童 敏，潘道東*

(寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211)

鴨腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶乳桿菌的分離篩選

童 敏，潘道東*

(寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211)

分離篩選鴨腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶乳桿菌。利用脫脂乳培養(yǎng)基，從鴨消化道中分離篩選出兩株產(chǎn)蛋白酶的乳酸菌，對菌體形態(tài)、染色反應、培養(yǎng)性狀、生理生化性狀進行系統(tǒng)研究，結(jié)合16S rRNA序列分析鑒定出篩選的乳酸菌為干酪乳桿菌鼠李糖亞種和干酪乳桿菌干酪亞種。

乳桿菌；產(chǎn)蛋白酶；分離；鑒定

Abstract：Two lactic acid bacterial stains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of duck with the aid of skim milk medium. The stains were identified asLactobacillus caseisubsp.,RhamnosusandLactobacillus caseithrough the systematic investigations of morphology, staining reaction, physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequences analysis.

Key words：Lactobacillus；producing protease；screening；identification

對乳酸菌的分類、鑒定，傳統(tǒng)的方法包括形態(tài)特征、生理生化反應及血清學反應等。這種方法都存在實驗周期長，不能進行分型或鑒定到亞種，實驗結(jié)果主觀性強等缺點。本實驗結(jié)合16S rRNA序列分析方法[2]，通過提取樣品中微生物的總DNA，從核酸水平對篩選的菌株進行鑒定，

國內(nèi)外有較多報道從人、動物的消化道中成功分離乳桿菌[3-4]，但從鴨腸中分離乳桿菌卻未見報道。本實驗從鴨腸道中分離出兩株產(chǎn)蛋白酶乳桿菌，應用16S rRNA基因序列擴增方法進行分子水平上的鑒定，為進一步研究乳桿菌蛋白酶多態(tài)性選擇優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠頭鴨 市售。

TaqDNA聚合酶、dNTP MasterMix、10×PCR緩沖液、DL2000 DNAMarker 大連寶生物工程有限公司；電泳級瓊脂糖 BioBasic公司；6×DNA上樣緩沖液 Takara公司。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、SL乳桿菌選擇培養(yǎng)基[5]、生化實驗培養(yǎng)基[6](糖發(fā)酵培養(yǎng)基、明膠、吲哚、硫化氫、耐酸、耐膽鹽實驗用培養(yǎng)基)。

1.3 儀器與設備

立式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；雙控電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司；Mastercycler梯度PCR儀 德國Eppendorf公司；紫外凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 乳桿菌初步篩選

殺死鴨子后，無菌取出內(nèi)臟，在無菌平皿內(nèi)分出盲腸、小腸。取黃豆大小的內(nèi)容物分別置于裝有生理鹽水的Eppendorf管中，10倍梯度稀釋成7個梯度，各取0.2mL涂布于MRS培養(yǎng)基上，采用燭缸法[7]，37℃培養(yǎng)48h。挑選白色、圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊、凸起的特征菌落，轉(zhuǎn)接種于SL乳桿菌選擇培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h。挑取單菌落進行鏡檢，挑選革蘭氏陽性、鏡檢為桿狀的菌落作為待篩選菌株。

7) 修復后結(jié)構增重小。復合材料補片密度較小，但力學性能優(yōu)越，有較高的比強度和比剛度。復合材料補片以更小的尺寸和更輕的質(zhì)量獲得與傳統(tǒng)金屬材料同等的修復效果。

1.4.2 產(chǎn)乳酸的鑒定

通過紙層析乳酸定性實驗確定出產(chǎn)乳酸細菌。分別將可疑細菌移入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)12h，取10mL發(fā)酵液進行離心，對上清液進行紙層析。紙層析法[8]：新華1號濾紙，溶液系統(tǒng)為正丁醇、甲酸、水，其體積比為80:15:5，顯色劑為0.04g/100mL溴酚藍-乙醇溶液，0.1mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為6.7，乳酸標準溶液體積分數(shù)為2%，標準液、各菌株發(fā)酵液以毛細管點樣上行層析，顯色比較各斑點的Rf值[9]與標準乳酸的Rf*值。

1.4.3 產(chǎn)蛋白酶菌株復篩

采用脫脂乳培養(yǎng)基[10]，梯度稀釋菌體進行涂布，挑選產(chǎn)生水解圈的菌株作為目標菌株。

1.4.4 生理生化鑒定

篩選出的目標菌株通過過氧化氫酶實驗、糖類發(fā)酵實驗、硝酸鹽還原實驗、產(chǎn)硫化氫實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗、耐酸耐堿實驗等[11]，從生理生化角度鑒定出所篩選菌株的種類。

1.4.5 乳桿菌基因組DNA的制備

取10mL目標菌株過夜培養(yǎng)物，在4℃、12000r/min離心收集菌體1mL，加入400μL STET(0.1mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、體積分數(shù)5% Triton X-100 pH8.0)、10μL Lys，37℃保溫20min，加入等體積苯酚-異戊醇，12000r/min離心10.5min取上清，加等體積苯酚-異戊醇，12000r/min離心5min，取上清加入1/10醋酸鈉和1倍體積乙醇，混勻－20℃放置10min，12000r/min離心10min，棄上清加入0.5mL 75%乙醇溶液洗滌DNA沉淀，最后將DNA溶于50μL雙蒸水中，－20℃保存[12]。

1.4.6 16S rRNA的PCR擴增

PCR反應體系為滅菌三蒸水16μL、Buffer 2.5μL、Mg2+2.5μL、引物各0.5μL、DNA模板1μL、Taq酶0.2μL。引物 27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。在凈化工作臺冰上操作，擴增條件：95℃預變性5min；94℃變性50s，56℃退火50s，72℃延伸80s，循環(huán)30次；72℃延伸10min。

1.4.7 擴增產(chǎn)物的電泳分析及純化

配制瓊脂糖凝膠，取PCR擴增產(chǎn)物6.5μL，加入溴酚藍指示劑，混勻后加樣。95V電泳30min，溴化乙錠染色20min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。切下目的條帶，回收純化，以進行下一步的連接轉(zhuǎn)化。

1.4.8 構建重組質(zhì)粒

將PCR產(chǎn)物回收后，與載體T18在4℃條件下過夜連接，連接產(chǎn)物吸到100μL感受態(tài)細胞中，溫和混勻，置于冰上30min。42℃熱休克90s，迅速放回冰中，將細胞冷卻1～2min后，加入800μL LB培養(yǎng)基，37℃、125r/min，搖蕩培養(yǎng)細菌45～90min。4000r/min離心1min，沉淀菌體，吸去上清液，留250μL左右轉(zhuǎn)化混合物鋪于LB瓊脂平板上(Amp+)，室溫下放置20～30min，待溶液完全被瓊脂吸收后，倒置平皿37℃培養(yǎng)12～16h。隨機挑取單菌落作PCR進行初步檢測，并振蕩培養(yǎng)。

1.4.9 菌種鑒定和測序

將過夜振蕩培養(yǎng)的菌體送由上海生工生物工程技術有限公司測定序列，測序結(jié)果用Blast法[13]鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌培養(yǎng)特征及形態(tài)特征

M RS培養(yǎng)基上，挑選菌落灰白色，扁平，表面光滑，邊緣較整齊的菌落繼續(xù)培養(yǎng)在SL培養(yǎng)基上，將長出的菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。淘汰球菌及鏈球菌，篩選出7株革蘭氏染色陽性，無芽孢，桿狀的菌株劃斜面待進一步鑒定。

2.2 產(chǎn)乳酸鑒定結(jié)果

初篩獲得的7株疑似菌株中有4株分別標記為S1、S2、S7、M13經(jīng)過紙層析后斑點的Rf值與乳酸標準品的Rf*值大致相同，確定為產(chǎn)乳酸菌株。其余3株菌株沒有出現(xiàn)相應的斑點，則不視為目標菌株。

2.3 產(chǎn)蛋白酶實驗

經(jīng)脫脂乳培養(yǎng)基復篩后，得到S1、S2水解圈較為明顯，在梯度稀釋6倍后在培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解圈。S7沒有出現(xiàn)水解圈，則排除在篩選對象之外。M13水解能力很差，只有在沒有進行梯度稀釋時有少量水解圈，故將其剔除。篩選出S1、S2兩株產(chǎn)蛋白酶乳桿菌進行下一步鑒定，其菌體形態(tài)及水解圈見圖1、2。

圖1 菌株 S1、S2的菌體形態(tài)Fig.1 Morphology of strains S1and S2

圖2 菌株稀釋10-6倍后在脫脂乳培養(yǎng)基上呈現(xiàn)的水解圈Fig.2 Hydrolysis ring of diluted strains (10-6) on skim milk mediu

2.4 生理生化鑒定

表1 菌株S1、S2生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strains S1and S2

從表1可以看出，菌株S1、S2經(jīng)過氧化氫酶實驗、硝酸鹽還原實驗、產(chǎn)硫化氫實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗均呈陰性。通過《伯杰氏細菌鑒定手冊》[13]進行比對，表明分離到的S1、S2菌株為乳桿菌。糖發(fā)酵實驗結(jié)果表明S1、S2均能利用果糖、半乳糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇，不能發(fā)酵棉籽糖、鼠李糖、木糖，初步鑒定為干酪乳桿菌，生理生化實驗結(jié)果為后續(xù)16S rRNA測序結(jié)果提供佐證，結(jié)合兩者的結(jié)論使鑒定結(jié)果更為可信。

2.5 耐酸耐堿實驗

從表2可以看出，S1可以在pH3.0～10.0生長，在pH5.0～7.0生長良好，而S2菌株對酸堿環(huán)境有更好的耐受能力，可以在pH2.5～11.0的環(huán)境中生長。兩者對極端酸堿環(huán)境耐受能力均不強，適宜在pH5.0～7.0的環(huán)境中生長。

表2 菌株S1、S2耐酸耐堿實驗結(jié)果Table 2 Acid-resistant and alkali-resistant tests of strains S1and S2

2.6 DNA的提取

所提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色后在凝膠成像儀下觀察，顯示有明亮的條帶出現(xiàn)，表明S1、S2菌株基因組DNA提取成功，結(jié)果見圖3。

圖3 菌株S1與S2基因組DNA電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis patterns of genomic DNA of strains S1and S2

2.7 目標片段的擴增

圖4 S1、S2菌株16S rRNA基因PCR反應產(chǎn)物電泳圖譜Fig.4 Electrophoresis patterns of PCR-amplified products of 16S rRNA of strains S1and S2

如圖4所示，分離得到乳酸菌，目標片段擴增結(jié)果均為3500bp左右，表明16S rRNA擴增成功。

2.8 同源性比較分析

測序結(jié)果表明，從鴨腸中分離到的兩株產(chǎn)蛋白酶菌株的16S rRNA序列長度分別為3486bp和3428bp，將該序列在GenBank上應用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中已有的乳酸菌16S rRNA部分序列進行同源性比較。發(fā)現(xiàn)所測得的S1序列與數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的干酪乳桿菌鼠李糖亞種的16SrRNA序列進行相似性比較，同源性為99%。S2序列與數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的干酪乳桿菌干酪亞種16S rRNA序列進行相似性比較，同源性為98%。

3 結(jié) 論

本實驗從鴨腸中分離出兩株乳桿菌，兩者經(jīng)脫脂乳培養(yǎng)基鑒定都具有產(chǎn)蛋白酶的能力，過氧化氫酶實驗、硝酸鹽還原實驗、產(chǎn)硫化氫實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗均為陰性，結(jié)合革蘭氏染色鏡檢，對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[13]確定S1、S2號菌株為乳桿菌；根據(jù)糖類發(fā)酵實驗結(jié)果，并通過16S rRNA鑒定表明S1、S2號菌株分別為干酪乳桿菌鼠李糖亞種與干酪乳桿菌干酪亞種。

乳酸菌之所以有水解乳蛋白的能力，是因為乳酸菌存在的乳蛋白水解系統(tǒng)將乳蛋白水解成多肽或氨基酸序列，不同的菌種所含有的蛋白酶種類不同，對于乳蛋白的水解切點也不同，所水解的產(chǎn)物也具有各異的生理功能。有報道[14-15]稱乳酸菌蛋白酶水解系統(tǒng)包括胞壁蛋白酶、肽鏈內(nèi)切酶、氨肽酶、pro-特異性肽酶等，胞壁蛋白酶首先把乳蛋白水解成一系列的短肽，然后由轉(zhuǎn)運系統(tǒng)運輸至胞內(nèi)，再由胞內(nèi)肽酶進一步將短肽水解成氨基酸或更小的肽段。可見，乳酸菌細胞壁蛋白酶在水解乳蛋白過程中占有非常重要的地位。本研究旨在篩選出產(chǎn)蛋白酶的乳酸菌后，進一步研究乳桿菌蛋白酶特別是胞壁蛋白酶的酶學特性及調(diào)控機制，以期了解乳桿菌胞壁蛋白酶的差異性與其發(fā)酵產(chǎn)品生理功能的關系，為進一步定向選育優(yōu)良乳酸菌種提供參考。

[1] MANSO M A, LEONIL J, PIOT M, et al. Isolation and characterisation of aLactobacillus helveticusITG LH1 peptidase-rich sub-proteome[J].International Journal of Food Microbiology, 2005, 105(2):119-129.

[2] 杜曉華, 艾日登才次克, 李莉. 蒙古國地區(qū)酸乳中乳酸菌的鑒定及耐酸菌株篩選[J]. 微生物學通報, 2009, 36(7):994-1000.

[3] SHIRO I, TAKESHI A, SAYAKA W, et al. Isolation of halotolerantLactococcus lactissubsp. lactis from intestinal tract of coastal fish[J].International Journal of Food Microbiology, 2008, 121(1):116-121.

[4] 尹軍霞, 沈國娟, 鄒波, 等. 東北虎腸道降膽固醇雙歧桿菌的分離鑒定[J]. 食品科學, 2009, 30(5):205-208.

[5] 楊潔彬, 凌代文. 乳酸菌:生物學基礎及應用[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社, 1996.

[6] 趙斌, 何紹江. 微生物實驗手冊[M]. 北京:科學出版社, 2002.

[7] 伍時華, 黃翠姬, 石媛靖, 等. 酸乳菌種分離純化方法[J]. 食品科學,2004, 25(10):162-166.

[8] 劉曉輝, 陳順, 高曉梅, 等. 酸菜中乳酸菌的分離篩選與鑒定研究[J].中國釀造, 2009(2):62-64.

[9] 潘道東. 抗ACE活性之瑞士乳桿菌的篩選[J]. 食品科學, 2008, 29(2):145-148.

[10] 馮新忠, 王詠星, 范鎮(zhèn)明, 等. 額爾齊斯河野生丁腸道產(chǎn)蛋白酶菌株的初步鑒定及產(chǎn)酶條件的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008(4):104-106.

[11] 張大為, 張潔, 丁成華. 嬰兒腸道內(nèi)嗜酸乳桿菌L2的篩選及菌株代謝產(chǎn)物的初步分析[J]. 食品科學, 2008, 29(4):253-258.

[12] SAMBROOK J, RUSSEL D W. 分子克隆實驗指南[M]. 黃培堂, 譯.3版. 北京:科學出版社, 2002:87-105.

[13] 布坎南R E, 吉本斯N E. 伯杰氏細菌鑒定手冊[M]. 8版. 北京:科學出版社, 1984.

[14] TERESA Z, ANNAMARIA R, EUGENIO P. Enzymatic activities of lactic acid bacteria isolated from Cornetto di Matera sourdoughs[J].International Journal of Food Microbiology, 2007, 115(2):165-172.

[15] NSEREKO V L, SMILEY B K, RUTHERFORD W M, et al. Influence of inoculating forage with lactic acid bacterial strains that produce ferulate esterase on ensilage and ruminal degradation of fiber[J]. Animal Feed Science and Technology, 2008, 145(1/4):122-135.

Isolation and Screening of Protease-producingLactobacilliin Duck Gastrointestinal Tract

TONG Min，PAN Dao-dong*
(College of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Q93.331

A

1002-6630(2010)17-0197-04

2010-01-09

國家自然科學基金項目(30972130)；江蘇省科技支撐計劃項目(BE2009366)；國家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)化基金項目(2009GB2C220412)；國家“863”計劃項目(2007AA10Z357)

童敏(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：tongmin1106@126.com

*通信作者：潘道東(1964—)，男，教授，博士，研究方向為乳品科學。E-mail：daodongpan@163.com