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        旋光法測(cè)定發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸

        2010-10-19 05:25:24孫文敬周延政馮曉燕余泗蓮
        食品科學(xué) 2010年22期
        關(guān)鍵詞:旋光發(fā)酵液回歸方程

        孫文敬,周延政,馮曉燕,魏 轉(zhuǎn),余泗蓮,周 強(qiáng)

        (1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北 石家莊 050016;3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥工程系,河北 石家莊 050026;4.百勤異VC鈉有限公司,江西 德興 334221)

        旋光法測(cè)定發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸

        孫文敬1,周延政1,馮曉燕2,魏 轉(zhuǎn)3,余泗蓮4,周 強(qiáng)4

        (1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北 石家莊 050016;3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥工程系,河北 石家莊 050026;4.百勤異VC鈉有限公司,江西 德興 334221)

        通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液的旋光度及其葡萄糖質(zhì)量濃度,計(jì)算發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的質(zhì)量濃度,并考察該方法實(shí)際應(yīng)用的可行性。結(jié)果表明:對(duì)照品溶液的旋光度、2-酮基-D-葡萄糖酸質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系,R2>0.9999;該方法精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好,2-酮基-D-葡萄糖酸的平均回收率為102.60%,RSD為2.17%(n=5)。該方法可用于發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的定量檢測(cè)。

        2-酮基-D-葡萄糖酸;葡萄糖;發(fā)酵液;旋光法;測(cè)定

        Abstract:The 2-keto-D-gluconic acid in fermentation broth was calculated on the basis of glucose concentration determined by optical rotation degree. The application feasibility of polarimetry was also investigated. Results indicated that a good linear relationship between optical rotation degree and the concentration of 2-keto-D-gluconic acid and glucose (R2>0.9999). The average recovery rate was 102.60% with RSD of 2.17%. This method has characteristics of precision, stability and reproducibility.Therefore, it can be used for determining 2-keto-D-gluconic acid in fermentation broth.

        Key words:2-keto-D-gluconic acid;glucose;fermentation broth;polarimetry;determination

        2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid,2KGA)可作為飼料的富鈣添加劑、洗滌劑的促凈劑、水泥增塑劑和攝影顯影劑等。同時(shí),2KGA還是生產(chǎn)除莠化合物、糠醛、D-阿拉伯糖、D-核酮糖和D-異抗壞血酸(erythorbic acid)及其鈉鹽(sodium erythorbate)的前體[1]。其中,作為食品添加劑D-異抗壞血酸(鈉)的前體是其最主要的用途。

        在工業(yè)生產(chǎn)上,2KGA通常是由淀粉水解糖(葡萄糖)經(jīng)細(xì)菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化而來(lái)[2]。2KGA的質(zhì)量濃度是2KGA發(fā)酵過(guò)程控制的一個(gè)極其重要的參數(shù),在整個(gè)發(fā)酵期間需要進(jìn)行不斷的監(jiān)測(cè)。因此,建立準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的2KGA定量測(cè)定方法是十分必要的。關(guān)于發(fā)酵液中2KGA的定量檢測(cè),通常采用的方法有碘量法[3]、酸堿滴定法[3]、HPLC法[1]和酶法[4]等。雖然采用HPLC法和酶法可以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中2KGA的快速、準(zhǔn)確測(cè)定,但因其所需儀器昂貴或試劑成本較高而難以推廣;碘量法和酸堿滴定法的經(jīng)濟(jì)性和及時(shí)性能夠符合發(fā)酵過(guò)程控制的要求,但測(cè)定結(jié)果特別容易受到發(fā)酵液中葡萄糖的干擾,導(dǎo)致其準(zhǔn)確度不夠。

        早在20世紀(jì)40年代,Stubbs等[5]提出根據(jù)發(fā)酵液的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度定量檢測(cè)2KGA的方法(即旋光法)。然而,限于采用的葡萄糖測(cè)定技術(shù)(Shaffer-Hartmann法),該法并未得到普遍采用。

        葡萄糖是食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)及臨床化學(xué)的一個(gè)常規(guī)而重要的檢測(cè)指標(biāo)[6]。葡萄糖氧化酶(GOD)法、己糖激酶(HK)法、葡萄糖脫氫酶(GDH)法[7-10]等酶學(xué)方法已成為葡萄糖檢測(cè)的主流方法。葡萄糖的生物傳感分析技術(shù)是酶學(xué)方法與生物傳感器有機(jī)結(jié)合的產(chǎn)物,在醫(yī)藥、食品與發(fā)酵工業(yè)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[11-12]。本研究以生物傳感儀替代Shaffer-Hartmann法對(duì)葡萄糖進(jìn)行檢測(cè),在此基礎(chǔ)上對(duì)2KGA的旋光測(cè)定技術(shù)進(jìn)行方法學(xué)考察,以期建立一種準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵液中2KGA的定量測(cè)定方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑與儀器

        2KGA發(fā)酵液:采用文獻(xiàn)[2]方法自制;2KGA鈣鹽(HPLC法測(cè)定其中的2KGA含量為79.70%) 江西省德興市百勤異VC鈉有限公司;無(wú)水葡萄糖 北京精求化工有限責(zé)任公司;濃鹽酸 上海國(guó)藥試劑公司;其余試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)溶液均以二次蒸餾水配制。

        SBA-40型生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;WZZ-1SS數(shù)字式自動(dòng)旋光儀、PHS-3C型pH計(jì) 上海精密儀器有限公司;AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;80-2型離心沉淀機(jī) 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;CS501型超級(jí)恒溫水浴器 常州諾基儀器有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 樣品溶液的制備

        取一定量的2KGA發(fā)酵液,首先離心(4000r/min)20min以除去沉淀物。然后,取25mL的離心上清液與20mL的蒸餾水混合,攪動(dòng)下用鹽酸調(diào)節(jié)其pH值至1.5~1.6,再在60℃水浴中保溫30min。用冷水將其冷卻至25℃并用蒸餾水定容到100mL,再4000r/min離心30min,所得的上清液作為樣品溶液。

        1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

        按照表1所示的不同配比,精密稱取各配比所需的無(wú)水葡萄糖和2KGA,將其分別加入45mL蒸餾水中。其他配制方法同1.2.1節(jié)樣品溶液的制備,依次得到對(duì)照品溶液1~8。

        1.2.3 葡萄糖分析

        在25℃條件下,采用生物傳感分析儀測(cè)定。

        1.2.4 旋光度的測(cè)定

        在25℃條件下,采用旋光儀測(cè)定。測(cè)定的光源為鈉燈D線,旋光管的管長(zhǎng)為1dm。

        1.2.5 pH值的測(cè)定

        采用pH計(jì)測(cè)定。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 旋光度、葡萄糖及2KGA質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系

        依據(jù)Stubbs等[5]的研究結(jié)果,推測(cè)2KGA發(fā)酵液的旋光度與發(fā)酵液中的葡萄糖及2KGA質(zhì)量濃度之間應(yīng)該存在一定線性關(guān)系,即:

        式中:Y為發(fā)酵液的旋光度/(°);X1為發(fā)酵液中2KGA質(zhì)量濃度/(g/100mL);X2為發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度/(g/100mL);-0.88為1g/100mL 2KGA水溶液的旋光度/(°);0.5275 為1g/100mL 葡萄糖溶液的旋光度/(°)。

        利用Excel對(duì)對(duì)照品溶液旋光度的測(cè)定結(jié)果(表1)進(jìn)行多元線性回歸,可以得到線性回歸方程:Y=-0.8849X1+0.5244X2,這與Stubbs等[5]的研究結(jié)果吻合程度很高,并且R2>0.9999,F(xiàn)檢驗(yàn)與t檢驗(yàn)的結(jié)果均為顯著,說(shuō)明該線性回歸方程對(duì)實(shí)測(cè)值的擬合情況良好。

        表1 對(duì)照品溶液的組成及其旋光度測(cè)定結(jié)果Table 1 Compositions and optical rotation degree of standard solution

        2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

        隨機(jī)抽取一種對(duì)照品溶液進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。重復(fù)5次取樣測(cè)定對(duì)照品溶液6的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度,其RSD值分別為0.44%和0.73%;根據(jù)所建立的線性回歸方程計(jì)算對(duì)照品溶液6中的2KGA質(zhì)量濃度,RSD值為0.57%,表明精密度良好(表2)。

        表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision determination of 2-KGA

        2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

        表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Stability determination of 2-KGA

        將樣品溶液在25℃分別放置0、30、60、90、120min,然后測(cè)定樣品溶液的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度,RSD值分別為3.26%和3.17%;根據(jù)所建立的線性回歸方程計(jì)算樣品溶液中的2KGA質(zhì)量濃度,RSD值為2.38%,可見(jiàn)樣品溶液在2h內(nèi)穩(wěn)定性良好(表3)。

        2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

        取相同的發(fā)酵液5份,按1.2.1節(jié)方法分別進(jìn)行處理,測(cè)定所得各個(gè)樣品溶液的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度,RSD值分別為0.59%和2.30%;根據(jù)所建立的線性回歸方程計(jì)算樣品溶液中的2KGA質(zhì)量濃度,RSD值為0.62%,結(jié)果表明重現(xiàn)性良好(表4)。

        表4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Reproducibility determination of 2-KGA

        2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

        表5 2KGA的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Recovery rates and RSD of spiked samples

        準(zhǔn)確量取已知2KGA質(zhì)量濃度的發(fā)酵液125mL,精密加入0.6274g的2KGA鈣鹽(含2KGA 0.5000g,與發(fā)酵液混合前用5mL左右的蒸餾水溶解),按1.2.1節(jié)方法制備樣品溶液,平行5份。測(cè)定各個(gè)樣品溶液的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度,并根據(jù)所建立的線性回歸方程計(jì)算樣品溶液中的2KGA質(zhì)量濃度。計(jì)算結(jié)果表明,2KGA的5次平均回收率為102.60%,RSD為2.17%(表5)。

        3 結(jié) 論

        樣品溶液的旋光度、2-酮基-D-葡萄糖酸質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系。2KGA的旋光法測(cè)定技術(shù)具有精密度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好、操作經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn),可用于發(fā)酵液中2KGA的定量測(cè)定。

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        Determination of 2-Keto-D-gluconic Acid in Fermentation Broth by Polarimetry

        SUN Wen-jing1,ZHOU Yan-zheng1,F(xiàn)ENG Xiao-yan2,WEI Zhuan3,YU Si-lian4,ZHOU Qiang4
        (1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China;2. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China;3. Department of Pharmaceutical, Hebei Chemical and Pharmaceutical College, Shijiazhuang 050026, China;4. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China)

        TQ921.2

        A

        1002-6630(2010)22-0375-03

        2010-05-05

        江蘇大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(08JDG029);江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2008DD00600);江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(贛財(cái)教[2008]147號(hào))

        孫文敬(1964—),男,研究員,博士,主要從事生物化工研究。E-mail:sunwenjing1919@163.com

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