吳 越，沈 碩，熊善柏，趙思明，黃琪琳,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北 武漢430070；3.湖北省水產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070)

匙吻鱘軟骨蛋白酶解工藝優(yōu)化

吳 越1,2,3，沈 碩1,3，熊善柏1,2,3，趙思明1,2,3，黃琪琳1,2,3,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北 武漢430070；3.湖北省水產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070)

為提高匙吻鱘軟骨蛋白的利用價(jià)值和生物活性，以匙吻鱘軟骨為原料，經(jīng)微波-堿法提取軟骨蛋白，通過單因素試驗(yàn)確定堿性蛋白酶酶解軟骨蛋白的關(guān)鍵因素為酶解溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值和酶的用量。經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定了酶解的最佳工藝條件。結(jié)果表明：最佳酶解工藝條件為酶解溫度50℃、軟骨蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、pH7.5、酶用量9000U、酶解時(shí)間5h，在此條件下氨基酸態(tài)氮生成率最高，達(dá)到21.89%。

匙吻鱘；軟骨蛋白；酶解

Abstract：In order to improve the utilization value and biological activity of cartilage protein,Polyodon spathulacartilage was used as the material to extract cartilage protein by microwave-alkali extraction method. The optimal enzymatic hydrolysis conditions of cartilage protein were explored by single factor and orthogonal experiments to be enzymatic hydrolysis temperature of 50 ℃, cartilage protein concentration of 1%, hydrolysis pH of 7.5, alkaline protease amount of 9000 U, and hydrolysis time of 5 h. The yield of amino nitrogen was 21.89% under the optimal conditions.

Key words：Polyodon spathula；cartilage protein；enzymatic hydrolysis

匙吻鱘是地球上最古老和最原始的軟骨魚種之一[1]，屬于鱘形目(Acipenserifomes)匙鱘科(Polyodon)。匙吻鱘通體為軟骨，素來有“鯊魚翅、鱘魚骨，食之明目壯陽，延年益壽”之說[2]。我國匙吻鱘大量養(yǎng)殖，產(chǎn)量增加，軟骨也隨之增多[3]。從鯊魚軟骨中提取得到對腫瘤和胚胎的新生血管生長具有抑制作用的活性因子，并證實(shí)它是一種蛋白質(zhì)[4-7]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]，匙吻鱘軟骨中含有抗癌、降血脂、降膽固醇、增加人體免疫力以及美容保健等功效成分。其中主要的功效成分為蛋白和多糖，而軟骨蛋白具有較大的分子質(zhì)量，利用生物方法或堿對蛋白進(jìn)行處理，可以降低其分子質(zhì)量，從而提高軟骨蛋白的利用價(jià)值和生物活性[11]。因此本研究采用微波-堿法提取軟骨蛋白，以堿性蛋白酶酶解軟骨蛋白，并通過單因素和正交試驗(yàn)確定酶解的最佳工藝，為今后匙吻鱘功效成分的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

匙吻鱘軟骨：由仙桃水產(chǎn)品推廣中心提供活魚，本實(shí)驗(yàn)室制備，并粉碎至1～2mm備用；堿性蛋白酶(酶活12000U/g) 廣西龐博生物工程有限公司。

AC2IOS型電子分析天平 德國Sartorius公司；HH-6型電子恒溫水浴鍋 江蘇省常州市國華電器有限公司；818型pH計(jì) 美國奧立龍公司；TDL-5-A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器；UV265FW型紫外-可見分光光度計(jì)日本Shimadzu公司。

1.2 方法

1.2.1 軟骨蛋白的制備

稱取一定量的軟骨加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的稀堿溶液[液料比為15:1(mL/g)]，置于小燒杯中，用玻璃蓋好，在360W條件下，采用間歇式微波加熱，然后取出冷卻，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至中性，離心(3000r/min，10min)取上清液，加入等體積的95%乙醇，4℃放置過夜，離心后取沉淀，用少量蒸餾水溶解，冷凍干燥，得軟骨蛋白。

1.2.2 測定方法

蛋白酶活力測定用Folin-酚法[12]；氨基酸態(tài)氮含量測定用茚三酮法[13]；總氮含量測定用微量凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》)。氨基酸態(tài)氮生成率的計(jì)算：DH=AN/TN×100(式中：DH為氨基酸態(tài)氮生成率/%；AN為氨基酸態(tài)氮含量/%；TN為總氮含量/%)。

1.3 酶解軟骨蛋白的單因素試驗(yàn)

1.3.1 溫度對氨基酸態(tài)氮生成率的影響

配制一系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的軟骨蛋白溶液，在pH8.0的條件下，加入堿性蛋白酶9000U，分別在30、35、40、45、50、55、60、65℃條件下保溫5h后，100℃水浴滅酶5min，取酶解液測氨基酸態(tài)氮生成率。

1.3.2 酶用量對氨基酸態(tài)氮生成率的影響

配制一系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的軟骨蛋白溶液，在pH8.0的條件下，分別加入250、750、1000、2000、3000、6000、9000、12000U的堿性蛋白酶，于50℃保溫5h后，100℃水浴滅酶5min，取酶解液測氨基酸態(tài)氮生成率。

1.3.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對氨基酸態(tài)氮生成率的影響

分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、l%、2%、3%、4%、5%的軟骨蛋白溶液，在pH8.0的條件下，加入堿性蛋白酶9000U，50℃保溫5h后，100℃水浴滅酶5min，取酶解液測氨基酸態(tài)氮生成率。

1.3.4 pH值對氨基酸態(tài)氮生成率的影響

分別選擇體系pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，加入堿性蛋白酶9000U，50℃保溫5h后，100℃水浴滅酶5min，取酶解液測氨基酸態(tài)氮生成率。

1.3.5 酶解時(shí)間對氨基酸態(tài)氮生成率的影響

配制一系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的軟骨蛋白溶液，在pH8.0的條件下，加入堿性蛋白酶9000U，于50℃分別保溫1、2、3、4、5、6、7 h后，100℃水浴滅酶5min，取酶解液測氨基酸態(tài)氮生成率。

1.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對酶解pH值、溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)及酶用量進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)如表1所示，以氨基酸態(tài)氮生成率為指標(biāo)確定酶解最佳工藝條件。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用SAS 8.1和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響

圖1 溫度對軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由圖1可知，隨溫度的升高，氨基酸態(tài)氮生成率增加，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮生成率最高，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮生成率反而下降；其原因是酶有其最適的反應(yīng)溫度，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高酶促反應(yīng)的速度會(huì)增加，但溫度過高時(shí)，會(huì)引起酶變性而喪失其催化活性，當(dāng)酶達(dá)到最適的反應(yīng)溫度時(shí)，酶的活力最大，水解蛋白質(zhì)的量越多[15-16]。

2.2 酶用量對軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響

圖2 酶用量對軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由圖2可知，隨酶用量的增加，氨基酸態(tài)氮生成率逐漸提高，在250～6000U范圍內(nèi)，氨基酸態(tài)氮生成率增加較快，在達(dá)到9000U時(shí)，繼續(xù)增加酶的用量，氨基酸態(tài)氮生成率的變化不大。根據(jù)酶的酶解特性，酶的用量過多會(huì)造成浪費(fèi)，過少會(huì)使水解不徹底[17]，故綜合分析后選擇酶的用量為9000U。

2.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響

圖3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由圖3可知，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的情況下，氨基酸態(tài)氮生成率隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)?shù)孜锾砑恿繛?.0%時(shí)，氨基酸態(tài)氮生成率最高，而底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，黏度太大，阻礙了酶和底物充分接觸，不利于酶解的進(jìn)行，氨基酸態(tài)氮生成率反而降低，這和李秀霞等[18]在研究雞骨蛋白酶解工藝中的結(jié)果一致。

2.4 pH值對軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響

圖4 pH值對軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響Fig.4 Effect of pH on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由圖4可知，開始時(shí)，隨著pH值的升高，氨基酸態(tài)氮生成率逐漸增大，當(dāng)pH值達(dá)到8.0時(shí)，氨基酸態(tài)氮生成率達(dá)到最大值，當(dāng)pH＞8.0時(shí)氨基酸態(tài)氮生成率開始下降，因此酶解的最適pH值為8.0。酶活力對其環(huán)境pH值十分敏感，因?yàn)榄h(huán)境的pH值直接影響著酶及蛋白質(zhì)分子某些解離基團(tuán)的解離狀態(tài)，只有在特定的pH值條件下，解離基團(tuán)處于特定的解離狀態(tài)時(shí)，酶分子與底物蛋白分子才會(huì)結(jié)合得更快更好，酶解速度也就更快[19]，即單位時(shí)間內(nèi)的生成率就高。

2.5 酶解時(shí)間對軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響

圖5 酶解時(shí)間對軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由圖5可知，隨著酶解時(shí)間的延長，軟骨蛋白氨基酸態(tài)氮生成率逐漸增加，在1～5h時(shí)，氨基酸態(tài)氮生成率增加較快，但反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5h后增加的速度較慢，因此，選擇酶解時(shí)間為5h。

2.6 正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)，確立了各個(gè)單因素酶解的最佳水平值。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化考察范圍，以便確立最佳的工藝水平條件。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiments

極值R越大，說明該因素的影響效應(yīng)越大，從表2中可以看出，影響匙吻鱘魚酶解的因素依次為溫度＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞pH值＞酶用量，即溫度的影響最大，其他因素較小。從試驗(yàn)結(jié)果得出，最佳酶解工藝條件為A1B2C2D2，即酶解溫度50℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、pH7.5、酶用量9000U，此時(shí)氨基酸態(tài)氮生成率為21.89%。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)，對影響堿性蛋白酶酶解匙吻鱘軟骨蛋白的幾個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行考察，在此基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)對其進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳酶解工藝條件為酶解溫度50℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、pH7.5、酶用量9000U。在此條件下酶解5h，氨基酸態(tài)氮生成率最高，達(dá)到21.89%。

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Optimal Enzymatic Degradation of Cartilage Protein fromPolyodon spathula

WU Yue1,2,3，SHEN Shuo1,3，XIONG Shan-bai1,2,3，ZHAO Si-ming1,2,3，HUANG Qi-lin1,2,3,*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；2. National R & D Branch Center for Conventional Freshwater Fish Processing, Wuhan 430070, China；3. Aquatic Product Engineering and Technology Research Center of Hubei Province, Wuhan 430070, China)

TS254.4

A

1002-6630(2010)22-0160-04

2010-06-30

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD30B01)

吳越(1987—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：warden1987210@yahoo.com.cn

*通信作者：黃琪琳(1974—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称反蠓肿咏Y(jié)構(gòu)及功能特性。E-mail：hql@mail.hzau.edu.cn