朱 珠，冷進(jìn)松

(吉林工商學(xué)院食品工程分院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化仙人掌黃酮提取工藝

朱 珠，冷進(jìn)松

(吉林工商學(xué)院食品工程分院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

利用響應(yīng)面分析法對(duì)仙人掌中黃酮類物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。先通過(guò)單因素試驗(yàn)，然后選取適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)因素與水平，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用四因素三水平響應(yīng)面分析法，對(duì)各個(gè)因素的顯著性和交互作用進(jìn)行分析。結(jié)果表明：仙人掌黃酮醇提工藝的最佳條件為液料比20:1(mL/g)、浸提溫度52.5℃、浸提時(shí)間4h、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，在該條件下測(cè)得的仙人掌黃酮最大提取率為0.784%。

仙人掌；黃酮；提取；響應(yīng)面法

Abstract：Response surface methodology was used to optimize the extraction processing of cactus flavonoids according to central composite design principle based on the single factor experimental results. Through screening of factors and levels, and the analysis of cross-interaction among factors, the optimal extraction conditions for cactus flavonoids were material-liquid ratio of 1:20, extraction temperature of 52.5 ℃, extraction time of 4 h, and alcohol concentration of 85%. The extraction rate of flavonoids was 0.784% under the optimal extraction conditions.

Key words：cactus；flavonoids；extraction；response surface methodology

仙人掌屬多年生肉質(zhì)草本植物，其種類約有300多種，它營(yíng)養(yǎng)豐富。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)：仙人掌含有生物堿類、黃酮類、甾醇類等功能性成分，具有降血脂、降血壓、降血糖的作用。黃酮具有增強(qiáng)心血管功能、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老及抗氧化、降血糖、降血壓等作用[1]。響應(yīng)面分析法(response surfacemethodology)系采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，將多因子試驗(yàn)中因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式近似擬合，依此可對(duì)函數(shù)的響應(yīng)面和等高線進(jìn)行分析，研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系。它與過(guò)去廣為使用的“正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法”不同，具有試驗(yàn)周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)[2]。為了更大程度地開發(fā)利用仙人掌資源，本實(shí)驗(yàn)著重研究利用響應(yīng)面分析法得到其中黃酮類物質(zhì)的最優(yōu)提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用仙人掌 長(zhǎng)春生態(tài)園大棚種植基地；蘆丁對(duì)照品 南京替斯艾么中藥技術(shù)研究所；乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、石油醚(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S型恒溫水浴鍋 鞏義濕英峪予華儀器廠；UV-2102C型紫外-可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHRZ-Ⅲ循環(huán)真空水泵 上海予華儀器設(shè)備有限公司；SXT-02索氏抽提器 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；AY120型托盤電子分析天平 日本島津制作所。

1.3 方法

1.3.1 回流提取法提取工藝

1.3.1.1 工藝流程

1.3.1.2 操作要點(diǎn)

稱取仙人掌干粉2.0g，加入70%乙醇100mL，浸泡30min，55℃條件下回流提取2h，然后取出用布氏漏斗抽濾，保留濾液，濾渣用70%乙醇100mL再次浸泡30min，二次回流2h。取出抽濾，將兩次得到濾液合并，濾液濃縮并用70%乙醇溶液定容至25mL，得黃酮提取液原料，以備后用。

1.3.2 仙人掌中黃酮的提取和測(cè)定

精確稱取2.0g仙人掌粉到具塞三角瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入乙醇溶液，在恒溫水浴下振蕩提取一定時(shí)間，冷卻后過(guò)濾至50mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液洗滌濾渣及定容。取濾液2mL，按2.1節(jié)方法測(cè)定吸光度，試劑空白參比。黃酮提取率按下式計(jì)算[3]：

式中：Y為定容后提取液中蘆丁含量/(mg/mL)；50為仙人掌粉提取液定容后的體積/mL； 25為2mL提取液定容后體積/mL；2為從50mL提取液中吸取的體積/mL；2000為仙人掌粉質(zhì)量/mg。

1.3.3 回流提取法最佳提取條件的選擇[4]

1.3.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

稱取2.0g食用仙人掌干粉5份，分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇100mL，在90℃條件下進(jìn)行回流提取2h。取出抽濾，棄去濾渣，濾液分別濃縮并定容至25mL。準(zhǔn)確吸取2mL樣液，測(cè)定吸光度A，利用黃酮含量測(cè)定公式得出黃酮類物質(zhì)的含量。

1.3.3.2 液料比對(duì)提取率的影響

稱取2.0g食用仙人掌干粉5份，分別按液料比14:1、17:1、20:1、23:1、26:1(mL/g)加入70%乙醇，其操作步驟同1.3.3.1節(jié)。最后測(cè)定濾液試樣吸光度A，得出黃酮類物質(zhì)的含量。

1.3.3.3 溫度對(duì)提取率的影響

稱取2.0g食用仙人掌干粉5份，分別加入70%乙醇100mL，于50、60、70、80、90℃條件下回流提取2h，其操作步驟同1.3.3.1節(jié)，測(cè)定吸光度A，得出黃酮類物質(zhì)的含量。

1.3.3.4 時(shí)間對(duì)提取率的影響

稱取2.0g食用仙人掌干粉5份，分別提取1、2、3、4、5h，其操作步驟同1.3.3.1節(jié)，測(cè)定吸光度A，得出黃酮類物質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程的建立[5-6]

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0128g，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶解，定容至50mL，得到質(zhì)量濃度為0.256mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5mL于6個(gè)25mL容量瓶中，各加入20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的AlCl3溶液，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇定容至刻度，靜置10min后于420nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，試劑空白參比。用最小二乘法作線性回歸，得蘆丁質(zhì)量濃度Y/(mg/mL)與吸光度A的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程：Y=0.04542X＋0.000465，相關(guān)系數(shù)R=0.99984。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃酮的提取率呈先上升后下降趨勢(shì)，在80%時(shí)達(dá)到最大值，對(duì)應(yīng)黃酮提取率為0.688%，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于80%時(shí)，其提取率反而下降。由于高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液使得一些醇溶性雜質(zhì)、色素(葉綠素等)、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)，與乙醇-水分子體系結(jié)合，參與顯色反應(yīng)進(jìn)而影響最終的測(cè)定，干擾因素隨之增大。從而導(dǎo)致黃酮類化合物的提取率不升反降[7]。

2.3 液料比對(duì)提取率的影響

圖2 液料比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of flavonoids

由圖2可知，隨著液料比的增大，仙人掌中黃酮的提取率呈先增大后逐漸平衡的趨勢(shì)，從14:1(mL/g)到23:1(mL/g)時(shí)提取率增幅較大。隨著液料比的繼續(xù)增大，其提取率變化不大，繼續(xù)加大液料比，會(huì)造成提取液的浪費(fèi)，同時(shí)會(huì)給后續(xù)工藝帶來(lái)新的困難[8]。從節(jié)約原料方面考慮，最終確定料液比的最佳范圍為17:1～20:1(mL/g)。

2.4 提取溫度對(duì)提取率的影響

圖3 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，黃酮提取率增加，在60℃時(shí)達(dá)到最大值。隨著溫度的繼續(xù)升高，提取率逐漸降低。提取溫度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致大量醇溶性雜質(zhì)加速溶解，從而阻礙了黃酮類化合物在乙醇中的溶解度，降低了黃酮類化合物提取率。在高溫高氧的環(huán)境下，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被氧化破壞，從而導(dǎo)致黃酮類提取率的下降。因此，提取溫度的最佳范圍為 50～60℃[9]。

2.5 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加，仙人掌中黃酮的提取率呈先增大后逐漸降低的趨勢(shì)，從1h到4h時(shí)提取率增幅較大，在4h時(shí)達(dá)到最大。開始時(shí)，提取時(shí)間的增加，增加了黃酮類化合物在乙醇中的溶解，提高了其提取率，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)使其他醇溶性物質(zhì)同時(shí)被溶解提取，妨礙了黃酮類化合物的溶解度，其他醇溶性雜質(zhì)的存在會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，需對(duì)提取時(shí)間加以控制[10]。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化仙人掌黃酮提取工藝

2.6.1 黃酮提取因素水平和試驗(yàn)方案[11]

表1 試驗(yàn)因素水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface methodology

表2 仙人掌黃酮提取響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology for the extraction of cactus flavonoids

根據(jù)Central Composite實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間和液料比4個(gè)對(duì)黃酮提取率影響較大的因素，對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，具體方案見表1、2。

仙人掌黃酮類物質(zhì)提取率及含量檢測(cè)結(jié)果見表3，采用Design-Experts 程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，4個(gè)因素經(jīng)過(guò)擬合得到黃酮提取率回歸方程如下所示：

當(dāng)P值小于0.05即表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著，從表3的分析結(jié)果來(lái)看，整體模型的P值小于0.0001，表明該二次方程模型極顯著[12-13]。液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)影響顯著，而浸提時(shí)間和浸提溫度影響不顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)結(jié)果的影響排序，液料比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞浸提時(shí)間＞浸提溫度。

表3 仙人掌黃酮提取工藝參數(shù)數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Result analysis of response surface methodology for optimizing extraction processing of cactus flavonoids

2.6.2 因素間的交互影響

圖5 各因素間交互作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of cross-interactions among different factors on extraction rate of flavonoids from cactus

根據(jù)擬合模型繪制仙人掌黃酮提取率三維響應(yīng)面圖見圖5，在所選范圍內(nèi)存在極值，即存在響應(yīng)面最高點(diǎn)。圖5 a表明，提取溫度低、時(shí)間短時(shí)，黃酮提取率低；但溫度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致黃酮得率下降，這可能是由于時(shí)間長(zhǎng)、溫度高使黃酮分解[14]。圖5b表明，在液料比較大范圍內(nèi)均可以得到較大的Y響應(yīng)值，在液料比20:1(mL/g)、溫度52.5℃附近可以達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)，與ANOVA分析[15]結(jié)果吻合。圖5c表明，提取溫度適中，乙醇體積分?jǐn)?shù)在較大范圍內(nèi)均可以得到較高的提取率。圖5d中的等高線為橢圓形，在提取時(shí)間比較短時(shí)，液料比對(duì)總黃酮的得率影響非常顯著，表現(xiàn)為曲線比較陡，說(shuō)明在提取時(shí)間不是很充足時(shí)，提高液料比能明顯提高總黃酮的得率，而在提取時(shí)間較充分時(shí)，液料比對(duì)總黃酮的得率影響不是很明顯，表現(xiàn)為曲線比較平緩，即提取時(shí)間比較充分的狀況下，即使提高液料比，總黃酮的得率也得不到明顯提高。圖5e表明，在乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時(shí)間4h附近可以達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)。圖5f表明，在乙醇體積分?jǐn)?shù)較高、液料比較大的范圍內(nèi)可以達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)。由Design-Expert軟件優(yōu)化程序分析仙人掌黃酮含量相對(duì)較高的提取工藝參數(shù)范圍為提取時(shí)間3.5～4.0h、提取溫度45～55.2℃、液料比17:1～23:1(mL/g)，仙人掌黃酮提取率可以達(dá)到0.75%～0.81%?？偟膩?lái)看，4個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)黃酮提取率及含量響應(yīng)值的影響均不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，平方項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值也有很大的影響；提取溫度和提取時(shí)間對(duì)仙人掌黃酮提取率有著顯著的影響。

2.7 浸提工藝條件的確定

通過(guò)軟件Design-Expert 7.0求解方程，得出最優(yōu)浸提工藝條件為液料比20:1(mL/g)、浸提溫度52.5℃、浸提時(shí)間4h、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，此時(shí)仙人掌黃酮的提取率達(dá)到極值0.796%。為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用修正條件進(jìn)行浸提實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得出仙人掌黃酮的實(shí)際提取率為0.784%，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。因此，可知利用響應(yīng)面分析法得到的仙人掌黃酮浸提工藝參數(shù)真實(shí)可靠，有實(shí)用價(jià)值[16]。

3 結(jié) 論

應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化仙人掌黃酮的浸提工藝，結(jié)果表明：獲得最高仙人掌黃酮提取率所需的最佳工藝條件為液料比20:1(mL/g)、浸提溫度52.5℃、浸提時(shí)間4h、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，仙人掌黃酮的提取率為0.784%。

本次研究通過(guò)響應(yīng)面分析，在試驗(yàn)范圍之內(nèi)找到了最佳控制點(diǎn)。與正交設(shè)計(jì)的方差分析相比，響應(yīng)面回歸分析能夠更準(zhǔn)確地指明最佳控制條件，而正交設(shè)計(jì)僅能從試驗(yàn)預(yù)先設(shè)定的幾個(gè)水平中優(yōu)選組合，因此正交設(shè)計(jì)得到的最佳工藝條件，并非真實(shí)意義的最佳條件，只能說(shuō)是理想條件。另外響應(yīng)面中的嶺脊分析還可在曲面復(fù)雜時(shí)，在試驗(yàn)范圍之外找到最佳控制點(diǎn)，從而確定新的試驗(yàn)方向，這是正交設(shè)計(jì)的方差分析所不能比擬的。這在進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)，由此可以看出建立的模型與實(shí)際情況是比較吻合的。

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Optimization of Extraction for Cactus Flavonoids by Response Surface Methodolgy

ZHU Zhu，LENG Jin-song
(Branch of Food Engineering, Jilin Business and Technology College, Changchun 130062, China)

R284.2

A

1002-6630(2010)22-0185-05

2010-06-25

吉林省教育廳“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字[2007]第253號(hào))

朱珠(1960—)，女，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：zzabc2008@126.com