陳紅，鄧瑤，譚文杰，王文，殷霄，管潔，王文玲，阮力

中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 病毒病應(yīng)急技術(shù)中心，北京 100052

不同佐劑對含S+PreS1融合抗原的乙型肝炎病毒顆粒疫苗免疫原性的影響

陳紅*，鄧瑤*，譚文杰，王文，殷霄，管潔，王文玲，阮力

中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 病毒病應(yīng)急技術(shù)中心，北京 100052

本研究在前期工作基礎(chǔ)上，用CHO細(xì)胞表達(dá)的含PreS1+S融合抗原的新型基因工程HBV顆粒疫苗(HBSS1)與Al(OH)3、CpG及CpG+Al(OH)3等佐劑配伍，在Balb/C小鼠模型上研究不同佐劑對HBV顆粒疫苗肌肉注射后免疫應(yīng)答的影響，主要包括抗體滴度、抗體亞型分類及特異性細(xì)胞免疫(γ-IFN ELISpot檢測)。結(jié)果表明：CpG佐劑結(jié)合HBSS1顆粒疫苗可快速誘導(dǎo)(單針免疫)高水平的抗PreS1及S抗體，IgG2a/IgG1比率＞1，同時(shí)可誘導(dǎo)較高抗原特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答；Al(OH)3+CpG雙佐劑組一次免疫后可誘導(dǎo)產(chǎn)生最高的抗S抗體滴度(1:105)，其產(chǎn)生的抗體亞類包括IgG1、IgG2a與IgG2b；在S抗原N端(13～49 aa)存在優(yōu)勢CTL表位。結(jié)論：CpG佐劑結(jié)合HBSS1顆粒疫苗應(yīng)是發(fā)展新型治療性乙肝疫苗的較佳選項(xiàng)。

乙型肝炎病毒，病毒顆粒，疫苗，CpG佐劑

Abstract:We previous reported the development of novel hepatitis B virus(HBV)vaccine containing the surface antigen(S)plus PreS1 fusion derived from Chinese hamster ovary(CHO)cells system.In this study, we analyzed the impact of different adjuvants on immunogenicity of the HBV particle vaccine in Balb/C mice, including alum alone, CpG oligodeoxynucleotides(CpG-ODN)alone and CpG-ODN in combination with alum adjuvant.We first detected the antigen specific humoral response in mice, including total IgG antibody and IgG subtyping.Then, we characterized the specific cell-mediated immune(CMI)response by detection of γ-interferon secreting splenocytes after stimulating with S or PreS1 peptide pool.Our results showed that: CpG-ODN adjuvanted vaccine could rapidly induce higher level of anti-PreS1 and anti-S antibodies, and a higher ratio of IgG2a/IgG1 antibody than that of alum adjuvanted vaccine.At the same time, CpG-ODN adjuvanted vaccine induced robust antigen-specific cellular immune responses in mice, which was superior to that of alum adjuvanted vaccine and CpG-ODN in combination with alum adjuvantedvaccine; however, the vaccine candidate with CpG-ODN in combination with alum adjuvant induced highest anti-S antibody and mixed IgG subclasses in mice after twice immunization.There exists dominant HBV CMI epitopes in the N-terminal of S antigen.These results provided important evidence that CpG-ODN adjuvanted HBSS1 particles vaccine may serve as a novel candidate in the development of new preventive and therapeutic agents against hepatitis B infection.

Keywords:hepatitis B virus(HBV), viral particles, vaccine, CpG-ODN

乙型肝炎病毒(HBV)不僅可引起急慢性肝炎，而且與肝硬化、肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，盡管乙肝疫苗的使用已逾20年，目前HBV仍是傳播最為廣泛的病原之一[1]。據(jù) WHO 分析，全世界每年仍有 50～120萬人死于HBV感染[1]。HBV疫苗在中國已納入計(jì)劃免疫，使用最為廣泛的為酵母或CHO細(xì)胞表達(dá)含S全長的顆粒亞單位疫苗[2]。HBV疫苗長期使用的效果表明，該疫苗加Al(OH)3佐劑后三針免疫可有效保護(hù)人群HBV感染與傳播，但仍有5%～10%的人群不能產(chǎn)生保護(hù)性anti-HBS抗體，且近年來，S變異流行株呈增長趨勢[2]。因此，為進(jìn)一步提高現(xiàn)有乙肝疫苗的保護(hù)效果，許多學(xué)者從新型抗原設(shè)計(jì)及新的佐劑配伍方面進(jìn)行了有益的探索[2-10]。本研究組前期研發(fā)了含PreS1+S融合抗原的HBV顆粒疫苗[3]，對其純化工藝、生物學(xué)性狀及安全性等進(jìn)行了系統(tǒng)研究[3]；同時(shí)采用Al(OH)3、CpG及CpG+Al(OH)3等佐劑配伍，在小鼠模型上探討了不同佐劑對現(xiàn)有市售乙肝疫苗(CHO表達(dá)S抗原)免疫效果的影響[4]。

本研究在前期工作基礎(chǔ)上[3-4]，著重研究不同佐劑配伍對CHO表達(dá)的含PreS1+S融合抗原的新型基因工程HBV顆粒疫苗免疫效果的影響，主要包括抗體滴度、抗體亞型分類及細(xì)胞免疫。

1 材料和方法

1.1 疫苗與佐劑

CHO表達(dá)的含 S+PreS1融合抗原的顆粒疫苗(HBSS1)的制備及生物學(xué)性狀參見文獻(xiàn)[3]。疫苗純度＞95%，抗原含量為 100 μg/mL。Al(OH)3佐劑為北京華爾盾科技服務(wù)公司提供，濃度為2 mg/mL，CpG-ODN 1826[4-6]由NEB公司合成，全鏈硫代修飾純度＞95%，由上述抗原與佐劑分別配伍成3種免疫制劑，即HBSS1+Al(OH)3、HBSS1+CpG、HBSS1+Al(OH)3+CpG，其中每劑中抗原含量皆為 2 μg，Al(OH)3含量為1 mg/mL，CpG含量為10 μg。

1.2 動(dòng)物與試劑

Balb/C小鼠，雌性，6～8周齡，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖中心，HPR標(biāo)記的羊抗小鼠IgG1，羊抗小鼠 IgG2a與羊抗小鼠 IgG2b均購自Sigma公司，HBV S抗體與PreS1抗體檢測ELISA試劑盒購自上?？迫A公司。用于HBV ELISpot檢測用合成肽由NEB公司合成，序列見表1，純度皆大于90%；γ-IFN ELISpot檢測用試劑盒購自BD公司。

1.3 動(dòng)物免疫

按3種免疫制劑分成4個(gè)組，每組6只，即生理鹽水對照組(A)、HBSS1+Al(OH)3組(B)、HBSS1+CpG組(C)與 HBSS1+Al(OH)3+CpG組(D)，免疫及檢測時(shí)間參見圖1，免疫途徑采用肌肉注射[4]，每只抗原注射量均為 2 μg/200 μL。

圖1 免疫及檢測時(shí)間Fig.1 Schedule for immunalization and detection in mice.

1.4 體液免疫應(yīng)答檢測

眼眶采血檢測抗體，參照試劑盒說明進(jìn)行，其中總抗體檢測中酶標(biāo)二抗改為HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG+M+A多價(jià)抗體。抗體亞型分析中則采用相應(yīng)的酶標(biāo)二抗，采用S抗體檢測試劑盒，每組血清混合后皆從1:10稀釋到1:106。

1.5 IFN-γ ELISpot檢測

將合成肽分別分成 S1(PreS1)組，S-1，S-2組(表1)，分別與小鼠脾細(xì)胞(5×105)孵育，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行[5-6]，反應(yīng)終止后在ELISpot讀數(shù)儀上計(jì)數(shù)分析，每組小鼠以106脾細(xì)胞中Spots(減去無關(guān)肽孔)計(jì)數(shù)求均值。

2 結(jié)果

2.1 不同疫苗制劑所引起的體液免疫應(yīng)答

單針免疫后，顆粒疫苗+鋁佐劑(B)中有 2只(2/6)抗 PreS1與抗S抗體陽轉(zhuǎn)，而顆粒疫苗+CpG組(C)與顆粒疫苗+鋁佐劑+CpG 組(D)抗 PreS1皆陽轉(zhuǎn)(6/6)，其中C組(6/6)抗S抗體全陽轉(zhuǎn)，但D組抗S抗體僅有2只(2/6)陽轉(zhuǎn)(表2)。

表1 用于ELISpot檢測的合成肽序列Table 1 Peptide sequences used for IFN-γ ELISpot assay

二針免疫后，B、C、D組抗S1與抗S抗體皆100%陽轉(zhuǎn)，其抗體滴度見表2，其中抗PreS1抗體滴度在3組間無明顯差異，皆為1:104，而抗S抗體滴度則存在差異，以HBSS1+CpG+Al(OH)3組最高，可達(dá)到1:105。

2.2 不同疫苗制劑所引起的細(xì)胞免疫應(yīng)答及抗體亞型

二針免疫后，不同疫苗制劑所誘導(dǎo)的 γ-IFN ELISpot計(jì)數(shù)如圖2所示，以HBSS1+CpG組(C組)誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答最強(qiáng)，Al(OH)3佐劑的加入(D組)減少了免疫小鼠脾細(xì)胞中特異的IFN-γ的分泌，降低了細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。此外，如圖2所示，S-1肽庫刺激可產(chǎn)生較高的 γ-IFN分泌，明顯高于 S-2肽庫刺激與 S1(PreS1)肽庫刺激所產(chǎn)生的 γ-IFN分泌，表明在S抗原N端(13～49 aa)存在優(yōu)勢的CTL表位，同時(shí)我們也注意到含Al(OH)3或CpG佐劑的HBSS1顆粒疫苗也能產(chǎn)生較弱的針對PreS1的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

不同佐劑對 HBSS1抗原引起的抗體亞型應(yīng)答見圖3，單純使用Al(OH)3佐劑時(shí)，以IgG1類抗體占優(yōu)勢，為105，IgG2b抗體為102，無IgG2a抗體存在；單純使用CpG佐劑時(shí)，則IgG1與IgG2a抗體皆顯著存在，以IgG2a抗體為主(IgG2a/IgG1＞1)，IgG2b抗體檢出較低；若CpG與Al(OH)3佐劑共同使用，則IgG1抗體變化與單純使用CpG佐劑相近，IgG2a抗體滴度低于單純使用CpG佐劑組，但I(xiàn)gG2b抗體增高。

表2 單針及二針免疫后的總抗體IgG陽轉(zhuǎn)率及滴度Table 2 Total antibody positive rate and titer of different groups after single or twice immunization

圖2 含不同佐劑的HBSS1顆粒疫苗所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答Fig.2 Characterization of cellular immune responses induced by HBSS1 particle vaccines with different adjuvant by IFN-γ ELISpot assay.

圖3 含不同佐劑的HBSS1顆粒疫苗所誘導(dǎo)的IgG 抗體亞型Fig.3 The subtype class of IgG antibody induced by HBSS1 particle vaccines with different adjuvant by ELISA.

3 討論

接種乙肝疫苗是目前預(yù)防乙肝的有效措施[1,2]，從 2002年起我國將乙肝疫苗納入計(jì)劃免疫。乙肝疫苗的大量使用已經(jīng)明顯降低了我國兒童乙肝病毒的感染率，但是現(xiàn)有疫苗仍存在兩個(gè)比較突出的問題[2]：1)大約5%～10%的接種者完成全程免疫后對疫苗無反應(yīng)或低反應(yīng)，不能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。2)部分接種者雖然能夠產(chǎn)生高水平的抗體，但仍然會(huì)感染乙肝病毒。對這些個(gè)體中的乙肝病毒基因序列分析發(fā)現(xiàn)，HBsAg 主要保護(hù)性抗原決定簇“a”決定簇發(fā)生變異可能為其主要原因。而且中國疾病預(yù)防控制中心的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也表明，在我國乙肝疫苗納入計(jì)劃免疫后的強(qiáng)大免疫選擇壓力之下，這種免疫逃逸變異株的檢出率有增加的趨勢(內(nèi)部資料)。因此，進(jìn)一步優(yōu)化疫苗組分，研制免疫效果更好的新一代乙肝疫苗制劑十分必要。

現(xiàn)有市售基因工程乙肝疫苗除法國巴斯德公司的基因工程乙肝疫苗含有PreS2和S以外[7]，其余的只含S，但含PreS2的基因工程乙肝疫苗并未顯示出更強(qiáng)的免疫效果[7]。隨著對乙肝病毒表面抗原的結(jié)構(gòu)與功能的深入研究發(fā)現(xiàn)，HBV的前 S1區(qū)抗原決定簇比S區(qū)域更為豐富，相應(yīng)的特異性抗體能中和乙肝病毒，保護(hù)機(jī)體免受病毒攻擊[8]。HBV與肝細(xì)胞受體結(jié)合的位點(diǎn)位于PreS1(21～47)[8]，針對這一區(qū)域的抗體能阻斷HBV與肝細(xì)胞的結(jié)合，從而阻止病毒進(jìn)入肝細(xì)胞。同時(shí) PreS1抗體出現(xiàn)早，可能對阻斷 HBV母嬰傳播十分有利[3]。本實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用Adr亞型乙肝表面抗原 S+PreS1融合基因研制了新型HBV顆粒疫苗[3]，對其生物學(xué)活性進(jìn)行了全面檢定。動(dòng)物免疫結(jié)果表明該疫苗既產(chǎn)生S抗體，又能產(chǎn)生PreS1抗體，PreS1抗體的產(chǎn)生早于S抗體，這對母嬰阻斷更為有益[3]。含有PreS1的乙肝疫苗能使對S不反應(yīng)的小鼠重新對S產(chǎn)生抗體反應(yīng)，這對于現(xiàn)有乙肝疫苗不應(yīng)答的人群(約 5%～10%)來說很有意義。這反映出HBSS1Ag免疫效果要優(yōu)于單純含乙肝表面S抗原的疫苗。面對我國大約1億人口為乙肝表面抗原攜帶者，發(fā)展治療性乙肝疫苗，將疫苗的使用從預(yù)防乙肝擴(kuò)展到治療乙肝病毒攜帶者，也應(yīng)是基因工程乙肝疫苗研究的另一個(gè)重要發(fā)展趨勢[2]，在這方面含PreS1的乙肝疫苗和增強(qiáng)細(xì)胞免疫佐劑(CpG ODN)的結(jié)合使用將是這類疫苗研究開發(fā)的重要途徑。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：含單純 Al(OH)3佐劑的HBSS1顆粒疫苗二針免疫后即可誘導(dǎo)較強(qiáng)的S抗體與S1抗體，其抗體亞類主要為IgG1型，即Th2型反應(yīng)，而含單純CpG佐劑的HBSS1顆粒疫苗則可加速S抗體的陽轉(zhuǎn)(表2)，單次免疫后其抗S1抗體的陽轉(zhuǎn)率亦高于含單純Al(OH)3佐劑疫苗組，同時(shí)，抗體亞型除 IgG1外，還產(chǎn)生了 IgG2a且IgG2a/IgG1＞1，表明以 Th1應(yīng)答為主，Th1型應(yīng)答有利于機(jī)體對胞內(nèi)病原體的清除避免持續(xù)性感染的發(fā)生，平衡的 Th1/Th2應(yīng)答有利于克服機(jī)體對抗原的不應(yīng)答性。γ-IFN ELISpot結(jié)果亦表明：含單純Al(OH)3佐劑疫苗組雖可誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，但含單純CpG組佐劑組所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答明顯高于含單純 Al(OH)3佐劑疫苗組，亦明顯高于含CpG+Al(OH)3混合佐劑疫苗組，表明CpG佐劑可增強(qiáng) HBSS1顆粒疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，含Al(OH)3+CpG混合佐劑的HBSS1顆粒疫苗二針肌肉注射后可產(chǎn)生最強(qiáng)的抗S抗體應(yīng)答，但其細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度較含CpG佐劑疫苗低，IgG2a類抗體高于含Al(OH)3佐劑疫苗，低于含CpG佐劑疫苗組，同時(shí)產(chǎn)生了較高 IgG2b類抗體，是較平衡的 Th1/Th2類應(yīng)答。

γ-IFN ELISpot實(shí)驗(yàn)表明，3類佐劑結(jié)合HBSS1顆粒亞單位疫苗肌肉注射皆可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的細(xì)胞免疫應(yīng)答，且在S抗原N端(13～49 aa)存在優(yōu)勢CTL表位。

通過比較含3類佐劑的HBSS1顆粒疫苗的免疫應(yīng)答特點(diǎn)，可以得知CpG佐劑結(jié)合HBSS1顆粒疫苗可快速產(chǎn)生高水平的抗 S1及 S抗體及較高的IgG2a/IgG1比率，同時(shí)可誘導(dǎo)較高抗原特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答，該類疫苗免疫應(yīng)答特點(diǎn)明顯優(yōu)于含Al(OH)3佐劑疫苗組。而含混合佐劑疫苗組二針免疫后可產(chǎn)生最強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答及混合的IgG亞類。

REFERENCES

[1]Lavanchy D.Worldwide epidemiology of HBV infection,disease burden, and vaccine prevention.J Clin Virol, 2005,34(S1): S1?3.

[2]TanWJ, Ruan L.Progress on combination strategies of therapeutic vaccine approaches for the treatment of chronic HBV infection.Chin J Virol, 2006, 22(5):407?411.譚文杰, 阮力.HBV病毒慢性感染疫苗治療的組合策略及研究進(jìn)展.病毒學(xué)報(bào), 2006, 22(5): 407?411.

[3]Tian SF, Zong F, Chen H, et al.The physicochemical and biological properties of SS1 fusion antigen of HBsAg secreted by mammalian cells.Chin J Virol, 2002, 18(4):312?316.田淑芳, 宗芳, 陳紅, 等.哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的乙型肝炎病毒表面S+PreS1融合抗原的理化和生物學(xué)性狀.病毒學(xué)報(bào), 2002, 18(4): 312?316.

[4]Wang SQ, Xu HL, Ruan L, et al.Effects of CpG on the immune response to recombinant hepatitis B virus vaccine.Chin J Virol, 2002, 18(2): 108?112.王四清, 許洪林, 阮力, 等.CpG 對乙型肝炎基因重組(CHO細(xì)胞)疫苗免疫效果的影響.病毒學(xué)報(bào), 2002,18(2): 108?112.

[5]Davis HL, Weeratna R, Waldschmidt TJ, et al.CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen.J Immunol, 1998, 160(2): 870?876.

[6]Xu HL, Wang SF, Guo F, et al.CpG-ODN is a potential candidate adjuvant for human vaccines.Chin J Med, 2002,82(8): 553?556.許洪林, 王世峰, 郭斐, 等.CpG 寡脫氧核苷酸作為人用疫苗佐劑的初步研究.中華醫(yī)學(xué)雜志, 2002, 82(8):553?556.

[7]Kuroda S, Fujisawa Y, Iino S, et al.Induction of protection lever of anti-preS antibodies in humans immunized with a novel hepatitis B vaccine consisting of M(preS2+S)protein particles(a third generation vaccine).Vaccine, 1991, 9(3): 163?169.

[8]Dash S, Rao KV, Panda SK.Receptor for pre-S1(21-47)component of hepatitis B virus on the liver cell: role in virus cell interaction.J Med Virol, 1992, 37(2): 116?121.

[9]Halperin SA, Van Nest G, Smith B, et al.A phase I study of the safety and immunogenicity of recombinant hepatitis B surface antigen co-administered with an immunostimulatory phosphorothioate oligonucleotide adjuvant.Vaccine, 2003,21(19/20): 2461?2467.

[10]Zhang W, Du X, Zhao G, et al.Levamisole is a potential facilitator for the activation of Th1 responses of the subunit HBV vaccination.Vaccine, 2009, 27(36):4938?4946.

Impact of different adjuvants on immunogenicity of the HBV particle vaccine containing the S + PreS1 fusion antigen in Balb/C mice

Hong Chen*, Yao Deng*, Wenjie Tan, Wen Wang, Xiao Yin, Jie Guan, Wenling Wang, and Li Ruan
Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China

Received:August 16, 2009;Accepted:October 9, 2009

Supported by:National Major Special Program of New Drug Research and Development(No.2009ZX09102-237).

Corresponding author:Wenjie Tan.Tel: +86-10-63552140; Fax: +86-10-63552140; E-mail: tanwj28@yahoo.com Li Ruan.Tel: +86-10-63552140; Fax: +86-10-63552140; E-mail: ruanl@public3.bta.net.cn*These authors contributed equally to this study.重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)(No.2009ZX09102-237)資助。