許審時(shí)，馬海樂(lè),2,*

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013，2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

金黃色葡萄球菌脈沖磁場(chǎng)殺菌實(shí)驗(yàn)、生物學(xué)窗效應(yīng)及其失活動(dòng)力學(xué)

許審時(shí)1，馬海樂(lè)1,2,*

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013，2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

以金黃色葡萄球菌為對(duì)象，研究磁場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和樣品溫度對(duì)殺菌效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨磁場(chǎng)強(qiáng)度的增加，金黃色葡萄球菌殘留率總體呈下降趨勢(shì)，其中磁場(chǎng)強(qiáng)度3.5T時(shí)殺菌效果最好；活菌殘留率隨脈沖數(shù)的增加而降低，在20個(gè)脈沖數(shù)時(shí)達(dá)到最低，之后殘留率趨于穩(wěn)定；溫度對(duì)殺菌效果有一定的協(xié)同促進(jìn)作用。研究得到了脈沖磁場(chǎng)殺菌的最優(yōu)條件為：磁場(chǎng)強(qiáng)度3.5T、脈沖數(shù)20個(gè)、樣品溫度30℃，此條件下金黃色葡萄球菌殘留率為7.29%。在本實(shí)驗(yàn)中，金黃色葡萄球菌ATCC25923的脈沖磁場(chǎng)殺菌效果表現(xiàn)出生物學(xué)窗效應(yīng)：脈沖數(shù)的窗值為20；當(dāng)脈沖數(shù)為20時(shí)，磁場(chǎng)強(qiáng)度的窗值IW符合如下遞推關(guān)系：IW(n)=n(9－n)/4－1(n為“強(qiáng)度窗”的出現(xiàn)序次，n=1、2、3)。通過(guò)分析Gelow模型、Weibull模型和Hulsheger模型決定系數(shù)(R2)表明，Gelow模型最好地?cái)M合了脈沖磁場(chǎng)作用下金黃色葡萄球菌殘留率動(dòng)力學(xué)變化。

脈沖磁場(chǎng)；金黃色葡萄球菌；殺菌；窗效應(yīng)；動(dòng)力學(xué)

Abstract：The sterilization effect of pulsed magnetic field treatment onStaphylococcus aureuswas examined under different levels of field intensity, pulse number and bacterial suspension temperature. As field intensity increased, the residual survival rate ofStaphylococcus aureusgenerally tended to decrease and the best sterilization effect was observed at a filed intensity of 3.5 T. The effect of pulse number on the residual survival rate of this strain was similar to that of field intensity, and the residual survival rate of this strain reached its minimum after 20 pulses were completed, and then tended to be unchanged with increasing pulse number. Additionally, environmental temperature had a synergistic promoting effect on the inactivation ofStaphylococcus aureus. The above results demonstrate that the optimal levels of field intensity, pulse number and bacterial suspension temperature for sterilizingStaphylococcus aureuswere 3.5 T, 20 and 30℃, respectively. The percentage of residual viable cells was 7.29%under these conditions. The sterilization of pulsed magnetic field onStaphylococcus aureusdisplayed a biological window effect.The window value of field intensity under 20 pulse number and 20 window value of pulse number accorded with the following recurrence formula:IW(n)=n(9－n)/4－1 (nis appearing sequence of the window value of field intensity,n=1, 2 and 3). The comparative analysis of correlation coefficients (R2) of the Gelow, the Weibull and the Hulsheger models indicates that the Gelow model is the best model describing the dynamic change of percentage of residual viableStaphylococcus aureuscells during pulsed magnetic field treatment.

Key words：pulsed magnetic field；Staphylococcus aureus；sterilization；biological window effect；dynamics model

目前，食品工業(yè)中主要的殺菌方式是熱殺菌，如傳統(tǒng)的巴氏殺菌、高溫短時(shí)、超高溫等殺菌技術(shù)。但大多熱殺菌技術(shù)存在破壞食品色澤、滋味及功能等問(wèn)題，既能保證食品安全又能保持固有的營(yíng)養(yǎng)成分的非熱殺菌技術(shù)已成為食品工業(yè)的研究熱點(diǎn)，大量研究表明，脈沖磁場(chǎng)技術(shù)殺菌效果顯著，是一種有前途的非熱殺菌技術(shù)[1-5]，不過(guò)脈沖磁場(chǎng)殺菌技術(shù)的機(jī)理研究還非常欠缺。為此，本實(shí)驗(yàn)以食品中常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，研究殺菌操作參數(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌殺滅效果的影響，進(jìn)一步探討脈沖磁場(chǎng)(pulsed magnetic field，PMF)殺菌的生物學(xué)窗效應(yīng)、研究動(dòng)力學(xué)模型。

1 材料與方法

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus)ATCC25923由中國(guó)微生物研究所提供。

1.2 儀器與設(shè)備

脈沖磁場(chǎng)殺菌設(shè)備 自行研制(專利號(hào)ZL0322055111)；LZ- 610H型特斯拉計(jì) 湖南婁底市聯(lián)眾科技有限公司；WFJ7200型分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 常州國(guó)華電器有限公司；QYC-211型恒溫培養(yǎng)搖床 上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司；YX1400Z型電熱蒸汽壓力消毒器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；SHZ-88A型恒溫水浴振蕩器 太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 菌落總數(shù)測(cè)定

參照GB/T 4789.12—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)》進(jìn)行。

1.3.2 金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

1.3.3 脈沖磁場(chǎng)殺菌

脈沖磁場(chǎng)殺菌設(shè)備場(chǎng)度范圍為0.66～4.0T。磁場(chǎng)強(qiáng)度可通過(guò)調(diào)節(jié)充電電壓進(jìn)行調(diào)節(jié)，并用特斯拉計(jì)進(jìn)行測(cè)量。殺菌時(shí)將菌液放入殺菌室內(nèi)，接通電源，調(diào)整電壓到需要值，進(jìn)行充電，當(dāng)電容兩端電壓達(dá)到規(guī)定的放電電壓時(shí)，進(jìn)行放電，完成一個(gè)脈沖數(shù)的殺菌。之后讓脈沖磁場(chǎng)發(fā)生器停止工作30s，以削弱焦耳熱導(dǎo)致螺旋線圈的溫度升高，然后再進(jìn)行下一次的殺菌實(shí)驗(yàn)。完成殺菌處理后，取出樣品，將菌液搖勻后進(jìn)行殺菌效果的檢驗(yàn)。

每一次實(shí)驗(yàn)取1mL菌液，保持初始菌液中金黃色葡萄球菌的菌濃在106～107CFU/mL之間，將菌液加入盛有9mL生理鹽水的離心管中，將離心管放入殺菌室進(jìn)行殺菌處理。

1.3.4 殺菌效果檢驗(yàn)

采用平板菌落計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)金黃色葡萄球菌殘留率來(lái)檢測(cè)殺菌效果。金黃色葡萄球菌殘留率按式(1)計(jì)算。

式中：N為殺菌后菌液中金黃色葡萄球菌數(shù)；N0為殺菌前菌液中金黃色葡萄球菌數(shù)。

根據(jù)公式計(jì)算得出的殘留率研究金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)時(shí)期、磁場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)及樣品溫度對(duì)脈沖磁場(chǎng)殺菌效果的影響。

1.3.5 金黃色葡萄球菌殺菌動(dòng)力學(xué)模型

受脈沖磁場(chǎng)處理，金黃色葡萄球菌活性變化的動(dòng)力學(xué)過(guò)程用Gelow模型[7]、Weibull模型[8]和Hulsheger模型[9]進(jìn)行擬合。

式中：S=N/N0，N0和N分別是PMF處理前后活菌的數(shù)量/(CFU/mL)；t為處理時(shí)間/s，在本實(shí)驗(yàn)中用脈沖數(shù)代表；D為十進(jìn)制減少時(shí)間。

式中：bt為回歸系數(shù)；tc為PMF處理的臨界時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)中為臨界脈沖數(shù)；t為處理時(shí)間/s，在本實(shí)驗(yàn)中用脈沖數(shù)代表。

式中：a和b分別是比例因子(scale factor)和形狀因子(shape factor，b＜1時(shí)存活率曲線呈凹形，b＞1時(shí)存活率曲線呈凸形，b=1時(shí)存活率曲線呈線性)；t為處理時(shí)間，在本實(shí)驗(yàn)中用脈沖數(shù)代表。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌脈沖磁場(chǎng)殺菌效果的研究

2.1.1 金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)殺菌效果的影響

圖1 金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve ofStaphylococcus aureus

如圖1所示，金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)時(shí)間0～1.5h為延遲生長(zhǎng)期，1.5～16h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從16h起進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期與衰亡期。課題組的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微生物對(duì)高強(qiáng)度脈沖磁場(chǎng)輻射最為敏感[2]，尤其是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中期，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用的金黃色葡萄球菌都是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期8h的菌株。

2.1.2 磁場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)殺菌效果的影響

圖2 磁場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)脈沖磁場(chǎng)殺菌效果的影響Fig.2 Effect of magnetic field intensity onStaphylococcus aureusinactivation

在脈沖數(shù)分別為10、20、30，樣品溫度30℃，pH7.0的條件下，不同磁場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)殺菌效果的影響如圖2所示。在不同的脈沖數(shù)下，隨著磁場(chǎng)強(qiáng)度增加，金黃色葡萄球菌的活菌殘留率整體呈下降趨勢(shì)，尤其重要的是當(dāng)磁場(chǎng)強(qiáng)度為某些特定值時(shí)，殘留率表現(xiàn)出低于其兩側(cè)磁場(chǎng)強(qiáng)度下殘留率的變化規(guī)律，并且殘留率的波動(dòng)呈現(xiàn)一種規(guī)律性，即谷值呈現(xiàn)出遞推關(guān)系，這一現(xiàn)象符合電磁波生物學(xué)窗效應(yīng)的特征，該效應(yīng)是指生物體只有受特定頻率參數(shù)與特定強(qiáng)度參數(shù)恰當(dāng)組合的電磁波作用時(shí)才能產(chǎn)生最佳作用效果的一種生物學(xué)現(xiàn)象[10]。脈沖磁場(chǎng)殺菌的生物學(xué)窗效應(yīng)在本課題組的研究中多次出現(xiàn)過(guò)[1-5]。在本研究中，相同磁場(chǎng)強(qiáng)度下，脈沖數(shù)為20時(shí)，殺菌效果最好；當(dāng)脈沖數(shù)為20時(shí)，1、2.5T和3.5T是3個(gè)強(qiáng)度的窗值IW。

IW符合如下遞推關(guān)系：IW(n)=n(9－n)/4－1

式中：n為“強(qiáng)度窗”的出現(xiàn)序次，n=1、2和3。其中，當(dāng)n=3時(shí)，即磁場(chǎng)強(qiáng)度為3.5T，殺菌效果最好。

脈沖磁場(chǎng)殺菌的強(qiáng)度窗效應(yīng)發(fā)生的機(jī)理尚在探索之中。

2.1.3 脈沖數(shù)對(duì)殺菌效果的影響

在磁場(chǎng)強(qiáng)度分別為1.0、2.5、3.5T，樣品溫度30℃、pH7.0的條件下，脈沖數(shù)變化對(duì)金黃色葡萄球菌殺菌效果的影響如圖3所示。隨著脈沖數(shù)的增大，不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下的金黃色葡萄球菌殘留率均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，隨著脈沖數(shù)的進(jìn)一步增加，活菌殘留率趨于穩(wěn)定。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是細(xì)胞膜在瞬時(shí)脈沖周期性反復(fù)作用下，使離子容易穿過(guò)細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜變薄，而引起微孔迅速變大[11-12]。當(dāng)脈沖數(shù)持續(xù)增加，一旦超過(guò)細(xì)胞膜所能承受的臨界壓力時(shí)，可造成胞內(nèi)物質(zhì)外噴，將導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生不可修復(fù)的破裂，即出現(xiàn)電穿孔[13]。雖然脈沖數(shù)的窗效應(yīng)不像強(qiáng)度窗效應(yīng)那么明顯，但從圖3還可以看出，脈沖數(shù)的窗值是20。脈沖磁場(chǎng)殺菌中脈沖數(shù)的窗效應(yīng)在本課題組以往的研究中也出現(xiàn)過(guò)[1-5]，但其發(fā)生機(jī)理也有待探討。

圖3 脈沖數(shù)對(duì)脈沖磁場(chǎng)殺菌效果的影響Fig.3 Effect of pulse number onStaphylococcus aureusinactivation

2.1.4 樣品溫度對(duì)殺菌效果的協(xié)同作用

圖4 溫度對(duì)脈沖磁場(chǎng)殺菌效果的影響Fig.4 Effect of environmental temperature onStaphylococcus aureusinactivation

在磁場(chǎng)強(qiáng)度3.5T、脈沖數(shù)20、pH7.0的條件下，樣品溫度對(duì)殺菌效果的影響如圖4所示。隨著溫度的升高，金黃色葡萄球菌殘留率逐漸降低，在30℃以后殺菌效果較好且趨于平緩，而在5～20℃范圍內(nèi)殺菌效果的改善非常顯著，但此溫度遠(yuǎn)低于金黃色葡萄球菌的熱致死溫度，說(shuō)明溫度對(duì)脈沖磁場(chǎng)的殺菌效果有協(xié)同作用。金黃色葡萄球菌的最適生長(zhǎng)溫度為37℃[15]，一般來(lái)講，當(dāng)介質(zhì)溫度處于最適生長(zhǎng)溫度范圍內(nèi)時(shí)，微生物對(duì)脈沖磁場(chǎng)的殺菌處理比較敏感，容易被殺死，而在較低溫度下，殺菌效果不好，可能是由于微生物對(duì)不利其生存的環(huán)境表現(xiàn)出的抗逆性。

2.2 金黃色葡萄球菌脈沖磁場(chǎng)殺菌動(dòng)力學(xué)的研究

由圖3可知，在PMF作用下金黃色葡萄球菌的殘留率變化與代表著殺菌總時(shí)間的脈沖數(shù)之間并非線性關(guān)系，因此在PMF作用下活菌殘留率曲線不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。這與其他學(xué)者研究脈沖電場(chǎng)殺菌結(jié)果相一致[9,14]。為了研究PMF作用下金黃色葡萄球菌失活的動(dòng)力學(xué)特性，用Gelow模型、Weibull模型和Hulsheger模型擬合圖3中金黃色葡萄球菌殘留率曲線數(shù)據(jù)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)值。擬合結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Gelow模型、Weibull模型和Hulsheger模型擬合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Parameters of Gelow, Weibull and Hulsheger models for percentage of residue viable cells

表1顯示，不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下3個(gè)模型中，3個(gè)磁場(chǎng)強(qiáng)度下Gelow模型擬合金黃色葡萄球菌殘留率的相關(guān)系數(shù)R2均為最高，說(shuō)明Gelow模型很好的擬合了PMF金黃色葡萄球菌殘留率曲線。

3 結(jié) 論

3.1 磁場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)、溫度等對(duì)脈沖磁場(chǎng)殺菌效果均有一定影響。隨著磁場(chǎng)強(qiáng)度的增大，金黃色葡萄球菌ATCC25923殘留率總體呈下降趨勢(shì)，其中3.5T時(shí)殺菌效果最好。活菌殘留率隨脈沖數(shù)的增加也呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，在20個(gè)脈沖時(shí)達(dá)到最低，之后殘留率趨于穩(wěn)定。溫度對(duì)脈沖磁場(chǎng)殺菌具有協(xié)同促進(jìn)作用。

3.2 在磁場(chǎng)強(qiáng)度3.5T、脈沖數(shù)20個(gè)、樣品溫度30℃的條件下，脈沖磁場(chǎng)對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的殺菌效果，殘留率可達(dá)7.29%。

3.3 金黃色葡萄球菌的脈沖磁場(chǎng)殺菌在本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出生物學(xué)窗效應(yīng)，脈沖數(shù)的窗值為20；當(dāng)脈沖數(shù)為20時(shí)，磁場(chǎng)強(qiáng)度的窗值IW符合如下遞推關(guān)系：IW(n)=n(9－n)/4－1(n為“強(qiáng)度窗”的出現(xiàn)序次，n=1、2和3)。

3.4 Gelow模型、Weibull模型和Hulsheger模型中，Gelow模型能夠較好地?cái)M合脈沖磁場(chǎng)殺菌對(duì)金黃色葡萄球菌殘留率的動(dòng)力學(xué)曲線。

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Sterilization and Biological Window Effects of Pulsed Magnetic Field onStaphylococcus aureusand Its Inactivation Dynamics

XU Shen-shi1，MA Hai-le1,2,*
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. Jiangsu Provincial Research Center of Agricultural Products Bio-processing and Separation Engineering, Zhenjiang 212013, China)

TS205.9

A

1002-6630(2010)21-0020-04

2010-03-21

國(guó)家“863”計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2007AA100405)

許審時(shí)(1985—)，男，碩士，主要從事強(qiáng)磁場(chǎng)設(shè)備與強(qiáng)磁場(chǎng)技術(shù)研究。E-mail：xushenshi@163.com

*通信作者：馬海樂(lè)(1963—)，男，教授，博士，主要從事食品功能因子及其分離技術(shù)研究。E-mail：mhl@ujs.edu.cn