] 周斌. 用超聲波提取中藥材[J]. 安徽科技, 2005(4):23-24.

[5] 李聯(lián)盟, 徐惠民. 堿性過(guò)硫酸鉀氧化:離子色譜法測(cè)定地面水、廢水中的總氮總磷[J]. 中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè), 1987, 3(1):116-119.

[6] 楊妍. 離子色譜法測(cè)定水中總氮[J]. 化學(xué)分析計(jì)量, 2006, 14(2):54-55.

[7] 李寶光, 何敬峰, 馬明建, 等. 離子色譜法測(cè)定水體中總氮的含量[J].淄博學(xué)院學(xué)報(bào), 2002, 4(3):54-56.

[8] 符繼紅, 解成喜, 張麗靜. 離子色譜法測(cè)定麻黃中的無(wú)機(jī)陰離子[J].色譜, 2004, 22(1):72-73.

[9] 李月歡, 黃麗. 過(guò)硫酸鉀氧化:離子色譜法測(cè)定廢水中總氮[J]. 檢驗(yàn)技術(shù), 2005, 31(4):48-49.

[10] 張吉祥, 周建科, 吳志勇. 離子色譜法測(cè)定柿葉中有機(jī)酸和無(wú)機(jī)陰離子[J]. 理化檢驗(yàn):化學(xué)分冊(cè), 2002, 38(1):29-32.

[11] 張勝利, 魏永寧. 離子色譜法測(cè)定銀杏葉中無(wú)機(jī)陰離子[J]. 理化檢驗(yàn):化學(xué)分冊(cè), 2008, 44(2):166-170.

[12] 胡靜, 曹順安. 分析有機(jī)酸與無(wú)機(jī)陰離子的梯度離子色譜法[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2003(4):83-85.

[13] 張新智. 離子色譜法同時(shí)測(cè)定蘋(píng)果汁中的亞硝酸鹽、硝酸鹽和硫酸鹽[J]. 檢驗(yàn)檢疫科學(xué), 2008(1):32-34.

[14] 康勤書(shū), 周永強(qiáng), 陳浩. K2S2O8-離子色譜法測(cè)定水中總氮量[J]. 分析試驗(yàn)室, 2008, 27(5):112-114.

[15] 鐘志雄, 李攻科. 離子色譜法測(cè)定海產(chǎn)品中磷酸鹽、焦磷酸鹽、偏磷酸鹽和總磷[J]. 色譜, 2009, 27(4):499-504.

[16] 劉振春, 鄧子瑜, 李慧, 等. 超聲波輔助酶法水解玉米蛋白的工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(12):61-65.

[17] 尚軍, 李來(lái)好, 吳燕燕, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助蛋白酶水解合浦珠母貝肉的條件研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(18):44-49.

[18] 劉佳. 微生物好氧硝酸鹽還原產(chǎn)銨研究[D]. 成都:四川大學(xué), 2007.

[19] 奚旦立, 孫裕生, 劉秀英. 環(huán)境監(jiān)測(cè)[M]. 3版. 北京:高等教育出版社, 2004:269-272.

Determination of Nitrate, Nitrite, Phosphate, Total Phosphorus and Total Nitrogen in Vegetables Using Ion Chromatography

YANG Min，YANG Shu-ke，WANG Jiong，YANG Wei，WANG Hong-bin*
(School of Chemistry and Biotechnology, Yunnan University of Nationalities, Kunming 650031, China)

O611.5

A

1002-6630(2010)18-0216-04

2009-12-31

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(60963026)；云南省社會(huì)發(fā)展科技(應(yīng)用基礎(chǔ)研究)項(xiàng)目(2009CD100)；云南民族大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新型實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(2010HSCX01)

楊敏(1966—)，女，教授，碩士，研究方向?yàn)樯V分離分析。E-mail：yangm4849@tom.com

*通信作者：王紅斌(1966—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)榉蛛x分析技術(shù)及應(yīng)用。E-mail：wanghb2152@tom.com