宋 雪，韓 勇，籍保平*，劉翼翔，呂業(yè)春

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

篤斯越橘花色苷提取物對光損傷人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

宋 雪，韓 勇，籍保平*，劉翼翔，呂業(yè)春

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

目的：通過建立人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hRPE)光損傷模型評價篤斯越橘花色苷對眼睛的保護(hù)作用及機(jī)理。方法：光損傷設(shè)置光強(qiáng)、光照時間、后續(xù)培養(yǎng)時間3個影響因素，以細(xì)胞存活率和乳酸脫氫酶活性評價模型建立情況；根據(jù)越橘花色苷提取物的干預(yù)方式分為預(yù)防組、應(yīng)激組和修復(fù)組，每組設(shè)高、中、低3個濃度，檢測細(xì)胞存活率和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平評價保護(hù)效果。結(jié)果：選擇光照度2500lx，光照24h后培養(yǎng)24h作為最佳造模條件，細(xì)胞損傷率達(dá)20%；預(yù)防組和應(yīng)激組能有效保護(hù)細(xì)胞活力(P＜0.01)，修復(fù)組沒有效果，各組都能抑制由光損傷誘導(dǎo)hRPE細(xì)胞VEGF的過表達(dá)，但是不同濃度之間抑制能力有差異。結(jié)論：hRPE細(xì)胞光損傷程度呈光照強(qiáng)度和光照時間依賴性；越橘花色苷能通過保護(hù)hRPE的細(xì)胞活力和VEGF的過表達(dá)，實(shí)現(xiàn)保護(hù)眼科健康、預(yù)防眼科疾病的作用。

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；篤斯越橘花色苷提取物；光損傷；血管內(nèi)皮生長因子

Abstract：Objective:To establish a photo-oxidative damage model of human retinal pigment epithelium (hRPE) cells for evaluating the protective effect of bilberry anthocyanin extract (BAE). Methods:Illumination intensity, exposure time and incubation time were selected as the factors to establish the model through evaluating cell variability and LDH activity.Meanwhile, the precaution group, stress group and repairing group were designed to administrate three different concentrations in each group. Cell viability and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression level were used to evaluate the preventive effect of BAE. Results:Illumination for 24 h at an intensity of 2500 lx and subsequent incubation time for 24 h were the optimal conditions for the model establishment. The damage rate of hPRE cells was up to 20%. No significant cell damage was observed for the precaution and the stress groups (P< 0.01), while the repairing group did not exhibit preventive effect. All the groups inhibited VEGF expression level in a dose-dependent manner. Conclusion:RPE cells can be damaged by visible light and the damage degree is correlated with illumination intensity and illumination duration. BAE can protect cells from light damage and inhibit VEGF level secreted from damaged cells. Therefore, people can intake bilberry to keep eye healthy and prevent the diseases of eyes.

Key words：human retinal pigment epithelium；bilberry anthocyanin extract；light damage；vascular endothelial growth factor

自從1966年Noell等[1]發(fā)現(xiàn)光可造成視網(wǎng)膜損傷后，人們逐漸意識到：光雖然是視覺系統(tǒng)進(jìn)化和發(fā)育的動力，但是當(dāng)光線的光強(qiáng)度、光照時間等超過了視網(wǎng)膜的承受力，將會造成視網(wǎng)膜的光損傷。視網(wǎng)膜光損傷日益成為眼科研究熱點(diǎn)。雖然人的角膜、眼房水、晶狀體可以吸收大部分對視網(wǎng)膜有害的近紫外光，讓其不進(jìn)入視網(wǎng)膜，但長期的可見光照射(尤其可見光中的短波段)能誘發(fā)產(chǎn)生自由基，形成脂質(zhì)過氧化物，從而參與多種眼疾的形成[2]，如視網(wǎng)膜色素變性(RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、黑色素瘤等[3]。因此，對視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)已成為預(yù)防眾多眼科疾病的基本措施。

研究發(fā)現(xiàn)，外源性抗氧化劑對光損傷后視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用[4]。美國農(nóng)業(yè)部(USDA)人類營養(yǎng)中心研究表明，與其他40多種新鮮水果和蔬菜相比，越橘的抗氧化能力最好，這與越橘果富含花色苷等多酚類物質(zhì)有關(guān)?；ㄉ丈鼐哂卸喾N生物活性，其抗氧化活性比VE還高[5-6]。篤斯越橘(Vaccinium uliginosumL.，或bilberry)是我國大興安嶺的主要漿果資源之一，其對眼睛的保護(hù)功能早有報道[7]，但作用機(jī)理并不明確，相關(guān)基礎(chǔ)研究較少。本研究通過建立人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞光損傷模型評價篤斯越橘對視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)作用，揭示篤斯越橘對眼睛保護(hù)功能的作用機(jī)理，為以篤斯越橘為主開發(fā)保護(hù)眼睛及預(yù)防眼科疾病相關(guān)保健產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越橘，由東北大興安嶺區(qū)科技局提供(－20℃避光保存)；人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hRPE)，由中山大學(xué)眼科中心提供。

Delbecco 改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS) 美國Gibco公司；噻唑蘭(MTT) 美國Amresco公司；胰蛋白酶 美國Sigma化學(xué)公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒 南京建成生物工程研究所；VEGF酶聯(lián)免疫試劑盒 武漢博士倫生物工程有限公司；BCA試劑盒、青鏈霉素混合液和RIPA細(xì)胞裂解液 碧云天生物技術(shù)研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LGJ-18型冷凍干燥機(jī) 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠；XDOS-1B倒置顯微鏡 重慶光電有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；MCO-15AC培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；Multiskan MK3自動酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；ST-Ⅲ型光照度計(jì) 上海光電研究所；TDL-40B臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 篤斯越橘花色苷提取物的制備

越橘果于室溫下解凍，稱取10g于三角瓶中，加入300mL 70%乙醇，搖勻，50℃超聲波輔助提取20min，離心(3600r/min，15min)，取上清液，45℃濃縮，凍干得固體粉末。用DMEM培養(yǎng)基將越橘提取物(bilberry anthocyanin extract，BAE)分別配制成10、1、0.1μg/mL的溶液，于－20℃避光保存，待用。

1.3.2 hRPE細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)

復(fù)蘇：將凍存的hRPE細(xì)胞于37～40℃水浴迅速解凍(1～2min)，加入10倍體積的完全DMEM培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10% FBS 和1%的青霉素鏈霉素混合液)，混勻后離心，棄去上清液。血球平板計(jì)數(shù)，以2×104個/mL的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，次日換液去除未貼壁的細(xì)胞。

培養(yǎng)：將復(fù)蘇的人hRPE細(xì)胞置于37℃、5% CO2、濕度為90%的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每2d換液1次，細(xì)胞長至近融合狀態(tài)時0.25g/100mL胰蛋白酶消化傳代。第3～5代用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 建模方法

將hRPE細(xì)胞培養(yǎng)24孔板中，當(dāng)細(xì)胞近鋪滿時，以自制LED燈作為光源，從底部直接照射。設(shè)立3個因素交互影響實(shí)驗(yàn)：1)光照度分別為500、(2500±500)、(4000±500)lx；2)光照時間分別為12、24、36h；3)光照后培養(yǎng)時間分別為12、24、36h。正常對照組用黑色不透光布遮蓋。終止培養(yǎng)后，收集上清液于－20℃避光保存，最后同時檢測上清液中乳酸脫氫酶(LDH)的活性；每批細(xì)胞終止培養(yǎng)后，立即用BCA試劑盒檢測細(xì)胞蛋白量和MTT法檢測細(xì)胞活力。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個平行。

1.3.4 MTT法測定細(xì)胞存活率

棄上清液，加入MTT終質(zhì)量濃度為0.5mg/mL的無血清培養(yǎng)液200μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，4h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜，振蕩5min使紫色結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀于490nm波長處測定各孔的吸光度。根據(jù)公式(1)計(jì)算出細(xì)胞存活率：

式中：A樣品490nm為樣品在490nm波長處的吸光度；A對照490nm為正常對照組在490nm波長處的吸光度。

1.3.5 LDH檢測細(xì)胞的受損程度

將收集到的上清液按照試劑盒說明書操作，得出乳酸脫氫酶的活性(U/g pro)。

1.3.6 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)表達(dá)的檢測

收集培養(yǎng)上清液于0.5mL的離心管中測定VEGF的含量，并裂解細(xì)胞測量細(xì)胞蛋白(BCA)。培養(yǎng)上清液于1500r/min離心10min，取上清液，按照人VEGF及BCA的測定試劑盒說明進(jìn)行操作。分別在酶標(biāo)儀450nm和560nm波長處讀取吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得出相應(yīng)VEGF的質(zhì)量濃度CVEGF和蛋白含量Cpro。根據(jù)公式(2)計(jì)算出MVEGF：

式中：CVEGF為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的VEGF質(zhì)量濃度/(pg/mL)；Cpro為BCA試劑盒測得的細(xì)胞蛋白質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

1.3.7 篤斯越橘提取物(BAE)干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組

通過上述實(shí)驗(yàn)得出最佳模型條件，以自制燈為光源器，調(diào)節(jié)光照度在(2500±500)lx，對照孔用黑布遮蓋。待96孔板中的細(xì)胞長至80%融合狀態(tài)時，將其分成以下幾組，每組7個平行。

正常對照組(NC)：不光照，不加提取物；模型對照組(MC)：光照24h，不加提取物；藥物預(yù)防組(PH、PM、PL)：實(shí)驗(yàn)分PH、PM、PL三組，其劑量依次為10、1、0.1μg/mL，光照前分別加入提取物預(yù)處理24h后，光照培養(yǎng)24h；藥物應(yīng)激組(SH、SM、SL)：實(shí)驗(yàn)分SH、SM、SL三組，劑量設(shè)定同上，在光照的同時加入提取物，光照培養(yǎng)24h。藥物修復(fù)組(RH、RM、RL)：實(shí)驗(yàn)分RH、RM、RL三組，劑量設(shè)定同上，光照24h后再加入提取物。

光照后，按照各組的處理方式繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后立即進(jìn)行指標(biāo)的檢測。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用組間t檢驗(yàn)，P＜0.05具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 可見光對hRPE 細(xì)胞的損傷

可見光能導(dǎo)致hRPE損傷[8]，損傷程度與光照強(qiáng)度呈劑量依賴性，并隨光照時間的延長而加重。乳酸脫氫酶(LDH)是細(xì)胞能量代謝中的重要酶，可以催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色[9]。受損的細(xì)胞將LDH釋放至培養(yǎng)液中，因此LDH可以客觀的衡量細(xì)胞的受損程度并評價細(xì)胞膜完整性。

本實(shí)驗(yàn)考察光照度為500、2500、4000lx三個劑量時發(fā)現(xiàn)：1)光損傷與光照度的關(guān)系：500lx的光照度對細(xì)胞損傷較小，光照處理36h后正常培養(yǎng)24h，其存活率仍可達(dá)80%以上；中劑量光照度2500lx先表現(xiàn)較小的損傷性，隨著光照時間和正常培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞存活率有較大幅度的降低，從90%左右下降到70%左右；4000lx的光照度對hRPE損傷最大，光照處理12h后正常培養(yǎng)12h，其細(xì)胞存活率就小于80%；2)光損傷與光照時間的關(guān)系：當(dāng)光照度一定時，隨著光照時間的延長，細(xì)胞存活率明顯下降，光照度越大表現(xiàn)越顯著；3)光損傷與正常培養(yǎng)時間的關(guān)系：在細(xì)胞光照后培養(yǎng)中，隨著培養(yǎng)時間的延長，500lx的細(xì)胞存活率變化不明顯，而4000lx變化顯著。由表2可見，與對照組LDH活力(164.8±1.9)U/g pro相比，幾乎所有光照處理的LDH釋放量都顯示差異極顯著(P＜0.01)，說明光照會嚴(yán)重?fù)p壞細(xì)胞的細(xì)胞膜，使細(xì)胞通透性增強(qiáng)，細(xì)胞受損。

表1 不同光照條件處理下細(xì)胞的存活率Table 1 Cell viability during treatments with various light intensities %

表2 不同光照條件處理下細(xì)胞LDH的釋放量Table 2 LDH activity of RPE treated by various light intensities(U/g pro)

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，一般把細(xì)胞損傷率為20%左右作為最佳模型標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)有3組數(shù)據(jù)與此接近，但是從實(shí)驗(yàn)時間和操作性考慮，選擇光照度2500lx、光照24h、后培養(yǎng)24h作為光損傷模型的最佳條件。

2.2 篤斯越橘花色苷提取物對hRPE細(xì)胞光損傷的保護(hù)作用

2.2.1 細(xì)胞存活率變化

Matsumoto等[10]通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花色苷可以穿過血-腦水屏障和血-視網(wǎng)膜屏障被眼組織吸收，并以完整的形式存在。此外，花色苷可以進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)細(xì)胞和組織不被自由基氧化破壞[6]。本實(shí)驗(yàn)表明(圖1)：BAE預(yù)防組(PH、PM、PL)和應(yīng)激組(SH、SM、SL)對光損傷細(xì)胞有較強(qiáng)的保護(hù)作用，細(xì)胞的存活率與模型對照組(MC)有極顯著的差異(P＜0.01)；而BAE修復(fù)組(RH、RM、RL)與模型對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。尤其是預(yù)防組的低劑量(PL，0.1μg/mL)和應(yīng)激組高劑量(SH，10μg/mL)的細(xì)胞存活率最顯著，與不受光損傷的正常對照組相比差異極顯著(P＜0.01)，不僅保護(hù)細(xì)胞活力免受光損傷的影響，還促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖1 篤斯越橘花色苷提取物對光損傷細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of BAE on light-damaged cells viability

2.2.2 VEGF含量的變化

圖2 篤斯越橘花色苷提取物對光損傷細(xì)胞分泌VEGF量的影響Fig.2 Effect of BAE on VEGF level secreted from light-damaged cells

VEGF是一種促進(jìn)新生血管形成的生長因子，在RPE 細(xì)胞過量表達(dá)可導(dǎo)致毛細(xì)血管芽生長，眼組織中表現(xiàn)為脈絡(luò)膜新生血管(CNV)形成，損害視功能[11]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明(圖2)：光照會引起hRPE細(xì)胞的VEGF的分泌量增加，模型組(MC)與正常組(NC)相比，差異極顯著(P＜0.01)；BAE預(yù)防組的中劑量組PM、應(yīng)激組的中、低劑量組(SM、SL)和修復(fù)組的高、中劑量組(RH、RM)都能有效抑制hRPE過量表達(dá)VEGF，與模型組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；預(yù)防組的高、低劑量組與模型組相比，差異顯著(P＜0.05)；而應(yīng)激高劑量組SH和修復(fù)低劑量組RL與模型組相比差異不明顯(P＞0.05)。從整體上看，BAE所有干預(yù)組能有效抑制hRPE光損傷細(xì)胞VEFG的過量表達(dá)，而且應(yīng)激組和修復(fù)組的作用比預(yù)防組顯著，這與上面保護(hù)細(xì)胞增殖能力的結(jié)果相反，說明細(xì)胞活力和調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝因子之間沒有一定的相關(guān)性。

3 討論與結(jié)論

光損傷具有積累效應(yīng)，損傷程度呈光照度和光照時間依賴性[9]，光照時間越長、細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在較低光照度下，培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞出現(xiàn)較輕的損傷，隨著光照度的增加，hRPE細(xì)胞凋亡顯著增加；而在同等光照度下，hRPE細(xì)胞的損傷表現(xiàn)為光照時間依賴性，并且在后期培養(yǎng)中損傷逐漸顯現(xiàn)，可能與自由基的產(chǎn)生有關(guān)[12]；500～4000lx的光照度作用于hRPE細(xì)胞一定時間后，都會使hRPE細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放量增加，說明光照可使hRPE細(xì)胞的細(xì)胞膜受到損壞，細(xì)胞通透性增強(qiáng)，這也間接解釋了細(xì)胞在后期培養(yǎng)中逐漸出現(xiàn)損傷的緣由。

篤斯越橘花色苷對視網(wǎng)膜細(xì)胞光損傷有保護(hù)作用主要有以下3個原因：一是花色苷具有很強(qiáng)的除去自由基的能力，能夠清除光照所引起的脂質(zhì)過氧化物、活性氧等[13]；二是花色苷能激活視網(wǎng)膜酶，活化和促進(jìn)視紅素的再合成作用，從而改善人眼視覺的敏稅程度，加快黑暗環(huán)境適應(yīng)能力[14]；三是對視網(wǎng)膜的血液微循環(huán)有很好的調(diào)節(jié)作用，加速物質(zhì)代謝交換和增強(qiáng)對毛細(xì)血管的保護(hù)作用[15]。Milbury等[16]用越橘的提取物預(yù)處理RPE細(xì)胞4h后，再進(jìn)行氧化損傷發(fā)現(xiàn)，其損傷程度明顯比對照組小。McAnulty等[17]的研究也表明，越橘提取物能清除自由基，避免發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)而破壞細(xì)胞因子的平衡，防止細(xì)胞受到損壞。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與上述兩位學(xué)者相一致，實(shí)驗(yàn)設(shè)置BAE預(yù)防組、應(yīng)激組和修復(fù)組，分別對光損傷的RPE細(xì)胞干預(yù)，發(fā)現(xiàn)預(yù)防組和應(yīng)激組能有效防止細(xì)胞活力免受光損傷，并且促進(jìn)細(xì)胞生長繁殖，而光照后的修復(fù)組不能達(dá)到保護(hù)作用；并且BAE能夠抑制光損傷導(dǎo)致的VEGF的過分泌，而VEGF的分泌量增加是脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)和滲透性年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)的形成主要原因[18]，所以越橘花色苷對于這些眼科疾病有很好的預(yù)防作用。

本實(shí)驗(yàn)選擇光照度2500lx，光照24h后培養(yǎng)24h作為模型的最佳條件，細(xì)胞損傷率達(dá)到20%。越橘花色苷可通過促進(jìn)hRPE細(xì)胞增殖和VEGF的過表達(dá)，對光損傷的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用，進(jìn)而保護(hù)視力、預(yù)防眼疾。因此，在日常生活環(huán)境中，適當(dāng)?shù)臏p少光照時間和光照強(qiáng)度，如控制用電腦的時間、外出遮陽、調(diào)節(jié)室內(nèi)光線等，可以有效降低視網(wǎng)膜光損傷的發(fā)生率；食用越橘鮮果能夠降低光對視網(wǎng)膜的損傷，從而能對由光損傷引起的眼科疾病具有一定的預(yù)防作用。

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Protective Effect of Bilberry Anthocyanin Extract (BAE) against Photo-oxidative Damage of Human Retinal Pigment Epithelial Cells

SONG Xue，HAN Yong，JI Bao-ping*，LIU Yi-xiang，LYe-chun
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

TS255.1

A

1002-6630(2010)21-0324-05

2010-04-19

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD05A06-Z01)

宋雪(1985—)，女，碩士研究生，主要從事功能食品研究。E-mail：songxuesnow10-27@163.com

*通信作者：籍保平(1958—)，男，教授，碩士，主要從事功能食品研究。E-mail：jbp@cau.edu.cn