曲 鋒,許恒毅,熊勇華,賴衛(wèi)華,魏 華*
(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)
納米銀殺菌機(jī)理的研究進(jìn)展
曲 鋒,許恒毅,熊勇華,賴衛(wèi)華,魏 華*
(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)
納米銀因其高效、廣譜及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn),已成為目前抗菌材料的研究熱點(diǎn),但其殺菌機(jī)理尚有待于進(jìn)一步研究。本文綜述了納米銀殺菌機(jī)理的最新進(jìn)展,以期為納米銀抗菌材料的應(yīng)用提供參考依據(jù)。
納米銀;殺菌機(jī)理;抗菌材料
Abstract:Nano-silver has become a hot topic in the field of antibacterial materials due to its high efficiency, wide spectrum and low drug-resistance to bacteria. However, the bactericidal mechanisms of nano-silver are still unclear. In this paper, current research progress in bactericidal mechanisms of nano-silver has been discussed, which will provide technical supports for further development and applications of nano-silver as an antimicrobial material.
Key words:nano-silver;bactericidal mechanism;antibacterial materials
銀的抗菌性能早在16世紀(jì)就被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥界,如用銀片覆蓋傷口預(yù)防潰爛,用銀絲織成紗布包裹皮膚創(chuàng)傷,嬰兒出生時(shí)滴上硝酸銀溶液可防止黏膜感染[1]。20世紀(jì)30年代,抗生素的發(fā)現(xiàn)一度使人們忽視了對(duì)銀抗菌性能的利用。然而,隨著抗生素等化學(xué)藥物的濫用,越來(lái)越多的微生物通過(guò)變異產(chǎn)生了耐藥性,使得一些由耐藥性細(xì)菌引起的疾病無(wú)法醫(yī)治。同時(shí)也使具備高效、廣譜及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)的銀系殺菌劑再次引起人們的重視。隨著納米技術(shù)的迅猛發(fā)展,將金屬銀加工成納米銀后,原子排列表現(xiàn)為介于固體和分子之間的“介態(tài)”,其比表面積極大,顯示明顯的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng),這種活性極強(qiáng)的納米銀微粒具備超強(qiáng)的抗菌能力[2]。如納米銀抗菌的有效濃度在納摩爾水平,低于銀離子的微摩爾水平近1000倍[3]。然而納米銀抗菌材料得以應(yīng)用的同時(shí),相關(guān)基礎(chǔ)研究則明顯滯后,納米銀的抗菌機(jī)理尚未認(rèn)識(shí)清楚,這必將影響納米銀抗菌材料的進(jìn)一步發(fā)展和更為廣泛的應(yīng)用,本文將納米銀抗菌機(jī)理的研究進(jìn)展做如下綜述。
按照原理不同,納米銀顆粒的制備方法可以分為物理方法、化學(xué)方法和生物還原法3大類(lèi),如表1所示。
隨著科技的進(jìn)步,未來(lái)的納米銀生產(chǎn)技術(shù)將向低成本、低消耗、低污染的方向發(fā)展。在物理、化學(xué)制備方法相對(duì)已較為成熟的情況下,具有獨(dú)特的技術(shù)和成本優(yōu)勢(shì)的生物還原法將可能成為未來(lái)納米銀生產(chǎn)技術(shù)的突破口,尋找新的具有較強(qiáng)銀還原能力的菌種并優(yōu)化其還原條件將是這種新技術(shù)的主要發(fā)展方向。
目前,納米銀已應(yīng)用于水凈化領(lǐng)域。Jain等[14]將納米銀加入聚氨酯泡沫體中,含105cells/mL大腸桿菌的水以0.5L/min的流速通過(guò)該泡沫體后,全部細(xì)菌被殺死。Gong等[15]制備了Ag和Fe3O4的復(fù)合納米顆粒,它兼?zhèn)淞薋e3O4的超順磁性和Ag的強(qiáng)殺菌性,不僅有效殺死了細(xì)菌,而且完成處理后可利用磁場(chǎng)將其從水中清除,如此既避免了對(duì)環(huán)境造成污染,又可循環(huán)使用。
納米銀可通過(guò)尼綸、網(wǎng)布、水狀膠質(zhì)、甲基纖維素、聚乙烯和聚丙烯等為載體,制成醫(yī)用敷料,適用于大部分的外傷治療。納米銀通過(guò)減少創(chuàng)傷的發(fā)炎和調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞因子,加快創(chuàng)傷的恢復(fù)速度并減小產(chǎn)生的疤痕[16]。將納米銀添加到PVA纖維和棉織物,制成的抗菌織物均表現(xiàn)出強(qiáng)殺菌效果。
最近一些研究表明,納米銀與多種抗生素和傳統(tǒng)中藥均有協(xié)同殺菌的作用,明顯增強(qiáng)了原藥物的殺菌效能,在藥物載體領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[17]。
表1 納米銀的制備方法、原理及優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Preparation methods of nano-silver
近年來(lái),納米銀對(duì)細(xì)菌形態(tài)的損傷有了許多共性研究:經(jīng)納米銀作用后,菌體細(xì)胞畸形且不完整;細(xì)胞外膜受到損傷,胞壁上出現(xiàn)小坑,胞膜上出現(xiàn)小孔;納米銀不僅作用于細(xì)胞外膜,而且進(jìn)入了菌體細(xì)胞內(nèi)部[18-24]。Shrivastava等[20]用透射電鏡仔細(xì)觀察了納米銀與細(xì)菌作用的過(guò)程:起初納米銀成簇地錨定在細(xì)胞壁上,這些位點(diǎn)可能是細(xì)胞壁上帶負(fù)電的功能團(tuán);隨后納米銀進(jìn)入菌體,并錨定于細(xì)胞內(nèi)的幾個(gè)位點(diǎn),在細(xì)胞膜上形成齒孔;后期觀察到黑色碎片狀的沉淀物,Shrivastava等[20]認(rèn)為該沉淀物是細(xì)菌內(nèi)容物和納米銀結(jié)合的產(chǎn)物,這可能是一種降低局部納米銀濃度的防御機(jī)制,使得細(xì)菌延長(zhǎng)了延滯生長(zhǎng)期而沒(méi)有被全部殺死。謝小保等[24]也觀察到相似的過(guò)程:納米銀粒子先在細(xì)胞壁上產(chǎn)生小的孔洞,通過(guò)這些孔洞進(jìn)入周質(zhì)空間,導(dǎo)致細(xì)胞膜成分泄漏和破壞細(xì)胞膜,進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,納米銀粒子使DNA濃縮呈緊張態(tài),并與破損細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)結(jié)合積聚,最后引起胞內(nèi)物質(zhì)流失。
納米銀破壞了菌體細(xì)胞膜的性質(zhì),使膜的通透性發(fā)生改變。經(jīng)納米銀作用后,大量還原糖和蛋白質(zhì)從菌體內(nèi)泄漏到胞外[18];Kim等[19]也有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn),菌體內(nèi)葡萄糖和海藻糖的含量明顯增加,釋放到胞外的量也明顯增加;正常情況下0.1%的SDS不能進(jìn)入完整的菌體細(xì)胞,Lok等[25]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌經(jīng)納米銀作用后,SDS則可以進(jìn)入菌體并發(fā)揮溶菌作用;細(xì)胞內(nèi)的鉀幾乎全部流失,ATP消耗殆盡而且膜電位遭到破壞。1,6 -二苯基- 1,3,5-己三烯(DPH)通過(guò)與細(xì)胞膜磷脂雙分子層的?;Y(jié)合而嵌入膜內(nèi),Kim等[19]用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)菌體內(nèi)DPH的量隨納米銀濃度的增加而減少,即納米銀破壞了細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),并進(jìn)一步影響了膜的通透性。Lok等[25]發(fā)現(xiàn),大腸桿菌經(jīng)納米銀處理后,菌體中5種包膜蛋白表達(dá)異常,并證明它們是以各自成熟蛋白前體的形式存在。作者認(rèn)為,菌體膜電位的破壞和細(xì)胞內(nèi)ATP的大量消耗造成這些包膜蛋白前體無(wú)法穿過(guò)胞膜,被加工成成熟蛋白。納米銀可以降低大腸桿菌呼吸鏈中脫氫酶的活性,并且納米銀濃度越高酶活性越低[18]。細(xì)菌內(nèi)多種蛋白質(zhì)已被證實(shí)會(huì)被磷酸化,蛋白質(zhì)的磷酸化與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。Shrivastava等[20]發(fā)現(xiàn)經(jīng)納米銀處理后,菌體內(nèi)有兩種蛋白質(zhì)的磷酸酪氨酸被去磷酸化,據(jù)此認(rèn)為納米銀通過(guò)影響菌體細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。有趣的是,該現(xiàn)象在大腸桿菌(G-)中被發(fā)現(xiàn),在金黃色葡萄球菌(G+)中卻沒(méi)有出現(xiàn)。謝小保等[24]發(fā)現(xiàn),納米銀使大腸桿菌DNA不再隨機(jī)分布在核區(qū),而是在核區(qū)濃縮呈緊張態(tài),且能夠增加大腸桿菌總DNA樣品的降解程度。
納米銀的殺菌效果受多方面的因素影響。納米銀顆粒自身的粒徑、形狀、濃度和表面修飾物等均能影響納米銀和菌體的接觸及侵入,造成的殺傷作用強(qiáng)弱也不同。不同類(lèi)型的細(xì)菌在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)上存在很大的差異:革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁最外層是一層脂多糖,往內(nèi)是一層薄的肽聚糖(7~8nm),脂多糖是由脂類(lèi)和多糖共價(jià)連接的,整體缺乏強(qiáng)度和硬度;革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖構(gòu)成,線性的肽聚糖由小肽連接成相互交聯(lián)的網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu),比陰性菌的厚(20~80nm)且更致密,納米銀不但難以錨定在其上面,而且難以穿過(guò)細(xì)胞壁。諸多研究表明,納米銀對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制或殺傷作用明顯強(qiáng)于革蘭氏陽(yáng)性菌[20,26-27]。培養(yǎng)條件同樣可以影響納米銀的殺菌效果,培養(yǎng)基狀態(tài)、供氧和培養(yǎng)溫度都是重要的影響因素[22-23]。在液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌被納米銀殺死后,細(xì)胞內(nèi)容物與納米銀結(jié)合形成沉淀,降低了液體中局部的納米銀濃度,使得細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中對(duì)納米銀的耐受能力明顯強(qiáng)于在固體培養(yǎng)基。氧氣供給和培養(yǎng)溫度能夠影響活性氧的產(chǎn)生和Ag+的釋放(表 2)。
表2 納米銀殺菌的影響因素Table 2 Affecting Factors of the bactericidal effect of nano-silver
DNA分子在松弛狀態(tài)下才能有效地進(jìn)行復(fù)制,呈緊張狀態(tài)的DNA分子會(huì)失去復(fù)制的能力。DNA的任何損傷都會(huì)影響遺傳物質(zhì)正常的復(fù)制及生物體的繁殖,納米銀通過(guò)損傷細(xì)菌DNA達(dá)到殺菌效果。如納米銀使大腸桿菌DNA不再隨機(jī)分布在細(xì)胞的核區(qū),而是在核區(qū)濃縮呈緊張態(tài),并增加菌體內(nèi)總DNA的降解程度[24],如圖1a所示。
細(xì)菌內(nèi)多種蛋白質(zhì)會(huì)被磷酸化,蛋白質(zhì)的磷酸化與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。Shrivastava等[20]發(fā)現(xiàn),納米銀處理過(guò)的細(xì)菌中有兩種蛋白質(zhì)的磷酸酪氨酸被去磷酸化,即納米銀影響了細(xì)胞正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),如圖1b所示。細(xì)胞裂解可能不是納米銀殺死細(xì)菌的唯一原因,納米銀有可能通過(guò)影響細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而使細(xì)菌不能正常地存活。
菌體表面微量的銀能起到催化活性中心的作用。Ag+激活空氣或水中的氧,產(chǎn)生羥自由基及活性氧離子,抑制或殺滅細(xì)菌[32],如圖1c所示。Danilczuk等[33]在電子自旋共振光譜中發(fā)現(xiàn)了納米銀產(chǎn)生的自由基,Kim等[26]觀察到相同的結(jié)果并發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸可以抵消納米銀的殺菌作用,即納米銀產(chǎn)生的自由基與它的抗菌性有關(guān)。Pal等[22]發(fā)現(xiàn)納米銀與細(xì)菌共培養(yǎng)初期的殺菌作用與其產(chǎn)生的活性氧有關(guān),并證明殺菌的有效成分是羥自由基。由此推斷,納米銀可能通過(guò)產(chǎn)生自由基,進(jìn)一步氧化菌體外膜使細(xì)菌死亡。
電鏡觀察顯示,被納米銀作用后的菌體細(xì)胞膜遭到嚴(yán)重破壞,細(xì)胞壁上形成小坑,細(xì)胞膜上出現(xiàn)小孔,如圖1d所示。細(xì)胞膜的通透性也被破壞,大量的還原糖、蛋白質(zhì)以及K+從菌體內(nèi)泄漏,膜電位和ATP被消耗殆盡。一些學(xué)者認(rèn)為經(jīng)納米銀處理后,菌體細(xì)胞膜的通透性被改變,大量新陳代謝所必需的物質(zhì)泄漏,導(dǎo)致了細(xì)菌的死亡[18-19,23]。
納米銀粒徑極微小,可以進(jìn)入細(xì)菌并與菌體中酶蛋白的巰基結(jié)合,使一些含巰基基團(tuán)的酶失去活性,如圖1e所示。經(jīng)納米銀處理后,大腸桿菌呼吸鏈中脫氫酶的活性明顯降低,并且納米銀的濃度越高酶活性越低[18]。另?yè)?jù)Matsumura等[34]報(bào)道,抑制呼吸酶活性可能與活性氧的產(chǎn)生有關(guān)。脫氫酶失活后,細(xì)菌既不能獲取正常生命活動(dòng)所需的能量,又受到活性氧的氧化殺滅作用。
圖1 納米銀殺菌機(jī)制示意圖Fig.1 Bactericidal mechanisms of nano-silver
諸多研究已經(jīng)證實(shí):納米銀先黏附在細(xì)菌外膜上,再穿過(guò)外膜對(duì)細(xì)菌造成損傷[18-24]。但是,納米銀與細(xì)菌外膜結(jié)合的機(jī)理仍不清楚。一般認(rèn)為帶正電荷的納米銀通過(guò)靜電吸附作用黏附到帶負(fù)電荷的細(xì)菌外膜[24-35],而Sondi等[23]觀察到帶負(fù)電荷的納米銀也具有強(qiáng)殺菌性能。由此可知靜電吸附不是納米銀黏附在細(xì)菌外膜上的主要原因,探究納米銀與細(xì)菌外膜的何種成分發(fā)生了作用,對(duì)進(jìn)一步探討納米銀的殺菌機(jī)理有重要的意義。此外,目前尚未見(jiàn)報(bào)道納米銀在細(xì)菌內(nèi)部是以何種形式存在并對(duì)細(xì)菌造成殺傷的。細(xì)菌的大部分生化反應(yīng)在納米級(jí)尺度發(fā)生,因此納米銀顆粒不僅可以游離出Ag+殺傷細(xì)菌,而且有機(jī)會(huì)直接介入細(xì)菌的新陳代謝。探討納米銀在細(xì)菌內(nèi)部的存在形式也是闡明其殺菌機(jī)理的前提條件。
綜上所述,納米銀通過(guò)如下機(jī)制殺菌:損傷細(xì)菌DNA、活性氧自由基的氧化損傷、脫氫酶失活、菌體內(nèi)容物泄漏和中斷細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。納米銀的殺菌效果受自身性質(zhì)、細(xì)菌性質(zhì)和培養(yǎng)條件等多方面因素的影響。目前,對(duì)納米銀殺菌機(jī)理的研究主要集中在用電鏡觀察菌體損傷以及測(cè)定納米銀殺菌效能等方面,今后的發(fā)展方向必定為從分子水平和代謝水平對(duì)其做出分析,從而為深入闡明這一機(jī)理奠定基礎(chǔ)。雖然納米銀的殺菌機(jī)理至今仍未徹底闡明,但隨著分析方法的不斷進(jìn)步,該殺菌機(jī)理將逐漸清晰。納米銀殺菌機(jī)理的闡明,有利于人們更好地將納米銀應(yīng)用到食品、醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)等多個(gè)領(lǐng)域,造福于人類(lèi)。
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Research Progress in Bactericidal Mechanisms of Nano-silver
QU Feng,XU Heng-yi,XIONG Yong-hua,LAI Wei-hua,WEI Hua*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)
TS207.4
A
1002-6630(2010)17-0420-05
2010-05-10
江西省優(yōu)秀博士學(xué)位論文培育計(jì)劃基金項(xiàng)目(YBP08A03)
曲鋒(1986—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)榧{米材料毒性。E-mail:qufeng7@yahoo.com.cn
*通信作者:魏華(1966—),男,研究員,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:hua_wei114@yahoo.com.cn