王青豪，方 芳，張熊祿

(贛南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000)

微波輔助提取絞股藍(lán)黃酮工藝研究

王青豪，方 芳，張熊祿

(贛南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000)

采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，進(jìn)行微波輔助提取絞股藍(lán)黃酮的工藝研究，得到微波輔助提取絞股藍(lán)黃酮的最佳工藝條件：溶劑為30%乙醇溶液、料液比1:32(g/mL)、微波處理時(shí)間15min；在此工藝條件下絞股藍(lán)黃酮提取率為4.18%。與索氏提取法相比，微波輔助提取既能縮短提取時(shí)間又能提高絞股藍(lán)黃酮的提取率。

絞股藍(lán)；黃酮；微波輔助提??；工藝

Abstract：Microwave-assisted extraction of flavonoids fromGynstemma pentaphyllumwas explored by single factor and orthogonal experiments. The optimal extraction processing parameters were 30% ethanol as solvent, material-liquid ratio of 1:32 (g/mL), and microwave treatment time of 15 min. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllumwas 4.18%. Compared with traditional extraction method, microwave-assisted extraction can shorten extraction time and improve the extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllum.

Key words：Gynstemma pentaphyllum；flavonoids；microwave-assisted extraction；processing technology

絞股藍(lán)[Gynostemma pentaphyllum(Thunb.) Makino]是葫蘆科絞股藍(lán)屬的多年生草質(zhì)藤本植物，素有“南方人參”之美稱。絞股藍(lán)性寒、味甘、微苦，歸肺、脾、心、腎經(jīng)，有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清肺化痰、養(yǎng)心安神之功效[1]。在絞股藍(lán)的活性成分中，黃酮類化合物是除皂苷、多糖外的另一種主要活性成分，尤其葉中含量最多，但對絞股藍(lán)黃酮類化合物的研究較少[2-3]。

國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物有數(shù)千種，其中大多數(shù)具有顯著的生理活性，對一些常見病、多發(fā)病有重要的生理作用，如有抗氧化和清除氧自由基作用；抗癌、防癌作用；改善心腦血管循環(huán)、擴(kuò)張冠狀動脈血管、松弛支氣管、利尿以及明顯的抗血小板活化因子等作用[4-5]。

傳統(tǒng)的黃酮提取方法有浸提法、索氏法和回流法等[6-7]。微波提取技術(shù)能強(qiáng)化浸提過程，具有加熱快且均勻、節(jié)能、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)既能降低操作費(fèi)用，又合乎環(huán)境保護(hù)的要求，是一種有良好發(fā)展前景的新工藝，已被廣泛應(yīng)用于植物有效活性成分提取。采用微波技術(shù)能提高天然產(chǎn)物的萃取效率，與常規(guī)方法相比可大大縮短提取所需的時(shí)間[8-10]。本研究采用微波輻射從絞股藍(lán)茶葉中提取黃酮類化合物，期望為絞股藍(lán)黃酮的進(jìn)一步精制及其應(yīng)用研究提供依據(jù)[11-14]。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

絞股藍(lán)茶葉(產(chǎn)自粵北丹霞山)。蘆丁、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁(均為分析純)、氫氧化鈉。

722光柵分光光度計(jì) 上海第三儀器廠；三樂牌WP650D家用微波爐(經(jīng)南京藍(lán)通科工貿(mào)有限公司改裝)；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[15-16]

準(zhǔn)確稱取0.1326g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品，用30%乙醇溶解并定容于500mL棕色容量瓶中，待用。分別移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL于6只50mL容量瓶中，各加入1.0mL 50g/L NaNO2溶液混勻，放置6min后加入1.0mL 100g/L Al(NO3)3溶液混勻，放置6min，再加入10.0mL 40g/L NaOH溶液，最后用30%乙醇定容至刻度，再放置15min后于500nm波長處測其吸光度A，以蘆丁質(zhì)量濃度Y(g/L)為縱坐標(biāo)、吸光度A為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蘆丁質(zhì)量濃度Y(g/L)與吸光度A的線性回歸方程為：Y=0.1078A+0.00314(r=0.9995)，蘆丁質(zhì)量濃度Y在0.0053～0.0424g/L范圍內(nèi)與吸光度A之間有較好的線性關(guān)系。

1.2.2 絞股藍(lán)黃酮提取工藝流程

絞股藍(lán)茶葉→稱量→溶劑浸泡→微波處理→過濾除雜→回收乙醇→濃縮液用水定容→分光光度法檢測提取液中的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)→計(jì)算黃酮提取率

1.2.3 索氏提取法

采用索氏提取器提取絞股藍(lán)茶葉中的總黃酮，提取液按制定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色后測其吸光度A，代入回歸方程計(jì)算其黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及總黃酮質(zhì)量，再除以原料絞股藍(lán)茶葉的質(zhì)量即為絞股藍(lán)茶葉中總黃酮的百分含量(索氏提取法的黃酮提取率)，據(jù)此與微波輔助法進(jìn)行比較。

1.2.4 微波輔助提取單因素試驗(yàn)

在微波輻射功率固定、絞股藍(lán)茶葉粒度固定的條件下，影響黃酮提取率的因素有提取次數(shù)、溫度、溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波輻射時(shí)間等。在一次提取絞股藍(lán)黃酮時(shí)，物系溫度隨微波輻射時(shí)間(微波功效)而升高。因此本實(shí)驗(yàn)僅考查乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和微波時(shí)間對絞股藍(lán)黃酮提取率的影響。

1.2.5 微波輔助提取工藝條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果與分析選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波時(shí)間3個(gè)因素，各設(shè)定3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

選用250mL圓底燒瓶，每次試驗(yàn)固定溶劑體積160mL，根據(jù)不同的料液比而改變原料質(zhì)量。為了控制回流高度，微波爐采用20%功率檔(每30s只輻射6s，間隔24s。微波功效為130W/min)。提取液根據(jù)各組實(shí)驗(yàn)情況回收乙醇，濃縮液用蒸餾水定容至500mL，取2.0mL按制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色，最后用30%的乙醇定容于50mL后檢測其吸光度，按1.2.6節(jié)公式計(jì)算黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和黃酮提取率。

1.2.6 黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和黃酮提取率的計(jì)算公式

提取液中黃酮質(zhì)量濃度C/(g/L)=(0.1078A+0.00314)×25

2 結(jié)果與分析

2.1 索氏法提取絞股藍(lán)黃酮

準(zhǔn)確稱取干燥有固定粒度的5.0g絞股藍(lán)茶葉，用脫脂濾紙包好放入索氏抽提器中，用95%乙醇160mL抽提14h，至虹吸管中無顏色為止。提取液回收乙醇后用蒸餾水定容于500mL容量瓶中，取2.0mL按制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色，最后用30%乙醇定容于50mL容量瓶中，測得吸光度為0.093，按1.2.6節(jié)的方法計(jì)算黃酮提取率。提取液中黃酮質(zhì)量濃度C=0.329g/L，黃酮提取率為3.29%，即以95%乙醇為溶劑，采用傳統(tǒng)的索氏提取法，絞股藍(lán)黃酮的提取率是3.29%。

2.2 微波輔助提取單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對絞股藍(lán)黃酮提取率的影響

精確稱取干燥有固定粒度的5.0g絞股藍(lán)茶葉放入250mL圓底燒瓶內(nèi)，加入溶劑浸泡至絞股藍(lán)茶葉充分濕潤后再進(jìn)行微波輔助提取絞股藍(lán)黃酮。為了控制回流高度，微波爐采用20%功率檔(每30s只輻射6s，間隔24s。微波功效為130W/min)。在固定條件下：料液比1:24(g/mL)、微波時(shí)間30min，分別用95%、60%、30%和0%(純水)乙醇進(jìn)行微波輔助提取黃酮，過濾除渣，提取液回收乙醇后用蒸餾水定容于500mL容量瓶中，取2.0mL按制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色，最后用30%乙醇定容于50mL容量瓶中，測定吸光度，按1.2.6節(jié)方法計(jì)算黃酮提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllum

由圖1可以看出，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大提取率先是增加而后則緩慢降低，這是因?yàn)辄S酮類化合物為多羥基酚類其極性比乙醇強(qiáng)而比水弱，較易溶于中等體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液。另外，用純水時(shí)得到的提取液泡沫多，難過濾，其原因是提取液含有較多的多糖和氨基酸。而用95%乙醇時(shí)，皂苷、色素及其他脂溶性物質(zhì)溶出也較多，而且溶劑的揮發(fā)性大，生產(chǎn)成本也提高。因此，初步確定30%～60%的乙醇為合適的溶劑。

2.2.2 料液比對絞股藍(lán)黃酮提取率的影響

圖2 料液比對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllum

在固定條件下：30%乙醇、微波時(shí)間30min，分別以料液比1:32、1:24、1:16、1:8(g/mL)，按2.2.1節(jié)方法進(jìn)行微波輔助提取并檢測黃酮，并按1.2.6節(jié)方法計(jì)算黃酮提取率，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，隨液體量的增大提取率也增大，提取率先是增加較多而后趨近于最大值，這是因?yàn)橐后w量太低時(shí)溶劑不能完全溶脹原料以及完全溶解出黃酮，但太高時(shí)又增加生產(chǎn)成本以及增加后續(xù)處理的難度。因此，初步確定1:32～1:16(g/mL)為合適的料液比。

2.2.3 微波時(shí)間對絞股藍(lán)黃酮提取率的影響

按2.2.1節(jié)方法，在固定條件下：30%乙醇、料液比1:24(g/mL)，分別用60、30、15、5min微波輔助提取并檢測黃酮，并按1.2.6節(jié)方法計(jì)算黃酮提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 微波時(shí)間對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of microwave treatment time on extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllum

由圖3可以看出，隨微波時(shí)間的增加提取率先是增加較多，達(dá)到最大值后隨著微波時(shí)間的增加提取率反而有所下降。這是因?yàn)槲⒉ǖ淖饔脵C(jī)制是微波直接作用于分子，使分子的熱運(yùn)動加劇，從而引起溫度升高，可以快速破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的有效成分更快的分離浸提出來。當(dāng)微波時(shí)間達(dá)到15min以上時(shí)細(xì)胞破裂完全，細(xì)胞內(nèi)的有效成分大部分可浸提出來。但試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，微波時(shí)間為60min時(shí)絞股藍(lán)茶葉有焦化現(xiàn)象，黃酮提取率反而降低，這可能是長時(shí)間輻射后絞股藍(lán)茶葉中的有效成分結(jié)構(gòu)被破壞的結(jié)果。因此，初步確定10～20min為合適的微波處理時(shí)間。

2.3 微波輔助提取工藝正交試驗(yàn)

表1 L9(33)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

由表2中的平均值k和極差R分析表明：正交試驗(yàn)考察的3個(gè)因素對微波輔助提取絞股藍(lán)黃酮影響大小順序?yàn)榱弦罕龋疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞微波時(shí)間。得出的最佳提取工藝組合是乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、料液比1:32(g/mL)、微波處理時(shí)間15min。為考察正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件的穩(wěn)定性，以最佳工藝條件做重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在此條件下絞股藍(lán)黃酮的提取率為4.18%，說明正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理有效。

表2 L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

料液比1:32(g/mL)與1:24(g/mL)的平均提取率k相差很小，因此，若在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，參照最佳工藝條件，為節(jié)省溶劑以及減輕后續(xù)處理，也可選擇30%乙醇、料液比1:24(g/mL)、100%功率檔(微波功效為650W/min)微波輔助提取3min，同樣也可以達(dá)到較好的提取效果，此條件下的黃酮提取率是4.13%。

以絞股藍(lán)茶葉為原料，索氏法提取14h，其黃酮提取率是3.29%；而用微波輔助法提取15min，黃酮提取率為4.18%。比較可知：微波輔助提取既能縮短提取時(shí)間又能提高絞股藍(lán)黃酮的提取率。

3 結(jié) 論

微波輔助提取法經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、料液比1:32(g/mL)、微波處理時(shí)間15min。此工藝條件下絞股藍(lán)黃酮提取率為4.18%。微波輔助提取法與索氏提取法相比，微波輔助提取既能縮短提取時(shí)間又能提高絞股藍(lán)黃酮的提取率。

[1] 陳武, 鄒盛勤, 吳曉春, 等. 絞股藍(lán)無糖口含片的制備工藝研究[J].食品科學(xué), 2008, 29(3):245-248.

[2] BAI Mingsheng, GAO Jinmin, FAN Chen, et al. Bioactive dammarane-type triterpenoids derived from the acid hydrolysate ofGynostemma pentaphyllumsaponins[J]. Food Chemistry, 2010, 119(11):306-310.

[3] LU You, YANG Xingbin, ZHAO Yan, et al. Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides fromGynostemma pentaphyllumby HPLC with indirect UV detection[J].Food Chemistry, 2009, 112:742-746.

[4] 周建華, 張興亞. 絞股藍(lán)開發(fā)研究新進(jìn)展及應(yīng)用[J]. 食品科技, 2010,35(2):74-76.

[5] 徐寧, 張峰, 肖遠(yuǎn)勝, 等. 中藥黃酮類化合物[J]. 大學(xué)化學(xué), 2010, 25(4):105-108.

[6] 陳業(yè)高. 植物化學(xué)成分[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2004.

[7] 劉成梅, 游海. 天然產(chǎn)物有效成分的分離與應(yīng)用[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2003.

[8] 金欽漢. 微波化學(xué)[M]. 北京:科學(xué)出版社, 1999.

[9] 池愛平, 陳錦屏. 微波輔助提取絞股藍(lán)多糖的工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(7):181-184.

[10] 朱遠(yuǎn)平. 金柚皮總黃酮的微波輔助提取工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2009,30(12):73-77.

[11] 柳嘉, POPOVICH D G, 景浩. 山楂黃酮提取物的抗氧化活性和對癌細(xì)胞生長抑制作用[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(3):220-223.

[12] 葉春, 張婧. 大孔樹脂對野菊花總黃酮吸附分離特性的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(12):127-131.

[13] 陳蕉, 黎云祥, 陳光登, 等. 大孔吸附樹脂分離純化峨嵋?guī)r白菜葉總黃酮[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(6):74-79.

[14] 劉志祥, 曾超珍, 張玥. AB-8大孔樹脂分離純化枸骨葉總黃酮的工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(12):76-79.

[15] 盧錦花, 胡小玲, 岳紅, 等. 大孔吸附樹脂對銀杏葉黃酮類化合物吸附及解吸的研究[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用, 2002, 14(2):164-166; 148.

[16] 胡志軍, 郝利君, 王南溪, 等. D-101大孔吸附樹脂分離純化橘皮中的黃酮類物質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(8):65-69.

Microwave-assisted Extraction of Flavonoids fromGynstemma pentaphyllum

WANG Qing-hao，F(xiàn)ANG Fang，ZHANG Xiong-lu
(College of Chemistry and Life Science, Gannan Normal University, Ganzhou 341000, China)

O629.9

A

1002-6630(2010)22-0149-04

2010-06-30

王青豪(1963—)，男，教授，學(xué)士，主要從事有機(jī)化學(xué)與天然產(chǎn)物研究。E-mail：wang_qing_hao@yahoo.cn