程通，張濤，張雅麗，魏麗華，夏德鎮(zhèn)，王穎彬，張軍，夏寧邵

廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，廈門(mén) 361005

靶向HIV-1 pol的高效人工miRNA的構(gòu)建與體外抗病毒能力評(píng)價(jià)

程通，張濤，張雅麗，魏麗華，夏德鎮(zhèn)，王穎彬，張軍，夏寧邵

廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，廈門(mén) 361005

RNAi技術(shù)在抗HIV-1治療研究中已顯示出巨大潛力，獲得可高效特異抑制HIV-1的RNAi元件是進(jìn)行相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)。miRNA在抑制和表達(dá)方式上相比siRNA具有更多的優(yōu)勢(shì)。本研究即探討構(gòu)建可高效特異靶向HIV-1的人工miRNA元件。選擇以保守性較好的HIV-1 pol基因?yàn)榘袇^(qū)篩選高效保守的RNAi序列，設(shè)計(jì)了16個(gè)可靶向pol區(qū)高保守區(qū)段的RNAi靶點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)載體與HIV-1感染性克隆進(jìn)行共轉(zhuǎn)染抑制實(shí)驗(yàn)，篩選顯示pol1026序列兼具高保守性及高抑制效率特點(diǎn)。以天然miR-30a為基礎(chǔ)骨架構(gòu)建了靶向pol1026靶點(diǎn)的人工miRNA元件，通過(guò)與HIV-1感染性克隆質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證獲得了可有效抑制HIV-1表達(dá)的人工miRNA元件(miR-1026E)。通過(guò)與攜帶靶序列的報(bào)告質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明miR-1026E具有良好的靶點(diǎn)特異性。本研究進(jìn)一步構(gòu)建了攜帶miR-1026E表達(dá)元件的重組慢病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)MT-4細(xì)胞并對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行克隆化篩選，獲得穩(wěn)定整合miR-1026E表達(dá)元件的MT-4-miR1026E細(xì)胞克隆，該細(xì)胞在體外攻毒實(shí)驗(yàn)中可高效抑制HIV-1的復(fù)制，具有顯著的抑制HIV-1的能力。同時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)RT-PCR方法檢測(cè)顯示，miR-1026E在細(xì)胞中不會(huì)影響內(nèi)源性代表miRNA(miR-181與miR-16)的表達(dá)水平和干擾素效應(yīng)相關(guān)基因stat1的表達(dá)水平，具有良好的特異性。所獲得的可特異高效抑制HIV-1復(fù)制的人工miRNA元件可為抗HIV-1研究提供重要參考。

RNA干擾，HIV-1，pol，人工miRNA

Abstract:RNA interference(RNAi)has exhibited huge potentials on anti-HIV-1 therapy research.The obtainment of RNAi element targeting to HIV-1 highly effectively and specifically was crucial for relevant research.Recent reports had described that microRNAs(miRNAs)posses more characteristics of inhibition and expression mechanisms than small interfering RNAs(siRNAs).In this study we explored the construction of artificial miRNA targeting to HIV-1 effectively and specifically.Sixteen siRNAs sequences were selected based on the conserved regions in the HIV-1 pol gene.ShRNA expression vectors were co-transfected withHIV-1 clone pNL4-3 to evaluate the abilities of siRNAs to inhibit HIV-1 expression.The pol1026 sequence was selected from candidates.The target sequence in the stem-loop structure of the well-characterized native miR-30a was replaced with pol1026 sequences, and the artificial miRNA expression vectors were co-transfected with the HIV-1 clone pNL4-3, results showed that HIV-1 can be effectively inhibited by miR-1026E.Target specificity of miR-1026E was confirmed by co-transfection assay with reporter plasmids containing different target sequences.The miR-1026E expression element was then inserted into Lentivirus which was used as a vector to transduce the MT-4 cells, MT-4-miR1026E expressing miR-1026E stably was cloned from transduced cells.The MT-4-miR1026E cell effectively inhibited HIV-1 replication in vitro.And the intracellular miR-181 and miR-16 expression levels and stat1 mRNA levels were not affected by the expression of miR-1026E in MT-4-miR1026E cells.miR-1026E is a promising candidate for future research.

Keywords:RNA interference, HIV-1, pol, artificial miRNA

RNA干擾(RNAi)是細(xì)胞內(nèi)序列特異性抑制靶基因表達(dá)的機(jī)制，RNAi技術(shù)應(yīng)用于抗HIV-1治療研究是目前的研究熱點(diǎn)[1-2]。獲得對(duì)HIV-1具有高效抑制能力和高特異性的 RNAi元件是進(jìn)行相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)。miRNA是細(xì)胞內(nèi)源性調(diào)節(jié)基因表達(dá)的RNA分子，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等功能中起著重要作用[3]。miRNA基因可由RNA聚合酶II或III啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，前體經(jīng)RNaseIII家族的Drasha和Dicer酶加工形成成熟miRNA，天然miRNA主要通過(guò)與靶基因mRNA的3'端非編碼區(qū)的不完全匹配以翻譯抑制方式負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]。近來(lái)研究顯示，對(duì)天然miRNA進(jìn)行靶序列區(qū)替換可改變miRNA的抑制靶點(diǎn)和抑制方式[5]，顯示了構(gòu)建人工miRNA的可行性。由于 miRNA在表達(dá)和抑制方式上相比siRNA具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因此可高效靶向 HIV-1的人工miRNA元件具有更好的應(yīng)用潛力。HIV-1 pol基因編碼病毒復(fù)制必需的蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，序列保守性高。本研究即以HIV-1 pol基因?yàn)榘袇^(qū)域，通過(guò)分析選擇設(shè)計(jì)可靶向 pol區(qū)高保守區(qū)段的RNAi靶位點(diǎn)。通過(guò)與HIV-1感染性克隆的共轉(zhuǎn)染抑制實(shí)驗(yàn)篩選兼具高保守性及高抑制率的 RNAi靶點(diǎn)，并嘗試以天然 miRNA為基礎(chǔ)骨架構(gòu)建可靶向該靶點(diǎn)的人工 miRNA元件，并進(jìn)一步通過(guò)脫靶效應(yīng)檢測(cè)、抑制特異性分析和體外攻毒實(shí)驗(yàn)對(duì)本研究構(gòu)建的人工 miRNA元件的抑制效率和特異性進(jìn)行分析。本研究獲得的可特異高效抑制HIV-1復(fù)制的人工miRNA元件為進(jìn)一步的抗HIV-1研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞株

MT-4細(xì)胞株、E.coli DH5α菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。pSUPER質(zhì)粒購(gòu)自 Oligoengine公司。攜帶luciferase基因的報(bào)告質(zhì)粒 pGL3-control購(gòu)自Promega公司。慢病毒包裝質(zhì)粒(包含pLP1、pLP2和pVSVG)以及293FT細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen公司，表達(dá)質(zhì)粒pMACSKK.II購(gòu)自Miltenyi公司，慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLL3.7由廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院韓家淮教授[6]惠贈(zèng)。

1.2 生化試劑

DMEM、RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清(FBS)購(gòu)自Hyclone公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。Luciferase Reporter Assay Kit購(gòu)自Promega公司。DEAE Dextran購(gòu)自Sigma公司。Trizol、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、NCod miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和Platinum? SYBR? Green qPCR SuperMix UDG Kit購(gòu)自Invitrogen公司。IFN Response Watcher Kit購(gòu)自TaKaRa公司。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq酶購(gòu)自TaKaRa公司。HIV Elisa檢測(cè)試劑盒來(lái)自北京萬(wàn)泰公司。β-半乳糖苷酶原位染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。核酸提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司。

1.3 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

以HIV-1NL4-3序列為模板序列，應(yīng)用Invitrogen和 Genscript公司提供的輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)靶向HIV-1 pol基因的siRNA序列。靶向luciferase基因的 siRNA-luc[7]和靶向 HIV-1 gag基因的 siRNA-gag1607[8]作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。合成表 1各靶序列所對(duì)應(yīng)的引物，分別經(jīng)退火處理后連接到經(jīng) Bgl II和Hind III雙酶切的pSUPER載體，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定獲得所需克隆。

1.4 miRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

pLLKK表達(dá)載體的構(gòu)建：通過(guò) PCR方法擴(kuò)增pMACSKK.II質(zhì)粒上的H-2KK表達(dá)框(PCR引物序列分別為：5'-TTTACTAGTCATGTTTGACAGCTT ATCATCG-3'和5'-TTTCTCGAGATACAAGGATCC ATCTACCCTCCTTTTCCACC-3')，PCR產(chǎn)物以Spe I和Xho I雙酶切處理后連接到經(jīng)Xba I和Xho I雙酶切處理的慢病毒轉(zhuǎn)移載體pLL3.7，經(jīng)酶切鑒定后獲得pLLKK表達(dá)載體。

表1 用于siRNA合成的引物序列Table 1 Primers used for siRNA construction

miRNA表達(dá)載體的構(gòu)建：合成各靶點(diǎn)miRNA序列所對(duì)應(yīng)的引物(表 2)，以 ddH2O溶解至終濃度為60 mmol，每對(duì)互補(bǔ)引物各3 μL加入24 μL退火緩沖液中，95℃處理 4 min，70 ℃ 1 0 min 后逐步冷卻至4℃。退火產(chǎn)物進(jìn)行 3.0%瓊脂糖凝膠電泳，以單正鏈引物為對(duì)照檢測(cè)是否退火成功。將退火成功的雙鏈片段通過(guò)T4 DNA連接酶連接至經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切處理的pLLKK表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)菌株，經(jīng)酶切鑒定后獲得目標(biāo)miRNA表達(dá)載體。

1.5 報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建

以 HIV-1感染性克隆質(zhì)粒 pNL4-3為模板擴(kuò)增pol基因片段(1279～1442 nt)，5'端添加 Xba I位點(diǎn)，3'端添加Fse I位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物以XbaI和Fse I雙酶切后連接到相同酶切處理的 pGL3-control質(zhì)粒上，經(jīng)酶切鑒定后獲得的質(zhì)粒命名為pGL3-pol1402。采用相同的方法將帶有pol1026靶點(diǎn)序列的pol基因片段(890～1055 nt)插入到pGL3-control獲得pGL3-pol1026。采用基因合成方法合成pol基因片段(890～1055 nt)，其中的pol1026靶點(diǎn)序列“GTATGTAGGATCTGACTTA”采用同義密碼子突變?yōu)椤癎TATGTAGGCAGCGAT TTA”，序列兩端分別添加X(jué)ba I位點(diǎn)與Fse I位點(diǎn)，采用上述相同方法插入到pGL3-control獲得pGL3-pol1026EM。

1.6 共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA對(duì)HIV-1的抑制效率

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔鋪入2.0×105個(gè)293FT細(xì)胞，12 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將miRNA表達(dá)質(zhì)粒(0.3 μg)與HIV-1感染性克隆質(zhì)粒pNL4-3(0.3 μg)混合后用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)，樣品經(jīng)10倍梯度稀釋后用HIV ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)p24蛋白的活性。

1.7 熒光素酶(Luciferase)表達(dá)活性的檢測(cè)

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔鋪入2.0×105個(gè)293FT細(xì)胞，12 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將0.5 μg 待測(cè)miRNA表達(dá)質(zhì)粒與0.1μg報(bào)告質(zhì)粒(pGL3-control、pGL3-pol1026或 pGL3-pol1402)混勻后用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞裂解液用Luciferase Reporter Assay Kit檢測(cè)熒光素酶活性。

1.8 IFN效應(yīng)相關(guān)基因stat1的檢測(cè)

用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，采用TaKaRa公司的 IFN Response Watcher Kit及 Platinum?SYBR? Green qPCR SuperMix UDG Kit進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.9 RT-PCR檢測(cè)miRNA水平

用 Trizol試劑提取細(xì)胞的總 RNA，用 NCod miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和Platinum?SYBR? Green qPCR SuperMix UDG Kit檢測(cè)樣品中的成熟miRNA分子的水平。以內(nèi)源性U6B RNA分子為PCR內(nèi)參，miRNA特異性檢測(cè)引物序列如表3所示。

表2 用于miRNA構(gòu)建的引物序列Table 2 Primers used for miRNA construction

表3 用于real-time PCR檢測(cè)的引物序列Table 3 Primers used for real-time PCR

1.10 重組慢病毒的構(gòu)建和鑒定

將 293FT細(xì)胞鋪于 10 cm細(xì)胞培養(yǎng)平皿中(5×106個(gè)/皿)，6 h后用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000將18 μg包裝質(zhì)?；旌衔?、6 μg的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLLKK-miRNA和6 μg的pSUPER-Drosha(攜帶靶向細(xì)胞Drosha基因的siRNA表達(dá)元件，siRNA靶序列為AACGAGUAGGCUUCGUGACUU[9])混合轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染12 h后更換為完全培養(yǎng)基，72 h后收集含重組慢病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清。重組慢病毒效價(jià)鑒定：通過(guò)293FT細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)鑒定感染效價(jià)，293FT細(xì)胞鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(5×104個(gè)/孔)，12 h后分別加入100 μL經(jīng)10倍梯度系列稀釋后的待測(cè)病毒樣品。培養(yǎng) 48 h后用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter EPICS XL)檢測(cè)孔中表達(dá)EGFP的細(xì)胞數(shù)量，測(cè)定重組病毒的滴度(TU/mL)。

1.11 重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)MT-4細(xì)胞

將 1×105個(gè) MT-4細(xì)胞鋪于 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入polybrene至終濃度為6 μg/mL，慢病毒用量為MOI=40，室溫600×g水平離心60 min，12 h后換液。

1.12 HIV-1NL4-3的制備與鑒定

將 293FT細(xì)胞鋪于 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(8×105個(gè)/孔)，6 h后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染2.4 μg pNL4-3質(zhì)粒，12 h后更換為完全培養(yǎng)基，72 h后收集含有 HIV-1NL4-3的細(xì)胞培養(yǎng)上清。通過(guò)梯度稀釋后對(duì)HIV-1感染報(bào)告細(xì)胞株 TZM-b1的感染實(shí)驗(yàn)鑒定其效價(jià)。將TZM-b1細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1×104個(gè)/孔)，6 h后分別加入50 μL經(jīng)10倍梯度系列稀釋后的待測(cè)病毒，加入DEAE Dextran至終濃度為20 μg/mL。培養(yǎng)48 h后用β-半乳糖苷酶原位染色試劑盒顯色，通過(guò)檢測(cè)樣品孔中的藍(lán)斑數(shù)量，測(cè)定病毒滴度(IU/mL)=藍(lán)斑數(shù)量×稀釋倍數(shù)×20。

1.13 HIV-1NL4-3的體外攻毒實(shí)驗(yàn)

將5×105個(gè)MT-4細(xì)胞或改造后的MT-4細(xì)胞鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，總培養(yǎng)體積為2 mL，加入HIV-1NL4-3感染12 h后用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌2次，繼續(xù)維持培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)p24蛋白的活性。其中，Day1只采集200 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清用于檢測(cè)，并補(bǔ)充 200 μL完全培養(yǎng)上清；Day3開(kāi)始每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均進(jìn)行1:1細(xì)胞傳代，具體方法是：在各時(shí)間點(diǎn)，用移液器將孔中的MT-4細(xì)胞均勻吹散，吸出一半細(xì)胞懸液(1 mL)，部分取樣進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)獲得活細(xì)胞濃度 M，其余低速離心收集培養(yǎng)上清用于檢測(cè) p24蛋白活性；樣品孔中補(bǔ)入1 mL新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞總數(shù)的計(jì)算公式為：各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞理論增殖總數(shù)=(樣品孔活細(xì)胞濃度M×培養(yǎng)體積2 mL)×2N。(其中N為累計(jì)傳代次數(shù)，Day1 未進(jìn)行傳代，Day1和Day3的 N均為 0；Day3及之后各時(shí)間點(diǎn)均進(jìn)行了傳代， Day5、Day8、Day11、Day14和Day17的N分別為：1、2、3、4和5)。

2 結(jié)果

2.1 靶向HIV-1 pol高保守區(qū)的高效RNAi靶點(diǎn)的篩選

本研究對(duì)Los Alamos HIV Sequence Database中的625株HIV-1的pol基因序列進(jìn)行了保守性分析，獲得 16個(gè)可靶向 pol區(qū)高保守區(qū)段的 RNAi靶位點(diǎn)。并構(gòu)建了可靶向上述靶點(diǎn)的siRNA表達(dá)載體，分別通過(guò)與HIV-1感染性克隆質(zhì)粒pNL4-3在 293FT細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制 HIV-1表達(dá)的能力。結(jié)果如圖1所示，本研究設(shè)計(jì)的靶向上述靶點(diǎn)的 siRNA可顯示出不同程度的抑制HIV-1表達(dá)的能力，其中靶向pol1026的克隆可顯示出較好的抑制效果。同時(shí)保守性分析數(shù)據(jù)也顯示，pol1026靶點(diǎn)也具有較好的保守性特征，其在數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)點(diǎn)突變和僅有一個(gè)突變的序列數(shù)占總序列數(shù)的百分比分別為45%和40%，二者累計(jì)為85%。因此，本研究選擇以pol1026為靶點(diǎn)構(gòu)建人工miRNA元件。

圖1 不同RNAi靶點(diǎn)的抑制效率與保守性分析Fig.1 Analysis of inhibition efficiencies and conservation of different RNAi targeting sequences.

2.2 靶向HIV-1 pol1026的人工miRNA的構(gòu)建與鑒定

miR-30a是目前剪切位點(diǎn)研究較為清楚的天然miRNA[5]，因此本研究選擇以 miR-30a作為基礎(chǔ)模板進(jìn)行靶向HIV-1 pol1026靶點(diǎn)的人工miRNA的構(gòu)建。有研究顯示靶點(diǎn)序列僅移位1 nt的siRNA即可在抑制效率上表現(xiàn)出較大差別[10]，因此本研究設(shè)計(jì)了2個(gè)可靶向HIV-1 pol1026靶點(diǎn)的僅移動(dòng)1 nt的人工miRNA(miR-1026E、miR-1026F)(圖2)，分別替換入天然miR-30a的靶序列區(qū)構(gòu)建獲得人工miRNA表達(dá)載體pLLKK-miR-1026E和pLLKK-miR-1026F。通過(guò)與 HIV-1感染性克隆質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)本研究設(shè)計(jì)的人工miRNA是否保持對(duì)HIV-1的抑制能力。共轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的p24活性，以靶向 LacZ基因的 pLLKK-miR-LacZ作為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖3所示，miR-1026E具有較好的抑制HIV-1表達(dá)的能力，而 miR-1026F未表現(xiàn)出抑制效果，因此本研究選擇miR-1026E進(jìn)行進(jìn)一步的分析評(píng)價(jià)。該結(jié)果也說(shuō)明了靶位區(qū)序列的選擇對(duì)miRNA抑制效果存在較大影響，采用步移方式對(duì)篩選針對(duì)特定靶位的高效miRNA是必要的。

2.3 miR-p1026E抑制特異性分析

圖2 人工miRNA元件的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Predicted secondary structures of artificial miRNAs.

圖3 共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人工miRNA對(duì)HIV-1表達(dá)的抑制效率Fig.3 Analysis of HIV-1 p24 protein expression in 293FT cells cotransfected with different artificial miRNA expression vectors and pNL4-3.

本研究進(jìn)一步對(duì)miR-1026E的抑制特異性進(jìn)行分析。目前較常用的分析特定siRNA或miRNA抑制效率的方法是通過(guò)與在報(bào)告基因終止密碼子后攜帶 RNAi元件靶序列的報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染[11]。本研究將miR-1026E靶序列及其相鄰序列克隆入熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pGL3-control的終止密碼子和ployA之間獲得報(bào)告質(zhì)粒pGL3-pol1026，同時(shí)也構(gòu)建了位于HIV-1 pol區(qū)但不包含miR-1026E靶序列的對(duì)照?qǐng)?bào)告質(zhì)粒 pGL3-pol1402以及包含經(jīng)序列突變后的miR-1026E靶序列的對(duì)照?qǐng)?bào)告質(zhì)粒pGL3-pol1026EM。將 miR-1026E表達(dá)載體 pLLKK-miR-1026E分別與各報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，以靶向luc基因的 pSUPER-luc和靶向 LacZ的pLLKK-miR-LacZ載體作為載體對(duì)照。共轉(zhuǎn)染 48 h后收集細(xì)胞裂解上清并檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果如圖4所示，miR-1026E可有效抑制pGL3-pol1026的表達(dá)，不能抑制pGL3-control和pGL3-pol1402以及靶位點(diǎn)區(qū)序列突變的 pGL3-pol1026EM表達(dá)，表現(xiàn)出較好的抑制特異性。

2.4 重組慢病毒載體的構(gòu)建與穩(wěn)定表達(dá)miR-1026E的MT-4細(xì)胞的獲得

來(lái)源于HIV-1的重組慢病毒是一種新型基因轉(zhuǎn)移載體，其可有效感染造血系統(tǒng)來(lái)源細(xì)胞并具有基因整合能力，目前已在 HIV-1的抗病毒研究中得到較為廣泛的應(yīng)用[12]。本研究即應(yīng)用第3代慢病毒載體系統(tǒng)在Drosha活性抑制的293FT細(xì)胞中構(gòu)建了攜帶 miR-1026E表達(dá)元件的重組慢病毒載體Lenti-miR1026E。本研究使用的重組慢病毒載體同時(shí)帶有 EGFP表達(dá)元件，可用于快速檢測(cè)重組病毒效價(jià)對(duì)靶細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率，并便于檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞的克隆化效果[13]。MT-4細(xì)胞是一種HIV-1受體細(xì)胞，可在體外支持T嗜性HIV-1的復(fù)制[14]。重組慢病毒載體Lenti-miR1026E對(duì)MT-4細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，應(yīng)用有限稀釋法進(jìn)行克隆化篩選，通過(guò)篩選檢測(cè)獲得一株可穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因的細(xì)胞克隆 MT-4-miR1026E，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示MT-4-miR1026E細(xì)胞中 EGFP的表達(dá)陽(yáng)性率接近100%(圖5)。本研究進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR方法檢測(cè)了miR-1026E在MT-4-miR1026E細(xì)胞中的表達(dá)水平，檢測(cè)結(jié)果(圖 6)顯示 miR-1026E 在MT-4-miR1026E細(xì)胞中獲得了有效表達(dá)。

2.5 miR-1026E在MT-4細(xì)胞中的脫靶效應(yīng)檢測(cè)

圖4 miR-1026E抑制特異性分析Fig.4 Analysis of target specificity of miR-1026E.

圖5 報(bào)告基因在細(xì)胞克隆MT-4-miR1026E中的表達(dá)效率Fig.5 Expession efficiency of reporter gene EGFP in MT-4-miR1026E cells.

圖6 miR-1026E在MT-4-miR1026E細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.6 Expession level of miR-1026E in MT-4-miR1026E cells.

本研究進(jìn)一步檢測(cè)了miR-1026E對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性代表 miRNA水平和干擾素應(yīng)答途徑的影響。miR-181和miR-16是目前可用于評(píng)價(jià)脫靶效應(yīng)的內(nèi)源性miRNA[15]。通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR方法檢測(cè)MT-4-miR1026E細(xì)胞和對(duì)照 MT-4細(xì)胞中 miR-181和miR-16的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-1026E在細(xì)胞中未對(duì)內(nèi)源性 miRNA的表達(dá)造成明顯影響(圖7A)。同時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)RT-PCR方法檢測(cè)了干擾素效應(yīng)相關(guān)基因stat1的mRNA水平，檢測(cè)結(jié)果如圖7B所示，與MT-4細(xì)胞對(duì)照相比MT-4-miR1026E細(xì)胞的stat1 mRNA水平未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明miR-1026E在細(xì)胞中不會(huì)影響細(xì)胞的干擾素應(yīng)答途徑，進(jìn)一步證明miR-1026E具有良好的抑制特異性。

2.6 穩(wěn)定表達(dá)miR-1026E的MT-4細(xì)胞對(duì)HIV-1的抑制效果

本研究通過(guò)體外攻毒實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)穩(wěn)定表達(dá)miR-1026E的MT-4細(xì)胞對(duì)HIV-1復(fù)制的抑制效果。HIV-1NL4-3為B亞型、T細(xì)胞嗜性的HIV-1病毒，可有效感染并在 MT-4細(xì)胞中復(fù)制[14]。HIV-1NL4-3以MOI=0.2的劑量對(duì)MT-4-miR1026E進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，在感染后不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè) HIV-1 p24蛋白的活性，同時(shí)也檢測(cè)各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的活細(xì)胞數(shù)量，以MT-4細(xì)胞和未攜帶MT-4-miR1026E表達(dá)元件的重組慢病毒Lenti-H2K轉(zhuǎn)導(dǎo)后的MT-4細(xì)胞為對(duì)照。結(jié)果如圖8所示，穩(wěn)定表達(dá) miR-1026E的MT-4-miR1026E細(xì)胞對(duì)HIV-1感染可獲得顯著的抑制效果，并可有效存活和增殖。

3 討論

RNAi技術(shù)已在基因功能研究和疾病治療等方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力，將 RNAi技術(shù)應(yīng)用于抗HIV-1治療研究是目前的研究熱點(diǎn)。獲得對(duì) HIV-1具有高效抑制能力和特異性好的 RNAi元件是進(jìn)行相關(guān)治療方法研究的重要基礎(chǔ)。本研究在HIV-1 pol區(qū)篩選獲得一個(gè)具有較好保守性特征和抑制效率的siRNA靶位，以天然miR-30a為基礎(chǔ)骨架構(gòu)建了可特異靶向該靶點(diǎn)的人工miRNA(miR-1026E)，通過(guò)脫靶效應(yīng)檢測(cè)、抑制特異性分析和體外攻毒實(shí)驗(yàn)證明該人工miRNA具有高效的抑制效率和特異性，具有良好的應(yīng)用潛力。

圖7 miR-1026E的脫靶效應(yīng)分析Fig.7 Analysis of off-target effects of miR-1026E.

圖8 穩(wěn)定表達(dá)miR-1026E的MT-4細(xì)胞對(duì)HIV-1復(fù)制的抑制效果Fig.8 Inhibition of HIV-1NL4-3replication in MT-4-miR1026E cells.

siRNA和miRNA是RNA干擾作用的主要作用成分，其加工和作用機(jī)制存在一些差別。siRNA主要由病毒感染或基因轉(zhuǎn)移表達(dá)產(chǎn)生的dsRNA或shRNA在細(xì)胞中被 Dicer酶所識(shí)別并剪切形成siRNA，與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合形成 siRISC，通過(guò)序列特異性識(shí)別并切割降解靶mRNA[16]。內(nèi)源miRNA來(lái)自于細(xì)胞內(nèi)非編碼蛋白基因區(qū)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pri-miRNA，經(jīng)過(guò)2個(gè)RNase III家族的Drosha和Dicer酶加工后形成成熟的miRNA，與siRNA作用途徑相似，miRNA可與 RISC結(jié)合形成 miRNA蛋白復(fù)合物(miRISC)。miRISC對(duì)靶mRNA的抑制方式和miRNA與靶序列的匹配程度有關(guān)，天然 miRNA多數(shù)是與靶 mRNA序列不完全匹配，通過(guò)非降解的翻譯抑制方式調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]，近來(lái)研究顯示當(dāng) miRNA與靶mRNA序列高度匹配時(shí)也可通過(guò)類似siRNA的作用機(jī)制以剪切降解方式抑制靶基因的表達(dá)[17]。目前以miRNA作為特異性的基因表達(dá)抑制工具已成為RNAi研究的一個(gè)重要方面。

同時(shí)，值得注意的是通過(guò)miRNA抑制靶基因表達(dá)相比siRNA具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。miRNA抑制靶基因表達(dá)方式的多樣性使其可能在應(yīng)對(duì)病毒的靶序列突變導(dǎo)致的逃避抑制上具有一定優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，miRNA相比 siRNA在表達(dá)載體啟動(dòng)子選擇上具有更大的范圍和靈活性，miRNA基因可使用RNA聚合酶 II類啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，而不限制于 RNA聚合酶III類啟動(dòng)子，可通過(guò)使用組織特異性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以實(shí)現(xiàn) RNAi分子表達(dá)的可控性，也有利于避免表達(dá)過(guò)量而可能引發(fā)的對(duì)細(xì)胞正常功能的影響，利于脫靶效應(yīng)的控制。本研究構(gòu)建獲得的靶向HIV-1 pol區(qū)的人工 miRNA(miR-1026E)即使用了屬于RNA聚合酶II類啟動(dòng)子的H2K啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)，在與 HIV-1感染性克隆的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和體外攻毒實(shí)驗(yàn)中均顯示出良好的抑制效果，同時(shí)脫靶效應(yīng)分析顯示不會(huì)影響細(xì)胞正常 miRNA的表達(dá)和干擾素應(yīng)答途徑。

目前，構(gòu)建靶向特定靶點(diǎn)的人工miRNA的策略是將靶序列替換入天然miRNA的靶序列區(qū)。有研究顯示，在 miRNA的加工成熟過(guò)程中，影響 Drosha剪切pri-miRNA的關(guān)鍵因素是其二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)的大小、發(fā)卡長(zhǎng)度、自由末端，與miRNA一級(jí)序列無(wú)關(guān)[18]，這為在天然 miRNA基礎(chǔ)上進(jìn)行靶序列替換構(gòu)建人工miRNA提供理論支持。本研究將篩選獲得的靶向 HIV-1 pol區(qū)的具有高保守性特征和抑制能力的siRNA的靶點(diǎn)序列替換入目前剪切位點(diǎn)較為清楚的 miR-30a的靶序列區(qū)，分別構(gòu)建了兩種其靶序列僅位移1 nt的人工miRNA。共轉(zhuǎn)染抑制檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二者的抑制效率存在很大區(qū)別，應(yīng)用mFOLD軟件進(jìn)行的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)未顯示出具有明顯差別，這說(shuō)明靶位區(qū)序列的微小差別即可能會(huì)對(duì)miRNA的抑制效率產(chǎn)生較大影響，其具體機(jī)制將有待后續(xù)研究闡明。Brake等在siRNA上的研究也顯示出類似現(xiàn)象，靶點(diǎn)序列僅移位1 nt的siRNA即可在抑制效率上存在顯著差別[10]。目前對(duì)于 miRNA的加工成熟與作用機(jī)制仍需要進(jìn)行更全面和深入地研究，本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供一定的啟示。

慢病毒載體可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂期細(xì)胞特別是造血系統(tǒng)來(lái)源細(xì)胞，是目前包括對(duì) HIV-1感染在內(nèi)的基因治療研究中常用的基因轉(zhuǎn)移載體。然而目前常用的慢病毒載體的包裝質(zhì)粒的 gag-pol區(qū)來(lái)源于HIV-1，因此在構(gòu)建表達(dá)靶向HIV-1 gag-pol區(qū)域的RNAi表達(dá)元件時(shí)會(huì)存在抑制自身慢病毒載體構(gòu)建效率的現(xiàn)象。本研究應(yīng)用常規(guī)方法構(gòu)建攜帶miR-1026E表達(dá)元件的重組慢病毒的效率與對(duì)照病毒相比很低(結(jié)果未顯示)。因此，本研究在制備重組慢病毒Lenti-miR1026E時(shí)在構(gòu)建體系中增加了靶向Drosha的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，可較好的恢復(fù)慢病毒的構(gòu)建效率。該方法可無(wú)需對(duì)慢病毒包裝序列進(jìn)行同義突變，可為應(yīng)用于 HIV-1基因治療研究的慢病毒載體構(gòu)建提供一個(gè)適用的選擇。通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)篩選獲得的 MT-4細(xì)胞株在體外高劑量的攻毒實(shí)驗(yàn)中具有顯著的抑制 HIV-1復(fù)制的能力，也進(jìn)一步證明了本研究獲得的特異靶向 HIV-1 pol高保守區(qū)的人工miRNA具有良好的應(yīng)用潛力，可為進(jìn)一步應(yīng)用于新型艾滋病治療方法研究提供重要基礎(chǔ)。

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Tong Cheng, Tao Zhang, Yali Zhang, Lihua Wei, Dezhen Xia, Yingbin Wang, Jun Zhang, and Ningshao Xia
National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China

Received:July 22, 2009;Accepted:November 4, 2009

Supported by:Natural Science Foundation of Fujian Province(No.C0710041), Key Knowledgment Innovation Project of MOE(No.705031), Key Science and Technology Projects of Fujian Province(No.2004YZ01).

Corresponding author:Ningshao Xia.Tel: +86-592-2184113; Fax: +86-592-2181258; E-mail: nsxia@xmu.edu.cn福建省自然科學(xué)基金計(jì)劃(No.C0710041)，教育部科學(xué)技術(shù)研究重大項(xiàng)目培育基金(No.705031)，福建省科技重大專項(xiàng)(No.2004YZ01)資助。