王瑛瑤，魏翠平，欒 霞，張霜玉，杜傳林

(國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037)

菜籽水解蛋白的組成及性質(zhì)研究

王瑛瑤，魏翠平，欒 霞，張霜玉，杜傳林

(國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037)

對水酶法提油技術(shù)得到的菜籽水解蛋白的組成、物化性能及體外功能特性進行研究。菜籽水解蛋白主要由粗蛋白質(zhì)、總糖和灰分組成，含量分別為54.95%、28.83%、14.82%，粗蛋白中疏水性氨基酸含量為37.21g/100g。菜籽水解蛋白具有良好的溶解性和高質(zhì)量濃度下保持流動的特性。水解蛋白體外還原能力和清除自由基能力顯著，具有體外抗氧化活性。

菜籽水解蛋白；組成；物化性能；抗氧化活性

Abstract：The chemical composition, physico-chemical properties andin vitrofunctional properties of the rapeseed protein hydrolysates (RPHs) left after aqueous enzymatic extraction of oil were studied. The hydrolysates mostly consisted of protein,carbohydrate and ash, and the contents were 54.95%, 28.83% and 14.82%, respectively. The hydrophobic amino acid content was 37.21 g/100 g protein. The hydrolysates had an excellent solubility and lower viscosity at high concentration. Their reducing power and abilities to scavenge DPPH and hydroxyl free radicals were all obvious, indicating good antioxidant effectin vitro.

Key words：rapeseed protein hydrolysates；composition；physico-chemical properties；antioxidant activity

水酶法提油作為一種新興的非有機溶劑提油技術(shù)，是當(dāng)前國際油脂界的研究熱點[1]。其除了具有操作安全、低能耗等優(yōu)勢以外，在制取植物油脂的同時，可同步回收其中的蛋白質(zhì)及碳水化合物類物質(zhì)。研究這些產(chǎn)物的性質(zhì)，從而開發(fā)其利用方式，對推進油料水酶法提油技術(shù)的實際應(yīng)用具有十分重大的科學(xué)與現(xiàn)實意義。

油菜籽是我國優(yōu)勢油料資源，種植面積約700萬公頃，產(chǎn)量約1300萬t[2]。油菜籽富含油脂和蛋白質(zhì)，長期以來，由于傳統(tǒng)制油工藝及油菜籽原料中硫苷等抗?fàn)I養(yǎng)因子的限制，我國對菜籽蛋白及菜籽水解蛋白的研究報道還不多。本研究在水酶法提取油菜籽中油脂的基礎(chǔ)上[3]，系統(tǒng)研究了另一產(chǎn)物——菜籽水解蛋白的組成、儲存穩(wěn)定性及體外功能性質(zhì)，以期為水酶法提油工藝得到的水解蛋白這一產(chǎn)物的功能特性、抗氧化性質(zhì)研究及產(chǎn)品應(yīng)用開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽水解蛋白粉(水解度為19.28%)按水酶法提油工藝制備[3]。

DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 日本東京化成工業(yè)株式會社。

1.2 儀器與設(shè)備

RJ-LD-IIB型低速大容量多管離心機 無錫市瑞江分析儀器有限公司； SHZ-88臺式水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；L-117型實驗室噴霧干燥塔 瑞士步旗公司；Agilentll00氨基酸自動分析儀 安捷倫公司；XW-80A旋渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；NDJ-5S數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計 上海青浦滬西儀器廠；CR-400色差計 柯尼卡-美能達公司；DRC Ⅱ型l ICPMS 美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 菜籽水解蛋白的組成

1.3.1.1 成分分析

蛋白質(zhì)含量的測定：GB/T5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱式定氮法；總糖含量的測定：苯酚-硫酸法[4]；灰分的測定：GB/T5009.4—2003《食品中灰分的測定》質(zhì)量法；游離氨基酸含量測定：茚三酮比色法[4]；粗脂肪測定：GB/T5009.6—2003《食品中脂肪的測定》索式抽提法。

1.3.1.2 氨基酸組成分析

樣品前處理后，采用氨基酸自動分析儀測定。分析儀條件：可見光檢測器，波長：570nm(蛋白質(zhì)采用440nm波長測定)；離子交換柱：2.6mm×150mm；流速：0.225mL/min；流動相：檸檬酸和檸檬酸鈉的緩沖液；進樣量：50μL。

1.3.1.3 金屬元素含量測定

按文獻[5]方法處理樣品，電感偶合等離子體參數(shù)：功率1100W；冷卻氣流量(Ar) 15.0L/min；輔助氣流量(Ar) 0.90L/min；載氣流量(Ar) 0.90L/min。質(zhì)譜儀參數(shù)：分析室真空為12Pa，分辨率(10%峰高)0.8unit，停留時間90ms，重復(fù)次數(shù)6，測量點峰2，循環(huán)次數(shù)6，測量方式為質(zhì)量掃描；樣品提升量1mL/min。金屬元素含量表示為mg/kg樣品。

1.3.2 菜籽水解蛋白理化性質(zhì)的測定

1.3.2.1 溶解性[6]

以氮溶解指數(shù)(NSI)作為菜籽水解蛋白溶解性指標(biāo)。依據(jù)AACC 46-23.01測定不同pH 值下樣品的NSI 值。

1.3.2.2 菜籽水解蛋白溶液黏度

25℃條件下，用旋轉(zhuǎn)黏度計測定質(zhì)量濃度為2、5、10、15、20、30、40、50g/100mL的菜籽水解蛋白水溶液的黏度。

1.3.3 菜籽水解蛋白體外功能特性研究

1.3.3.1 菜籽水解蛋白還原能力[7]

取1mL一定質(zhì)量濃度的樣品加入2.5mL pH6.6的磷酸緩沖液(0.2mol/L)和2.5mL 1g/100mL的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50℃水浴中保溫20min，加入2.5mL 10g/100mL的三氯乙酸，混合后以3000r/min離心10min。取上清液2.5mL和0.5mL 0.1g/100mL的氯化鐵混合均勻，靜置30min，700nm波長處測定混合液的吸光度。吸光度越大，表示還原能力越強。

1.3.3.2 菜籽水解蛋白清除DPPH自由基能力[8]

取0.2mL一定質(zhì)量濃度的樣品，加入5.5mL 0.065mmol/L DPPH溶液(以無水乙醇配制)，混合均勻后黑暗處避光反應(yīng)30min，以0.2mL樣品和5.5mL無水乙醇混合后的溶液作為空白調(diào)零，在520nm波長處測定吸光度。

式中：As代表樣品和 DPPH混合液的吸光度；A0代表溶劑和DPPH混合液的吸光度。

1.3.3.3 菜籽水解蛋白清除·OH能力[9]

用磷酸緩沖液將樣品配制成不同質(zhì)量濃度。取lmL 0.75mmol/L的鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管中依次加入2mL磷酸緩沖液(pH7.40，0.2mol/L)和lmL H2O，充分混勻后，加入lmL 0.75mmol/L FeSO4溶液，混勻后，加入lmL 0.01% H2O2，于37℃水浴60min后，在536nm波長處測其吸光度，所測得的數(shù)據(jù)為損傷管的吸光度A損。未損傷管以lmL H2O代替損傷管中l(wèi)mL0.01%的H2O2，操作方法同損傷管，可測得536nm波長處未損傷管的吸光度A未。樣品管以lmL樣品代替損傷管中的lmL H2O，操作方法同損傷管，測得536nm波長處樣品的吸光度A樣。清除率按式(2)計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽水解蛋白的組成

水解度為19.28%的菜籽水解蛋白的組分分析見表1，水酶法提油中蛋白酶對菜籽蛋白的降解及油脂的分離使得水解蛋白這一產(chǎn)物中粗蛋白含量較高(54.95%)。其次，就是占干基28.83%的總糖，這部分碳水化合物主要來源于原料中的可溶性糖及淀粉、果膠、纖維素等的降解。工藝中酸堿pH值條件調(diào)節(jié)過程引入了一定的鹽分，使得水解蛋白的灰分達到了14.82%，這將給其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用帶來一定的限制。水解蛋白粉中游離氨基酸含量為2.30%，以蛋白質(zhì)基計，僅占總蛋白含量的4.18%，表明選用的酶主要以內(nèi)切方式(endo-)對菜籽蛋白進行作用。水酶法從菜籽中提油的另一產(chǎn)物——水解蛋白的蛋白質(zhì)含量高。測定其氨基酸組成。

表1 菜籽水解蛋白的成分分析(以干基計)Table 1 General chemical composition of RPHs

表2 菜籽水解蛋白的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of RPHs

由表2可知，主要氨基酸為Glu、Asp、Leu和Arg，其相對含量分別占19.52%、8.32%、7.78%和6.86%；必需氨基酸與非必需氨基酸比例為0.51。有研究表明[10]，疏水性氨基酸含量與樣品的抗氧化活性及清除自由基能力之間有一定的正相關(guān)性，水解蛋白的疏水性氨基酸含量為37.21g/100g，這為開展其抗氧化性能與清除自由基能力等體外活性研究提供了潛在結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

水酶法提油工藝中由于調(diào)節(jié)體系pH值所需，不斷引入一些酸堿試劑，使得菜籽水解蛋白中灰分含量高達14.82%。測定水解蛋白中的金屬元素含量，結(jié)果見表3，除了Na、K、Mg和Ca含量高以外，水解蛋白中過渡金屬離子Cu和Fe含量也較高。章邵兵[11]采用類似水酶法工藝制備得到的菜籽蛋白水解物灰分含量為9.17%，總糖含量為19.75%，比本實驗所測灰分和糖含量低，這是工藝中使用的酶種類不同所致。

表3 菜籽水解蛋白的金屬元素組成Table 3 Metal element composition of RPHs

2.2 菜籽水解蛋白的理化性質(zhì)

圖2 不同pH值菜籽水解蛋白的溶解特性Fig.2 Solubility of RPHs at different pH values

水解蛋白的溶解性是其最重要的物化性質(zhì)之一，具有優(yōu)越的溶解性是蛋白及肽發(fā)揮諸多功能應(yīng)用所必須的。從圖2可知，菜籽水解蛋白具有寬泛pH值范圍內(nèi)良好的溶解性能，即使在菜籽蛋白等電點4.5附近，菜籽水解蛋白的NSI也達到84%，這是由于酶解作用使菜籽蛋白的平均分子質(zhì)量和尺寸降低，形成更多親水性和可溶劑化的肽單元。菜籽水解蛋白良好的溶解性能使其在不同領(lǐng)域的應(yīng)用成為可能，諸如在食品中應(yīng)用，可為終產(chǎn)品提供易接受的外觀和絲滑的口感。

圖3 不同質(zhì)量濃度菜籽水解蛋白的黏度Fig.3 Viscosity of RPHs at different concentrations

不同質(zhì)量濃度菜籽水解蛋白的黏度變化見圖3。菜籽水解蛋白溶液黏度隨質(zhì)量濃度增加變化不大，流動性極好，在50g/100mL質(zhì)量濃度時仍富有流動性。

2.3 菜籽水解蛋白體外抗氧化活性的研究

2.3.1 菜籽水解蛋白的還原能力

圖4 菜籽水解蛋白的質(zhì)量濃度與還原能力的關(guān)系Fig.4 Concentration dependence of reducing power of RPHs

研究表明，抗氧化劑的還原力與其抗氧化性之間存在聯(lián)系，抗氧化劑通過給出電子和質(zhì)子氫，從而起到清除自由基的作用[12]。因此，可以通過測定菜籽水解蛋白對Fe3+的還原力來評價其抗氧化性的強弱，還原力越強，抗氧化性越強。

還原能力測定中，測試體系中的還原劑(抗氧化劑)將Fe3+還原成Fe2+形式，減少了Fe3+/[Fe(CN)6]3－絡(luò)合物的量，在700nm波長處比色測定形成的普魯士藍(lán)可以監(jiān)測形成的Fe2+。從圖4可知，菜籽水解蛋白在低質(zhì)量濃度時(1mg/mL)就顯示顯著的還原能力(P＜0.05)，且呈顯著的量效關(guān)系。這表明，菜籽水解蛋白中可能含有作為電子供體、可與自由基反應(yīng)形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的肽等抗氧化成分。

2.3.2 菜籽水解蛋白清除自由基能力

DPPH自由基分析法是測定自由基能力的常用方法，穩(wěn)定的DPPH自由基呈深紫色，因其具有單電子而在517nm波長處具有強吸收，DPPH自由基接受了其他物質(zhì)提供的電子后會形成穩(wěn)定的反磁體分子并且吸收會消失，紫色逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系[13]。通過DPPH自由基體系中吸光度變化可以衡量樣品清除自由基的能力，從而評價樣品的抗氧化能力。

在生命活動的氧化代謝過程中不斷產(chǎn)生各種自由基，其中·OH是體內(nèi)最活潑的活性氧，它幾乎可以和所有的細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，引起膜脂、蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡和機體病變[14]。

表4 菜籽水解蛋白清除自由基能力Table 4 Free radical scavenging capacities of RPHs

由表4可知，在本實驗所測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，菜籽肽顯示了顯著的清除DPPH自由基和·OH能力，并且清除自由基能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強。朱艷華等[15]報道玉米多肽在質(zhì)量濃度0.05～5mg/mL范圍內(nèi)，對DPPH自由基清除率最高為57.59%。菜籽水解蛋白在質(zhì)量濃度為15mg/mL時對DPPH自由基的清除率達到69.5%，高于同等質(zhì)量濃度下玉米多肽對DPPH自由基的清除能力。菜籽水解蛋白清除自由基的作用機制很可能是直接提供質(zhì)子和自由基反應(yīng)后將其轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼮榉€(wěn)定的物質(zhì)，而發(fā)揮自身清除自由基的能力。

3 結(jié) 論

水酶法提油得到的菜籽水解蛋白是富含蛋白質(zhì)和多糖的混合物，疏水性氨基酸含量達到37.21g/100g(以蛋白質(zhì)基計)，水解蛋白中的金屬元素主要是Na、K、Mg和Ca。菜籽水解蛋白具有良好的溶解能力和高質(zhì)量濃度下保留流動的物化性能，體外實驗中，顯示了優(yōu)良的還原能力和清除多種自由基的能力，說明其具有良好的抗氧化特性。

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Chemical Composition and Functional Properties of Rapeseed Protein Hydrolysates Left after Aqueous Enzymatic Extraction of Oil

WANG Ying-yao，WEI Cui-ping，LUAN Xia，ZHANG Shuang-yu ，DU Chuan-lin
(Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China)

Q816

A

1002-6630(2010)21-0072-04

2010-05-12

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2009BABD1B0305)

王瑛瑤(1978—)，女，副研究員，博士，主要從事糧油食品加工研究。E-mail：wyy@chinagrain.org