李永霞，曾海英，秦禮康*

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

酵母細(xì)胞破碎條件優(yōu)化及高肽酶菌株篩選

李永霞，曾海英，秦禮康*

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

為構(gòu)建酵母細(xì)胞總肽酶活力的測(cè)定方法。采用單因素試驗(yàn)和L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以反應(yīng)體系中游離氨基酸總量為肽酶活力指標(biāo)，對(duì)酵母細(xì)胞破碎條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：最佳破壁條件為：蝸牛酶添加量10mg/mL、超聲破碎功率500W、超聲時(shí)間8min、超聲時(shí)間間隔5s。在此條件下，對(duì)主要源于貴州特色發(fā)酵豆制品的61株酵母菌進(jìn)行總肽酶活力測(cè)定，獲得產(chǎn)高肽酶酵母菌4株，即WCF-5、XWF-1、XWF-7和YZJ-4。

酵母菌；破碎；總肽酶；發(fā)酵豆制品

Abstract：To construct a method for determining total peptidase activity in yeast cells, a L9(34) orthogonal array design generated based on single-factor experiments was employed to optimize conditions for yeast cell disruption. In the optimization, the effects of 4 conditions for yeast cell disruption on total free amino acid amount in reaction system were dealt with. Snailase dose of 10 mg/mL, ultrasonic power of 500 W, ultrasonic treatment time of 8 min and ultrasonic operation interval of 5 s were found optimum. Under these optimum conditions, 61 yeast strains originated from unique Guizhou-style fermented soybean products were subjected to total peptidase activity determination, and 4 of them, namely WCF-5, XWF-1, XWF-7 and YZJ-4, were found have higher pepetidase activity.

Key words：yeast；disruption；total peptidases；fermented soybean products

大豆發(fā)酵食品，因富含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和特殊的“一、二次生理活性物質(zhì)”，倍受世界各國(guó)的高度重視[1]。大豆發(fā)酵食品除突出的營(yíng)養(yǎng)健康功能外[2]，獨(dú)特的風(fēng)味特征日益成為市場(chǎng)需求劇增的決定性因素[3]，而產(chǎn)品特征風(fēng)味的形成主要取決于大量揮發(fā)與非揮發(fā)化合物之間的綜合平衡，在形成這些化合物的生化途徑中，以蛋白質(zhì)降解及其氨基酸代謝最為關(guān)鍵[4]。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破裂所引起的質(zhì)構(gòu)改變，有利于滋香味化合物的釋放，降解產(chǎn)生的短肽和游離氨基酸，不僅直接賦予產(chǎn)品滋味[5]，而且還作為揮發(fā)性化合物的前體，經(jīng)氨基酸水解酶、轉(zhuǎn)氨酶等催化進(jìn)行次生代謝或者與還原糖進(jìn)行Maillard反應(yīng)，形成大量的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[6-7]。目前，篩選高蛋白酶、高肽酶、高氨基酸水解酶和轉(zhuǎn)氨酶的菌株，進(jìn)行擴(kuò)培菌劑制備和菌群強(qiáng)化發(fā)酵，已成為縮短高蛋白發(fā)酵食品后熟期的主要途徑。

研究資料表明，酵母菌作為發(fā)酵食品中常見(jiàn)的益酵菌株之一，可利用自身酶系進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生大量酯香、醇香等風(fēng)味物質(zhì)，在醬油、腐乳等傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品的后熟期，酵母菌發(fā)酵對(duì)風(fēng)味成分形成也起到了不容忽視的作用[8]。肽酶是能分解蛋白短肽的酶類總稱，大多存在于微生物細(xì)胞內(nèi)，在發(fā)酵過(guò)程中當(dāng)細(xì)胞自溶后，便釋放肽酶水解肽類形成氨基酸，作為風(fēng)味前體。因此，為了構(gòu)建酵母細(xì)胞總肽酶活力的測(cè)定方法，本實(shí)驗(yàn)對(duì)酵母細(xì)胞破碎方法和條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)源于貴州特色發(fā)酵豆制品的酵母菌進(jìn)行高肽酶菌株篩選，為生產(chǎn)應(yīng)用提供益酵菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

實(shí)驗(yàn)菌株：從貴州各地極具風(fēng)味特色的發(fā)酵制品中分離純化出來(lái)的酵母菌株，共61株。菌株來(lái)源及編號(hào)見(jiàn)表1。其中，用于酵母細(xì)胞破碎實(shí)驗(yàn)的菌株編號(hào)為ZF-5。

表1 供試菌株來(lái)源及編號(hào)Table 1 Sources and numbers of tested strains

培養(yǎng)基：虎紅培養(yǎng)基購(gòu)于上海盛思生化科技有限公司；PDA液體培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)室自制[9]。

大豆肽粉購(gòu)于上海西王淀粉有限公司(執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為QB/T 2653—2004《大豆肽粉》)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、氯化鈉、溶菌酶、茚三酮、亮氨酸、乙酸、乙酸鈉、乙醇、抗壞血酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VCX750超聲細(xì)胞破碎儀 美國(guó)Sonics公司；冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

準(zhǔn)確取50mg/L的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液[10]。取8支20mL具塞刻度試管并編號(hào)，參照文獻(xiàn)[11]中操作步驟加入各種試劑，蓋上玻璃塞，混勻。再在100℃水浴中加熱15min(加熱時(shí)封口)，取出后立即置于冷水中迅速冷卻。然后迅速向每管中加入5mL 95%乙醇，塞好塞子，猛搖試管，此時(shí)溶液呈紫色。然后用60%乙醇稀釋至20mL，以0號(hào)管為參比進(jìn)行調(diào)零，于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度，重復(fù)3次，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性方程[11]。得出亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y＝0.8335x－ 0.0328，R2＝0.9978。

1.3.2 酵母菌總肽酶活力測(cè)定

酵母菌總肽酶活力測(cè)定的流程：

1.3.2.1 菌種復(fù)壯活化

對(duì)所獲菌株進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)后染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)與原菌株記錄結(jié)果是否一致，純化檢查合格者，釣菌進(jìn)行保種工作。將菌種接種于液體PDA培養(yǎng)基中，(28±1)℃條件下培養(yǎng)48～72h，反復(fù)轉(zhuǎn)接2～3次，使其恢復(fù)良好的生長(zhǎng)傳代能力。

1.3.2.2 收集菌體

將活化好的菌株5mL接種于50mL液體PDA培養(yǎng)基中，于(28±1)℃條件下培養(yǎng)48h左右，取菌液于4℃條件下10000r/min離心5min，得到菌體細(xì)胞。上清液置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.3 酵母菌總肽酶液的制備[12]

將所獲菌體用生理鹽水反復(fù)沖洗2～3次后，與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比對(duì)菌濃度為1.5×108CFU/mL左右，菌體離心后使其懸浮在4mL含有40mg蝸牛酶、1mol/L山梨醇、0.02mol/L檸檬酸-磷酸(pH5.8)緩沖液中，置37℃水浴鍋中水浴3h，使酶與菌體完全反應(yīng)，然后10000r/min離心5min，將所獲沉淀，即酵母菌球形體懸浮于10mL pH7.5的Tris-HCl緩沖液中冰浴超聲破碎，條件為功率500W，超聲時(shí)間間隔5s，總超聲時(shí)間8min。超聲完成后將菌液10000r/min離心5min，收集上清液。取1.3.2.2節(jié)的上清液以及超聲破碎得到的上清液各0.5mL于小試管中。該液體即為待測(cè)肽酶液。

1.3.2.4 肽酶活力測(cè)定反應(yīng)體系

取制備的肽酶液1mL，加入質(zhì)量濃度2g/100mL的無(wú)菌大豆肽溶液1mL，置于3mL pH7.5的Tris-HCl緩沖液中反應(yīng)過(guò)夜[13]，最后取反應(yīng)液1mL，測(cè)定其中游離氨基酸總量。

1.3.3 反應(yīng)體系中游離氨基酸總量計(jì)算

吸取1mL反應(yīng)液，置于20mL干燥具塞刻度試管中，加入1mL無(wú)氨蒸餾水。其他操作步驟與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方法相同。根據(jù)顯色液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的氨基酸量，反應(yīng)體系中的游離氨基酸總量以每100mL反應(yīng)液中的氨基酸含量(mg)表示。

式中：m＇為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的氨基酸的質(zhì)量/μg；V為樣品提取液總體積/mL；Vs為測(cè)定時(shí)所取樣品液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響總肽酶活力的酵母菌破碎單因素試驗(yàn)

為了篩選高肽酶活力的菌株，需要對(duì)供試菌株進(jìn)行細(xì)胞破碎，使其胞內(nèi)肽酶能夠溶出，以便與反應(yīng)底物充分結(jié)合。目前酵母細(xì)胞的破碎方法主要有酶法、機(jī)械破碎法、化學(xué)滲透法、液氮凍融法等，但是無(wú)論采用哪種單一的方法破碎效果均不理想，而且單一方法對(duì)酶活力影響較大[14]。故本實(shí)驗(yàn)采用酶法與機(jī)械破碎即超聲破碎相結(jié)合來(lái)進(jìn)行酵母菌細(xì)胞破碎。

2.1.1 蝸牛酶添加量對(duì)總肽酶活力的影響

蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，它含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種酶[15]?？梢杂糜谥参锛敖湍讣?xì)胞壁的破碎，因此廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)和基因工程學(xué)的研究。將離心獲得的菌體等量懸浮于4mL含有1mol/L山梨醇、0.02mol/L檸檬酸-磷酸(pH5.8)緩沖液中，分別添加蝸牛酶10、30、50、70mg，置37℃水浴鍋中水浴3h，然后再于超聲功率500W，超聲時(shí)間間隔5s條件下超聲破碎10min。得到的酶液與多肽溶液反應(yīng)，最后測(cè)定反應(yīng)體系中游離氨基酸總量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 蝸牛酶添加量對(duì)體系中游離氨基酸總量的影響Fig.1 Effect of snailase dose on total free amino acid amount in reaction system

由圖1可知，隨著蝸牛酶添加量的增大，樣品中游離氨基酸總量不斷升高。當(dāng)蝸牛酶添加量增大到30mg后，樣品中游離氨基酸總量升高趨勢(shì)緩慢，當(dāng)蝸牛酶添加量增大到50mg后趨于穩(wěn)定。綜合考慮到蝸牛酶添加過(guò)量會(huì)造成結(jié)果偏高以及成本等因素，選擇蝸牛酶添加量控制在30～50mg之間。

2.1.2 超聲破碎功率對(duì)總肽酶活力的影響

將離心獲得的菌體等量懸浮于4mL含有50mg蝸牛酶、1mol/L山梨醇、0.02mol/L檸檬酸-磷酸(pH5.8)緩沖液中，置37℃水浴鍋中水浴3h。然后分別在超聲功率為100、300、500、700W條件下超聲10min，超聲時(shí)間間隔5s。得到的酶液與多肽溶液反應(yīng)，最后測(cè)定反應(yīng)體系中游離氨基酸總量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲功率對(duì)體系中游離氨基酸總量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on total free amino acid amount in reaction system

由圖2可知，隨著超聲功率的不斷增大，樣品中游離氨基酸總量先是升高隨后降低?？紤]到超聲功率太大會(huì)使酶活力有所下降，故選擇功率在300～500W之間。

2.1.3 超聲破碎時(shí)間對(duì)總肽酶活力的影響

獲得的菌體等量懸浮于4mL含有50mg蝸牛酶、1mol/L山梨醇、0.02mol/L檸檬酸-磷酸(pH5.8)緩沖液中，置37℃水浴鍋中水浴3h。然后分別在超聲功率為500W條件下分別超聲1、5、10、15、20min，超聲時(shí)間間隔5s。得到的酶液與多肽溶液反應(yīng)，最后測(cè)定反應(yīng)體系中游離氨基酸總量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)體系中游離氨基酸總量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on total free amino acid amount in reaction system

由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中游離氨基酸總量先是不斷升高，當(dāng)時(shí)間增大到10min左右時(shí)樣品中游離氨基酸總量升到最大值，隨后開(kāi)始下降。故超聲時(shí)間可控制在10min左右。

2.1.4 超聲破碎時(shí)間間隔對(duì)總肽酶活力的影響

運(yùn)用超聲波對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的熱，而溫度過(guò)高則會(huì)使酶失活。所以為保證總肽酶的活力，在冰浴超聲外，還要間隔一定時(shí)間，以使緩沖體系的溫度保持基本恒定。獲得的菌體等量懸浮于4mL含有50mg蝸牛酶、1mol/L山梨醇、0.02mol/L檸檬酸-磷酸(pH5.8)緩沖液中，置37℃水浴鍋中水浴3h。然后分別在超聲功率為500W條件下超聲10min，超聲時(shí)間間隔分別為1、3、5、7、9s。得到的酶液與多肽溶液反應(yīng)，最后測(cè)定反應(yīng)體系中游離氨基酸總量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間間隔對(duì)體系中游離氨基酸總量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic operation interval on total free amino acid amount in reaction system

由圖4可知，超聲時(shí)間間隔控制在1～7s之間，樣品中游離氨基酸總量趨于平穩(wěn)，大于7s時(shí)游離氨基酸總量會(huì)下降。故可選擇時(shí)間間隔控制在5s左右。

2.2 酵母細(xì)胞破碎條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響細(xì)胞總肽酶活力的蝸牛酶添加量、超聲時(shí)間、超聲功率和超聲時(shí)間間隔進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表2。正交試驗(yàn)中，以反應(yīng)體系中總游離氨基酸含量作為優(yōu)化的指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design

表3 酵母菌細(xì)胞破碎正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal array layout and experimental results

表4 酵母破碎正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 Variance analysis for total free amino acid amount in reaction system with various cell disruption conditions

從表3可以看出，對(duì)酵母細(xì)胞總肽酶活力影響最大的因素是超聲時(shí)間，其次是蝸牛酶添加量，再次是超聲功率，最后是超聲時(shí)間間隔，即影響因素主次順序?yàn)镃＞A＞B＞D。酵母細(xì)胞破碎最佳工藝條件為A2B3C1D2，即蝸牛酶添加量為10mg/mL、超聲功率500W、超聲時(shí)間8min、超聲時(shí)間間隔5s。由表4可知，4個(gè)因素中只有超聲時(shí)間是影響總肽酶活力的顯著性因素。

2.3 酵母菌肽酶活性測(cè)定

在最佳實(shí)驗(yàn)組合：蝸牛酶添加量為10mg/mL、超聲功率500W、超聲時(shí)間8min、超聲時(shí)間間隔5s的條件下，對(duì)源于貴州特色發(fā)酵豆制品的61株酵母菌進(jìn)行總肽酶活力測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 酵母菌總肽酶活性測(cè)定結(jié)果Table 5 Total peptidase activity of 61 yeast strains originated from unique Guizhou-style fermented soybean products

從表5可以看出，高產(chǎn)肽酶活力的酵母菌有4株，分別是WCF-5、XWF-1、XWF-7、YZJ-4。其中，肽酶活力最高的是采集樣品臭豆腐乳中分離提取出的WCF-5號(hào)酵母。

3 結(jié) 論

3.1 通過(guò)單因素試驗(yàn)，得到各因素對(duì)酵母菌總肽酶活力影響程度從大到小依次是超聲時(shí)間＞蝸牛酶添加量＞超聲功率＞超聲時(shí)間間隔；超聲時(shí)間是影響總肽酶活力的顯著性因素。酵母菌細(xì)胞破碎的最佳組合條件為蝸牛酶添加量10mg/mL、超聲時(shí)間8min、超聲功率500W、超聲時(shí)間間隔5s。

3.2 篩選得到產(chǎn)總肽酶活力較高的酵母菌株4株，分別是WCF-5、XWF-1、XWF-7、YZJ-4。其中WCF-5號(hào)酵母所產(chǎn)總肽酶活力最高。

3.3 運(yùn)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)貴州各地所獲菌株的總肽酶活性進(jìn)行差異性分析發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于貞豐縣的菌株總肽酶活力最高，而來(lái)源于郎岱鎮(zhèn)的為最低。除這兩地的菌株總肽酶活力存在顯著差異而外，其他地方的菌株之間的差異均不明顯。

3.4 酵母菌細(xì)胞總肽酶活力整體比文獻(xiàn)報(bào)道的革蘭氏陽(yáng)性桿菌總肽酶活力稍低，表明在發(fā)酵過(guò)程中分解肽類的菌群主體還是革蘭氏陽(yáng)性桿菌，所以篩選高肽酶桿菌用于發(fā)酵對(duì)于縮短發(fā)酵后熟期也顯得尤為重要。

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Optimization of Yeast Cell Disruption and Screening of Strains with High Peptidase Activity

LI Yong-xia，ZENG Hai-ying，QIN Li-kang*
(College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

TS214.2

A

1002-6630(2010)17-0302-05

2010-06-29

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2007]2033號(hào))

李永霞(1986—)，女，碩士研究生，主要從事食品科學(xué)及營(yíng)養(yǎng)與安全研究。E-mail：liyongxiaapo@sina.com

*通信作者：秦禮康(1965—)，男，教授，博士，主要從事食品科學(xué)及營(yíng)養(yǎng)與安全研究。E-mail：likangqin@126.com