孫文敬，周延政，馮曉燕，魏 轉(zhuǎn)，余泗蓮，周 強(qiáng)

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 河北 石家莊 050016；3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥工程系，河北 石家莊 050026；4.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221)

旋光法測(cè)定發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸

孫文敬1，周延政1，馮曉燕2，魏 轉(zhuǎn)3，余泗蓮4，周 強(qiáng)4

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 河北 石家莊 050016；3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥工程系，河北 石家莊 050026；4.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221)

通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液的旋光度及其葡萄糖質(zhì)量濃度，計(jì)算發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的質(zhì)量濃度，并考察該方法實(shí)際應(yīng)用的可行性。結(jié)果表明：對(duì)照品溶液的旋光度、2-酮基-D-葡萄糖酸質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系，R2＞0.9999；該方法精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，2-酮基-D-葡萄糖酸的平均回收率為102.60%，RSD為2.17%(n=5)。該方法可用于發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的定量檢測(cè)。

2-酮基-D-葡萄糖酸；葡萄糖；發(fā)酵液；旋光法；測(cè)定

Abstract：The 2-keto-D-gluconic acid in fermentation broth was calculated on the basis of glucose concentration determined by optical rotation degree. The application feasibility of polarimetry was also investigated. Results indicated that a good linear relationship between optical rotation degree and the concentration of 2-keto-D-gluconic acid and glucose (R2＞0.9999). The average recovery rate was 102.60% with RSD of 2.17%. This method has characteristics of precision, stability and reproducibility.Therefore, it can be used for determining 2-keto-D-gluconic acid in fermentation broth.

Key words：2-keto-D-gluconic acid；glucose；fermentation broth；polarimetry；determination

2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)可作為飼料的富鈣添加劑、洗滌劑的促凈劑、水泥增塑劑和攝影顯影劑等。同時(shí)，2KGA還是生產(chǎn)除莠化合物、糠醛、D-阿拉伯糖、D-核酮糖和D-異抗壞血酸(erythorbic acid)及其鈉鹽(sodium erythorbate)的前體[1]。其中，作為食品添加劑D-異抗壞血酸(鈉)的前體是其最主要的用途。

在工業(yè)生產(chǎn)上，2KGA通常是由淀粉水解糖(葡萄糖)經(jīng)細(xì)菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化而來(lái)[2]。2KGA的質(zhì)量濃度是2KGA發(fā)酵過(guò)程控制的一個(gè)極其重要的參數(shù)，在整個(gè)發(fā)酵期間需要進(jìn)行不斷的監(jiān)測(cè)。因此，建立準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的2KGA定量測(cè)定方法是十分必要的。關(guān)于發(fā)酵液中2KGA的定量檢測(cè)，通常采用的方法有碘量法[3]、酸堿滴定法[3]、HPLC法[1]和酶法[4]等。雖然采用HPLC法和酶法可以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中2KGA的快速、準(zhǔn)確測(cè)定，但因其所需儀器昂貴或試劑成本較高而難以推廣；碘量法和酸堿滴定法的經(jīng)濟(jì)性和及時(shí)性能夠符合發(fā)酵過(guò)程控制的要求，但測(cè)定結(jié)果特別容易受到發(fā)酵液中葡萄糖的干擾，導(dǎo)致其準(zhǔn)確度不夠。

早在20世紀(jì)40年代，Stubbs等[5]提出根據(jù)發(fā)酵液的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度定量檢測(cè)2KGA的方法(即旋光法)。然而，限于采用的葡萄糖測(cè)定技術(shù)(Shaffer-Hartmann法)，該法并未得到普遍采用。

葡萄糖是食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)及臨床化學(xué)的一個(gè)常規(guī)而重要的檢測(cè)指標(biāo)[6]。葡萄糖氧化酶(GOD)法、己糖激酶(HK)法、葡萄糖脫氫酶(GDH)法[7-10]等酶學(xué)方法已成為葡萄糖檢測(cè)的主流方法。葡萄糖的生物傳感分析技術(shù)是酶學(xué)方法與生物傳感器有機(jī)結(jié)合的產(chǎn)物，在醫(yī)藥、食品與發(fā)酵工業(yè)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[11-12]。本研究以生物傳感儀替代Shaffer-Hartmann法對(duì)葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上對(duì)2KGA的旋光測(cè)定技術(shù)進(jìn)行方法學(xué)考察，以期建立一種準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵液中2KGA的定量測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

2KGA發(fā)酵液：采用文獻(xiàn)[2]方法自制；2KGA鈣鹽(HPLC法測(cè)定其中的2KGA含量為79.70%) 江西省德興市百勤異VC鈉有限公司；無(wú)水葡萄糖 北京精求化工有限責(zé)任公司；濃鹽酸 上海國(guó)藥試劑公司；其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)溶液均以二次蒸餾水配制。

SBA-40型生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所；WZZ-1SS數(shù)字式自動(dòng)旋光儀、PHS-3C型pH計(jì) 上海精密儀器有限公司；AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；80-2型離心沉淀機(jī) 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；CS501型超級(jí)恒溫水浴器 常州諾基儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備

取一定量的2KGA發(fā)酵液，首先離心(4000r/min)20min以除去沉淀物。然后，取25mL的離心上清液與20mL的蒸餾水混合，攪動(dòng)下用鹽酸調(diào)節(jié)其pH值至1.5～1.6，再在60℃水浴中保溫30min。用冷水將其冷卻至25℃并用蒸餾水定容到100mL，再4000r/min離心30min，所得的上清液作為樣品溶液。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

按照表1所示的不同配比，精密稱取各配比所需的無(wú)水葡萄糖和2KGA，將其分別加入45mL蒸餾水中。其他配制方法同1.2.1節(jié)樣品溶液的制備，依次得到對(duì)照品溶液1～8。

1.2.3 葡萄糖分析

在25℃條件下，采用生物傳感分析儀測(cè)定。

1.2.4 旋光度的測(cè)定

在25℃條件下，采用旋光儀測(cè)定。測(cè)定的光源為鈉燈D線，旋光管的管長(zhǎng)為1dm。

1.2.5 pH值的測(cè)定

采用pH計(jì)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 旋光度、葡萄糖及2KGA質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系

依據(jù)Stubbs等[5]的研究結(jié)果，推測(cè)2KGA發(fā)酵液的旋光度與發(fā)酵液中的葡萄糖及2KGA質(zhì)量濃度之間應(yīng)該存在一定線性關(guān)系，即：

式中：Y為發(fā)酵液的旋光度/(°)；X1為發(fā)酵液中2KGA質(zhì)量濃度/(g/100mL)；X2為發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度/(g/100mL)；－0.88為1g/100mL 2KGA水溶液的旋光度/(°)；0.5275 為1g/100mL 葡萄糖溶液的旋光度/(°)。

利用Excel對(duì)對(duì)照品溶液旋光度的測(cè)定結(jié)果(表1)進(jìn)行多元線性回歸，可以得到線性回歸方程：Y=－0.8849X1＋0.5244X2，這與Stubbs等[5]的研究結(jié)果吻合程度很高，并且R2＞0.9999，F(xiàn)檢驗(yàn)與t檢驗(yàn)的結(jié)果均為顯著，說(shuō)明該線性回歸方程對(duì)實(shí)測(cè)值的擬合情況良好。

表1 對(duì)照品溶液的組成及其旋光度測(cè)定結(jié)果Table 1 Compositions and optical rotation degree of standard solution

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)抽取一種對(duì)照品溶液進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。重復(fù)5次取樣測(cè)定對(duì)照品溶液6的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度，其RSD值分別為0.44%和0.73%；根據(jù)所建立的線性回歸方程計(jì)算對(duì)照品溶液6中的2KGA質(zhì)量濃度，RSD值為0.57%，表明精密度良好(表2)。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision determination of 2-KGA

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Stability determination of 2-KGA

將樣品溶液在25℃分別放置0、30、60、90、120min，然后測(cè)定樣品溶液的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度，RSD值分別為3.26%和3.17%；根據(jù)所建立的線性回歸方程計(jì)算樣品溶液中的2KGA質(zhì)量濃度，RSD值為2.38%，可見(jiàn)樣品溶液在2h內(nèi)穩(wěn)定性良好(表3)。

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取相同的發(fā)酵液5份，按1.2.1節(jié)方法分別進(jìn)行處理，測(cè)定所得各個(gè)樣品溶液的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度，RSD值分別為0.59%和2.30%；根據(jù)所建立的線性回歸方程計(jì)算樣品溶液中的2KGA質(zhì)量濃度，RSD值為0.62%，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好(表4)。

表4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Reproducibility determination of 2-KGA

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

表5 2KGA的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Recovery rates and RSD of spiked samples

準(zhǔn)確量取已知2KGA質(zhì)量濃度的發(fā)酵液125mL，精密加入0.6274g的2KGA鈣鹽(含2KGA 0.5000g，與發(fā)酵液混合前用5mL左右的蒸餾水溶解)，按1.2.1節(jié)方法制備樣品溶液，平行5份。測(cè)定各個(gè)樣品溶液的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度，并根據(jù)所建立的線性回歸方程計(jì)算樣品溶液中的2KGA質(zhì)量濃度。計(jì)算結(jié)果表明，2KGA的5次平均回收率為102.60%，RSD為2.17%(表5)。

3 結(jié) 論

樣品溶液的旋光度、2-酮基-D-葡萄糖酸質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系。2KGA的旋光法測(cè)定技術(shù)具有精密度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好、操作經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，可用于發(fā)酵液中2KGA的定量測(cè)定。

[1] CHIA M, NGUYEN T B V, CHOI W J. DO-stat fed-batch production of 2-keto-D-gluconic acid from cassava using immobilizedPseudomonas aeruginosa[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78:759-765.

[2] 孫文敬, 趙峰梅, 楊慶文, 等. 補(bǔ)料分批培養(yǎng)生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的研究[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(11):115-117.

[3] 錢(qián)俊青. 間接發(fā)酵法生產(chǎn)異維生素C鈉的中間體分析方法的探討[J].食品工業(yè), 1996(1):54-56.

[4] SAICHANA I, ANO Y, ADACHI O, et al. Preparation of enzymes required for enzymatic quantification of 5-keto-D-gluconate and 2-keto-D-gluconate[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2007, 71(10):2478-2486.

[5] STUBBS J J, LOCKWOOD L B, ROE E T, et al. Bacterial production of ketogluconic acids from glucose[J]. Ind Eng Chem, 1940, 32:1626-1631.

[6] 史建國(guó), 楊俊慧, 孟慶軍, 等. 發(fā)酵生產(chǎn)中還原糖和葡萄糖檢測(cè)指標(biāo)的分析[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(10):165-166.

[7] 李耀明, 梁劍寧, 劉光明, 等. 氧速率法與酶法測(cè)葡萄糖的方法學(xué)探討[J]. 國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào), 2004, 10(16):139-140.

[8] 周麗萍, 姜旭淦, 徐軍, 等. 葡萄糖脫氫酶法測(cè)定血清葡萄糖的方法學(xué)評(píng)價(jià)[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2006, 16(4):301-303.

[9] 周娟, 陳滋青, 胡軍. 葡萄糖測(cè)定方法的比較研究[J]. 工業(yè)微生物,1999, 29(4):34-36.

[10] 戴新華, 齊韜, 楊夢(mèng)瑞, 等. 血清中葡萄糖含量的測(cè)定方法及其研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)分析計(jì)量, 2008, 17(3):78-80.

[11] 孫士清, 王寧, 何偉, 等. 酶電極法測(cè)定葡萄糖注射液中葡萄糖含量的研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 1994, 29(9):546-547.

[12] 李憲民, 丁芳, 樊偉麗, 等. 生物傳感分析儀測(cè)定葡萄糖和L-乳酸的影響因素研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 30(2):289-291.

Determination of 2-Keto-D-gluconic Acid in Fermentation Broth by Polarimetry

SUN Wen-jing1，ZHOU Yan-zheng1，F(xiàn)ENG Xiao-yan2，WEI Zhuan3，YU Si-lian4，ZHOU Qiang4
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China；3. Department of Pharmaceutical, Hebei Chemical and Pharmaceutical College, Shijiazhuang 050026, China；4. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China)

TQ921.2

A

1002-6630(2010)22-0375-03

2010-05-05

江蘇大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(08JDG029)；江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2008DD00600)；江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(贛財(cái)教[2008]147號(hào))

孫文敬(1964—)，男，研究員，博士，主要從事生物化工研究。E-mail：sunwenjing1919@163.com