曲云淼，董振國

（1.黑龍江省家畜繁育指導(dǎo)站，哈爾濱 150069；2.黑龍江省博瑞遺傳有限公司 150069）

豬的克隆和轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)為胚胎工程、品種改良以及醫(yī)學(xué)組織工程都提供了新的思路，在諸如異體器官移植和生產(chǎn)一些特定的蛋白質(zhì)等方面具有廣闊的前景。而豬的克隆和轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)等都需要大量成熟的、具有發(fā)育潛力的卵母細(xì)胞[1]。但是由于豬卵母細(xì)胞的生理生化特異性，給克隆和轉(zhuǎn)基因研究帶來諸多不利因素。因此，需要找到一種理想的豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的因素有許多，如所處性周期階段、生長(zhǎng)因子的作用等。本實(shí)驗(yàn)主要探討了培養(yǎng)時(shí)間，以及在培養(yǎng)基中添加表皮生長(zhǎng)因子對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 卵巢的采集和卵泡液的制備

在屠宰場(chǎng)將被屠宰的豬卵巢立即取下，用生理鹽水沖洗干凈，保存于25～35℃含有青霉素（100IU/mL）和鏈霉素（100 IU/mL）的生理鹽水的保溫瓶中，在3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用生理鹽水配制的70%酒精浸泡1 min，然后再用預(yù)熱的生理鹽水洗滌卵巢至無血水為止，選擇排卵點(diǎn)多且直徑在2～5 mm卵泡的卵巢，帶進(jìn)無菌實(shí)驗(yàn)室。

1.2 卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)

使用配有12號(hào)針頭的10 mL注射器從2～5 mm卵泡中抽吸卵母細(xì)胞，采卵液為TCM-199（Hank's），成熟液為自配成熟液，成份為：TCM-199（Earle's）培養(yǎng)液+0.1%PVA（聚乙烯醇）+3.05 mmol/LD-葡萄糖+0.91 mmol/L丙酮酸鈉+75 mg/mL青霉素+50 mg/mL硫酸鏈霉素，在每次使用之前加入藥品：0.57 mmol/L半胱氨酸，0.5 IU/mL LH，0.5 IU/mL FSH，10μg/mL EGF（表皮生長(zhǎng)因子）。將成熟液在培養(yǎng)皿中作成50 μL的微滴，將卵母細(xì)胞放入成熟滴在5%CO2、38.5℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGF濃度對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

在自配成熟液作為對(duì)照組，分別添加10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL EGF 的成熟液培養(yǎng)COCs（卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體），放入5%CO2、38.5℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，觀察卵母細(xì)胞成熟率。

表1 EGF濃度對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

由表1可以看出，添加EGF各組與對(duì)照組相比，成熟率都顯著提高，差異顯著。添加EGF各組的成熟率隨著EGF添加濃度的增加也不斷上升。

2.2 不同成熟時(shí)間對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

將采集到的可用卵母細(xì)胞放入5%CO2、38.5℃、飽和濕度的相同培養(yǎng)條件下分別進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為36 h、40 h、44 h和48 h，觀察卵母細(xì)胞成熟率。

由表2可以看出，隨著成熟時(shí)間的增長(zhǎng)，成熟率逐漸增加。

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

3 討論

3.1 EGF濃度對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

EGF是一種活性物質(zhì)，由53個(gè)氨基組成，通過與特異的、高親和的細(xì)胞膜受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與其他細(xì)胞功能等多效應(yīng)的多肽類物質(zhì)[1]。Carpenter等報(bào)道，它對(duì)不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)都具有很強(qiáng)的促分裂作用。EGF不但能促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，也間接調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞胞漿的成熟。EGF可以促進(jìn)卵丘細(xì)胞擴(kuò)張、減少縫隙連接，抑制顆粒細(xì)胞合成卵母細(xì)胞成熟抑制物（OMI）的作用，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟[2]，也可以參與并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞外大分子的生物合成。EGF通過與細(xì)胞膜上的EGF受體（EGFR）結(jié)合，啟動(dòng)、催化、維持與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有關(guān)的一系列生化過程。EGF的作用機(jī)理可能是與釋放成熟刺激信號(hào)阻斷了卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞的聯(lián)系有關(guān)，也可能其直接對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有添加EGF試驗(yàn)組的成熟率隨著添加量的增加而不斷上升，并且均要高于未添加EGF的試驗(yàn)組，差異顯著。

3.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

由于動(dòng)物的種屬差異和個(gè)體差異，其體外培養(yǎng)的時(shí)間上也是有所差異的。即使同種動(dòng)物在相同的成熟培養(yǎng)條件下其培養(yǎng)時(shí)間也是有所不同的[3]。目前，牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間在20～30 h，而豬卵母細(xì)胞比較特殊，通常需要48 h左右才能達(dá)到核成熟，在24 h的核成熟率幾乎為零。Yoshida認(rèn)為豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間不能低于30 h。30 h之前成熟率隨培養(yǎng)時(shí)間增加而迅速上升，30 h后成熟率隨培養(yǎng)時(shí)間增加而緩慢上升。豬卵母細(xì)胞培養(yǎng)36 h和42 h的成熟率無顯著差異，但顯著低于46 h的成熟率。Sosnowki等對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)成熟率越高，且48 h與36 h之間差異顯著[4]。殷駿等研究了體外培養(yǎng)32～56 h對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，第一極體排出率也逐漸增高，但老化率也相應(yīng)增長(zhǎng)。文國藝等也指出，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間固然可以提高卵母細(xì)胞成熟率，但豬的卵母細(xì)胞也會(huì)逐漸老化。世界首例轉(zhuǎn)基因克隆豬的成熟培養(yǎng)時(shí)間為42～44 h。因此在保證一定的核成熟率的前提下，可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)條件縮短豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體外培養(yǎng)48 h卵母細(xì)胞的成熟率最高，但與44 h試驗(yàn)組差異不顯著。因此我們可以將44作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中豬卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)時(shí)間。

[1] 陳大元.受精生物學(xué)-受精機(jī)制與生殖工程[M].北京：科學(xué)出版社.

[2] 李朝軍，范必勤，王金溪.FSH、EGF、胰島素促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞體外減數(shù)分裂恢復(fù)機(jī)制的研究 [J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，1997，01：27-30.

[3] 閆益波，呂善潮，葉紹輝.豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的主要影響因素[J].浙江畜牧獸醫(yī)，2007，32（6）

[4] NamDH，Lee S H，KimH S，et al. The role of gonadotropinreleasinghormone and its receptor in development ofporcinepreim plantation embryos derived from in vitrofertilization [J].Theriogenology，2005，63：190- 201.