甘露菁，鄧澤元*

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，高等研究院，江西 南昌 330047)

響應曲面法優(yōu)化醇提荷葉復方物超臨界萃取殘渣中黃酮的工藝

甘露菁，鄧澤元*

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，高等研究院，江西 南昌 330047)

對荷葉復方物超臨界萃取后的殘渣中黃酮進行醇提，用Box-Behnken響應曲面設計法，以料液比、乙醇體積分數(shù)、溫度及時間為自變量，以總黃酮得率為響應指標，用回歸方程的方差分析檢驗模型的準確性。修正后最優(yōu)化的條件為殘渣10g時，料液比1:20(g/mL)、乙醇體積分數(shù)50%、溫度80℃、時間80min。在此條件下總黃酮得率為15.97mg/g，提取3次結果與理論預測值相近。因此，基于Box-Behnken響應曲面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值，可用于荷葉復方降脂產(chǎn)品的開發(fā)。

響應曲面法；黃酮；殘渣

Abstract：Ethanol extraction was employed to extract total flavonoids from the leftover residue of a Chinese herbal medicine combination consisting of lotus leaves, cassia seeds, hawthorn fruit and oriental water plantain rhizome after supercritical carbon dioxide extraction. The optimal conditions for the extraction of total flavonoids were explored by response surface methodology.Box-Behnken design was applied to provide experimental data for establishing a mathematical regression model describing the relationship between the extraction rate of total flavonoids and four independent variables including material-to-liquid ratio,ethanol concentration, extraction temperature and extraction time. Correlation analysis of the established model was performed,and the results indicated that it could be employed to optimize the ethanol extraction of total flavonoids from the start material.Material-to-liquid ratio of 1:20, ethanol concentration of 50%, extraction temperature of 80 ℃ and extraction time of 80 min were found optimum. The experimental values of the extraction rate of total flavonoids under these optimum conditions were in good agreement with the predicted ones.

Key words：response surface methodology；flavonoids；residue

荷葉(主要降脂活性物質(zhì)生物堿和黃酮)[1-2]多與山楂(Crataegus PinnatifidaBge.)(主要降脂活性物質(zhì)黃酮)[3]、決明子(Cassia ObtusifoliaL.)(主要降脂活性物質(zhì)蒽醌)[4]、澤瀉(Alisma Orientalis(Sam.) Juzep.)(主要降脂活性物質(zhì)三萜類)[5]等組成復方，多用于治療高血脂、高血壓及其并發(fā)癥。前期研究中，將荷葉、山楂、決明子和澤瀉以2:2:1:1的比例配成復方，用CO2超臨界萃取裝置對其進行萃取，經(jīng)過對壓強、溫度、夾帶劑用量這3個條件進行優(yōu)化后，一次性萃取生物堿、蒽醌、三萜類物質(zhì)得率都較為理想，但黃酮的萃取效果欠佳。本實驗旨在探索對荷葉復方超臨界萃取后的殘渣進行后續(xù)提取，即醇提條件的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

荷葉復方(荷葉、決明子、山楂、澤瀉)超臨界萃取后的殘渣。

蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所。所用試劑均為分析純。

sp-1910uvpc紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗

取上述荷葉復方粉末(60目)超臨界萃取后的殘渣10g，加一定量的相應體積分數(shù)乙醇溶液浸泡，在相應溫度中水浴加熱提取相應的時間，然后離心分離，留取上清液，下層殘留物在同樣條件下再提取1次，合并提取液。濃縮后用80%乙醇溶液定容為100mL，備用。在其他條件不變的前提下，分別改變料液比[(固定提取溫度為60℃，乙醇體積分數(shù)80%，提取時間45min，改變料液比(g/mL)為 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25)]、乙醇體積分數(shù)(固定提取溫度為60℃，料液比為1:20，提取時間45min，改變乙醇體積分數(shù)為50%、65%、80%、95%)、溫度(固定乙醇體積分數(shù)65%，料液比為1:20，提取時間75min，改變溫度為50、60、70、80℃)及時間(固定提取溫度為60℃，乙醇體積分數(shù)65%，料液比1:20，改變提取時間為30、45、60、75、90、120min)等4個因素的水平，通過測定總黃酮含量來評價各因素對醇提荷葉復方超臨界萃取殘渣的影響[6]。

1.2.2 響應曲面法優(yōu)化黃酮醇提條件

運用SAS 8.00(SAS Institute Inc.)，采用Box-Behnken響應曲面設計法[7]，以料液比、乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間為自變量，以黃酮得率(mg/g原料)為響應指標[8]，設計四因素三水平試驗方案，試驗因素編碼及水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素編碼及水平Table 1 Factors and levels in the response surface design

1.3.3 總黃酮含量檢測方法

采用分光光度法[9]，以蘆丁為標準品，無水乙醇定容后直接在最大吸收波長360nm處測定吸光度。得回歸方程：y=35.135x+0.0004(其中y為總黃酮含量，x為吸光度)，R2=0.9999。精密移取1mL備用提取液，同法測定，根據(jù)標準曲線計算總黃酮含量及得率，得率以每克殘渣原料中含有總黃酮量(mg)表示，計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對醇提殘渣黃酮的影響

圖1 料液比對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由圖1可知，料液比1:5到1:20的范圍內(nèi)，隨著其比例減小，總黃酮得率逐漸增加，從11.79mg/g上升到13.13mg/g，但是當料液比到1:25時卻下降到12.41mg/g?？赡苁且驗樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)溶劑用量增加有助于黃酮類化合物的浸出，溶劑用量少，提取不太完全，但溶劑用量過大，水浴加熱的負荷增大，達到提取完全所需要的時間也增長，使得在有限的時間內(nèi)對物料的提取不完全[10]。綜合考慮后采用料液比1:20。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對醇提殘渣黃酮的影響

圖2 乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可知，總黃酮得率在乙醇體積分數(shù)65%時最高(13.47mg/g)，80%與95%時分別下降到13.13mg/g和8.58mg/g。這可能是由于乙醇體積分數(shù)過高時，沸點下降，導致?lián)]發(fā)過大，同時一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強的成分溶出量增加，與黃酮類化合物競爭，從而導致黃酮類化合物得率下降[10]。因此，最適乙醇體積分數(shù)為65%。

2.1.3 時間對醇提殘渣黃酮的影響

圖3 提取時間對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，提取時間延長，黃酮的得率也隨之增加，當時間超過75min時(13.90mg/g)，時間延長總黃酮得率增加并不明顯(90min時13.90mg/g及120min時13.91mg/g)，為了避免設備多余的消耗和成本的增加，將提取時間控制在75min為宜。

2.1.4 溫度對醇提殘渣黃酮的影響

圖4 溫度對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，隨溫度的升高黃酮得率增加明顯，在70℃時達到頂峰(13.99mg/g)，但當溫度到80℃時，殘渣中黃酮類物質(zhì)得率反而降低至13.73mg/g。這可能是由于黃酮類物質(zhì)的溶出率隨著溫度的升高而增加，但是溫度過高接近乙醇沸點時，反而影響醇對黃酮類物質(zhì)的溶出量[11]。所以提取溫度控制為70℃為宜。

2.2 響應曲面試驗結果

響應曲面試驗設計方案與試驗結果見表2。對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到響應曲面二次多元回歸模型方程：Y

式中：Y代表總黃酮得率，而X1、X2、X3、X4分表代表料液比、乙醇體積分數(shù)、溫度和時間。

表2 Box-Behnken響應曲面設計及結果Table 2 Box-Behnken response surface design matrix and experimental results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis for the established regression model

由表3可知模型P=0.002642<0.01，表明模型極顯著，失擬項P=0.2143＞0.05不顯著，說明該模型擬合程度良好[12]，可以用此模型對荷葉復方物的超臨界萃取殘渣中黃酮醇提效果進行分析和預測。由回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結果可知，模型的一次項X1(料液比)、X2(乙醇體積分數(shù))、X3(溫度)均對殘渣中黃酮醇提的線性效應極顯著，而X4(時間)不顯著；二次項均對殘渣中黃酮醇提的曲面效應顯著；交互項X1X2、X2X3對殘渣中黃酮醇提的曲面效應顯著。

模型響應曲面見圖5～10。從響應面分析圖上形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。

圖5 料液比和乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的交互作用的響應曲面Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of materialto-liquid ratio and ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

圖6 料液比和溫度對總黃酮得率的交互作用的響應曲面Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of materialto-liquid ratio and extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

圖7 料液比和時間對總黃酮得率的交互作用的響應曲面Fig.7 Response surface plot showing the interactive effects of materialto-liquid ratio and extraction time on the extraction rate of total flavonoids

圖8 乙醇體積分數(shù)和溫度對總黃酮得率的交互作用響應曲面Fig.8 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

圖9 乙醇體積分數(shù)和時間對總黃酮得率的交互作用響應曲面Fig.9 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and extraction time on the extraction rate of total flavonoids

圖10 溫度和時間對總黃酮得率的交互作用的響應曲面Fig.10 Response surface plot showing the interactive effects of extraction temperature and time on the extraction rate of total flavonoids

對模型方程解逆矩陣得殘渣中黃酮醇提最佳工藝為：料液比1:19.74，乙醇體積分數(shù)50.88%，溫度80.75℃，時間80.12min。為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件修正參數(shù)：料液比1:20，乙醇體積分數(shù)50%，溫度80℃，時間80min。用此最佳實驗條件重復3次，得到平均總黃酮得率為15.97mg/g。與理論最佳總黃酮得率15.94mg/g一致。因此，基于響應曲面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

3 結 論

用響應曲面法建立了荷葉復方物超臨界萃取殘渣中總黃酮醇提得率與料液比、乙醇體積分數(shù)、溫度及時間關系的回歸模型，經(jīng)檢驗證明該模型準確有效，殘渣中黃酮醇提的最佳工藝修正參數(shù)為料液比1:20、乙醇體積分數(shù)50%、溫度80℃、時間80min，在此條件下總黃酮得率為15.97mg/g，與理論最佳得率一致。

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Optimization of Ethanol Extraction of Total Flavonoids from the Leftover Residue of a Chinese Herbal Medicine Combination after Supercritical Carbon Dioxide Extraction Using Response Surface Methodology

GAN Lu-jing，DENG Ze-yuan*
(Institute for Advanced Study, State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University,Nanchang 330047, China)

O623.54

A

1002-6630(2010)18-0026-05

2009-12-16

江西省自然科學基金項目(2006GY0066)；江西省教育廳科研課題(20030058)

甘露菁(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學。E-mail：closer00@foxmail.com

*通信作者：鄧澤元(1963—)，男，教授，博士，研究方向為脂肪酸及天然產(chǎn)物。E-mail：dengzy28@yahoo.com.cn