李琴，馬梅生，胡成鈺

南昌大學(xué)生物科學(xué)系，南昌 330031

草魚(yú)膠原凝集素基因的克隆及其功能分析

李琴，馬梅生，胡成鈺

南昌大學(xué)生物科學(xué)系，南昌 330031

從草魚(yú)Ctenopharyngodon idella肝腎cDNA文庫(kù)中克隆得到膠原凝集素基因。草魚(yú)膠原凝集素全長(zhǎng)cDNA為1128 bp，其中5′非編碼區(qū)229 bp，3′非翻譯區(qū)104 bp，最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?95 bp，編碼264個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明草魚(yú)膠原凝集素與斑馬魚(yú)的親緣關(guān)系最近。根據(jù)草魚(yú)膠原凝集素序列特征，克隆了包含糖基識(shí)別域(CRD)的cDNA，并進(jìn)行原核表達(dá)、純化獲得其重組蛋白PCRD。進(jìn)行PCRD與6種細(xì)菌的凝集和糖抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明半乳糖、葡萄糖、甘露糖和麥芽糖 4種糖都會(huì)使 PCRD與嗜水氣單胞菌的凝集明顯下降甚至極大地干擾凝集;麥芽糖使金黃色葡萄球菌的凝集明顯下降，而肽聚糖和甘露糖會(huì)使凝集受到抑制;此外，PCRD的凝集反應(yīng)不依賴(lài)Ca2+。

C-型凝集素，膠原凝集素，糖基識(shí)別域，表達(dá)，草魚(yú)

Abstract:The grass carp(Ctenopharyngodon idella)collectin gene was cloned from mixed liver and kidney cDNA library.The full length sequence of grass carp collectin was 1128 bp, contained a 5′ untranslated region of 229 bp and a 3′ untranslated region of 104 bp.The open reading frame of grass carp collectin was 795 bp which could code a 264 amino acids polypeptide, including a terminal codon.Phylogenetic analyses showed that grass carp collectin shared the highest homology with that of zebrafish(Danio rerio).To understand the function of grass carp collectin, we expressed and purified the recombinant protein(PCRD)that comprised carbohydrate recognition domain(CRD).Agglutination of Aeromonas hydrophila and Staphylococcus aureus etc.and sugars inhibition experiments showed that: galactose, glucose, mannose and maltose could inhibit the agglutination of Aeromonas hydrophila.Maltose could lower the agglutination of Staphylococcus aureus, whereas peptidoglycan and glucose inhibited it well.In addition, the activity of grass carp collectin could not dependent on Ca2+.

Keywords:C-type lectin, collectin, carbohydrate recognition domain(CRD), expression, grass carp

C-型凝集素(C-type lectins)是凝集素的重要一員，它是一種Ca2+依賴(lài)的糖結(jié)合蛋白，在機(jī)體的先天免疫和獲得性免疫、控制糖蛋白的生物合成等方面發(fā)揮著重要功能[1-3]。雖然在不同的物種中，C-型凝集素差異很大，但一般至少含有1個(gè)由約130個(gè)氨基酸殘基組成的糖基識(shí)別域(Carbohydrate recognition domain，CRD)[4-5]。根據(jù)CRD的一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異可以將C-型凝集素分為蛋白聚糖、Ⅱ型跨膜受體、膠原凝集素、選凝素、白細(xì)胞受體、巨噬細(xì)胞甘露糖受體、單一或原始凝集素7個(gè)家族[6-7]。而且，目前仍有一些新的C-型凝集素成員陸續(xù)報(bào)道。

膠原凝集素(Collectin)是一種可溶性的模式識(shí)別受體，包括甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)、肺表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白(SP)A和D、肝膠原凝集素1(CL-L1)、46 kDa膠原凝集素(CL-46)、膠固素(Conglutinin)等，是脊椎動(dòng)物先天免疫中的重要分子，參與多種病原微生物的識(shí)別與清除以及免疫細(xì)胞的識(shí)別與遷移。膠原凝集素的功能主要由CRD調(diào)節(jié)。CRD可選擇性識(shí)別多種微生物和病毒感染細(xì)胞表面具有末端甘露糖(Man)、甘露糖胺(ManNAc)及巖藻糖(Fuc)等的糖結(jié)構(gòu)，并通過(guò)觸發(fā)各種識(shí)別和清除機(jī)制如激活補(bǔ)體、調(diào)理吞噬及中和病毒等而發(fā)揮膠原凝集素先天免疫的作用[8]。

目前已先后在人 Homo sapien及小鼠的 Mus musculus等多種動(dòng)物中報(bào)道了膠原凝集素基因，并開(kāi)展了膠原凝集素與自身免疫性疾病和抗感染免疫的病理生理等方面的研究[9]。作為構(gòu)成細(xì)胞先天免疫第一道防線(xiàn)，膠原凝集素在斑馬魚(yú)Danio rerio等多種魚(yú)類(lèi)中廣泛存在[10-13]，但對(duì)其功能的研究還不多見(jiàn)。本研究從草魚(yú)肝腎cDNA文庫(kù)中篩選到1個(gè)克隆，經(jīng)測(cè)序和特征分析確定其為草魚(yú)膠原凝素(GenBank Accession No.GQ141696)。原核表達(dá)、親和純化獲得了草魚(yú)膠原凝素包含糖基識(shí)別域的重組蛋白(PCRD)。凝集實(shí)驗(yàn)表明PCRD具有凝集多種細(xì)菌的功能，同時(shí)也初步分析了PCRD凝集細(xì)菌的分子機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)對(duì)了解魚(yú)類(lèi)膠原凝集素的功能具有一定的意義。

1 材料和方法

1.1 材料

草魚(yú)肝腎 cDNA文庫(kù)(載體為 pBluescriptⅡ S K ，宿主菌為大腸桿菌DH5α)由本實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)載體pET32a購(gòu)自Novagen公司。表達(dá)菌BL21(DE3)pLysS購(gòu)自Promega公司。凝集用實(shí)驗(yàn)菌株由南昌大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中心提供。引物合成、測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

限制性?xún)?nèi)切酶 EcoRⅠ、XhoⅠ及連接試劑盒購(gòu)自 TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提純化試劑盒購(gòu)自天根公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自BBI公司；His·Bind Purification Kit購(gòu)自 Novagen 公司。

1.2 草魚(yú)膠原凝素基因的克隆及其分子特征

根據(jù)已報(bào)道的人及鼠C-型凝集素cDNA序列設(shè)計(jì)、合成、標(biāo)記探針序列5'-TGGAACGATGTCCCCT GCTCTGACTCT-3'，用該探針篩選草魚(yú)肝腎全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為YG006-E03的克隆有雜交帶。然后采用 pBluescriptⅡSK載體上的通用引物T3(5'-ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAA-3')和T7(5'-TAA TAC GAC TCA CTA TA-3')，擴(kuò)增該克隆。反應(yīng)體系為：水18.75 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/mL 引物各 0.5 μL，菌液 1.5 μL，Taq 酶 0.25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

測(cè)序后使用ORF finder、SMART等在線(xiàn)軟件進(jìn)行推譯和預(yù)測(cè)，分析其序列的分子特征后，確定其為草魚(yú)膠原凝素。

1.3 膠原凝集素的系統(tǒng)進(jìn)化分析

在GenBank中檢索膠原凝集素，氨基酸序列經(jīng)Clustal W軟件排序比對(duì)分析同源性。遺傳進(jìn)化分析通過(guò)軟件MEGA4用鄰位連法計(jì)算。

1.4 PCRD重組蛋白的原核表達(dá)及純化

根據(jù)草魚(yú)膠原凝集素的序列特征設(shè)計(jì) 1對(duì)引物：5'-CCGGAATTCATG-AGTCCATGCCCAGAGA ACTG-3'和5'-ACGCTCGAGCTA-CCTCTGAGAATT TCACCG-3'，克隆草魚(yú)膠原凝集素CRD cDNA序列。將目的片段連接至載體pET-32a，測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。

將BL21(DE3)菌接入20 mL含終濃度50 μg/mL Amp的 LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，接種于200 mL含Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h。

SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)蛋白質(zhì)表達(dá)效果：12 000 r/min離心10 min，收集200 mL重組菌，以12 mL bindingbuffer重懸，超聲破碎。12 000 r/min離心30 min，收集上清液。

按His-Bind Kit操作手冊(cè)純化帶(His)6標(biāo)簽的目的蛋白。洗脫的蛋白質(zhì)溶液再經(jīng)透析純化獲得PCRD。

1.5 PCRD凝集實(shí)驗(yàn)

于96孔板中加入20 μL濃度為0.670 mg/mL的PCRD，每孔中加入大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌(菌懸液光密度值OD600分別為：0.015、0.044、0.015、0.024、0.032、0.021)各 20 μL。搖勻后放置 1 h，以不加重組蛋白而加生理鹽水作為對(duì)照，鏡檢結(jié)果。將含有1 mmol/L CaCl2的PCRD作為對(duì)照。

1.6 糖抑制實(shí)驗(yàn)

分別在嗜水氣單胞菌懸液中加20 μL 80 mmol/L的實(shí)驗(yàn)用糖液(生理鹽水配制)：半乳糖、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖。金黃色葡萄球菌懸液中加肽聚糖、甘露糖、麥芽糖做糖抑制實(shí)驗(yàn)(方法同1.5)。放置1 h，鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 草魚(yú)膠原凝集素基因的克隆及分子特征

在草魚(yú)肝腎 cDNA文庫(kù)中篩選得到一個(gè)編號(hào)為YG006-E03的克隆，其核苷酸序列為1128 bp(圖1)。經(jīng)測(cè)序和生物信息學(xué)分析，鑒定為草魚(yú)膠原凝集素全長(zhǎng) cDNA(圖2)。

圖1 草魚(yú)膠原凝集素基因的克隆Fig.1 Cloning of grass carp collectin gene by PCR.M: DNA marker DL2000; 1: PCR products of rass carp collectin gene.

圖2 草魚(yú)膠原凝集素全長(zhǎng)cDNA及其推導(dǎo)的氨基酸Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of grass carp collectin.EPN motif was denoted by shadows.The transmembrane domain was denoted by underline.The carbohydrate recognition domain(CRD)was denoted by real line frames.

測(cè)序結(jié)果表明，草魚(yú)膠原凝集素基因全長(zhǎng)1128 bp，其中含有5′端非翻譯區(qū)229 bp，3′端非翻譯區(qū)104 bp(末端具18 bp的Poly(A)尾巴)，1085 bp處為加尾信號(hào)(AATAAA)。開(kāi)放閱讀框(ORF)位于230～1025 bp處，編碼1個(gè)由264個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(圖2)。其中，46～68 aa為跨膜區(qū)，125～256 aa為糖基識(shí)別域(CRD)。

2.2 膠原凝集素的系統(tǒng)進(jìn)化分析

從圖3可以看出，膠原凝集素進(jìn)化過(guò)程中，斑馬魚(yú)、草魚(yú)、石斑魚(yú)、青 鳉 進(jìn)化關(guān)系較近，雞、鼠、人、牛處于一支，家蠶和淡水鰲蝦處于一分支。

2.3 PCRD的純化

目的多肽與預(yù)期大小一致。采用 Ni-NTA樹(shù)脂親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物，得到純化的融合蛋白PCRD(圖4)。產(chǎn)物透析濃縮后于?70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖3 膠原凝集素的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of collectins.Note: Danio rerios, Ctenopharyngodon idella, Epinephelus coioides, Oryzias latipes,Xenopus laevis, Manduca sexta, Lutzomyia longipalpis, Bombyx mori, Pacifastacus leniusculus, Gallus gallus, Mus musculus, Homo sapiens, Bos taurus represent the collectin gene of zebra fish(CAK04178.1), grass carp(GQ141696), Orange-spotted grouper(ACO06101.1), medaka(BAD93253.1), Africa Xenopus laevis(NP_001086907.1), tobacco hornworm(AAV41236.1), Sand flies(ABA39526.1), silkworm(NP_001091747.1), crayfish(AAX55747.1), chicken(NP_989680.1), mouse(NP_034906.1), human(P11226.2), bull(O02659.1), respectively.Sequence accession No.is showed in brackets of the figure.

圖4 PCRD的原核表達(dá)及純化Fig.4 Prokaryotic expression and purification of PCRD.Protein was isolated by 12% SDS-PAGE.M: mid-range protein molecular weight marker; 1: non-induced; 2: induced; 3:purified protein.

2.4 PCRD的凝集功能

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，草魚(yú)PCRD對(duì)6種細(xì)菌都有不同程度的凝集作用(表 1)，Ca2+不影響凝集。為了解草魚(yú)PCRD與細(xì)菌結(jié)合的分子機(jī)理，選用了革蘭氏陰性菌的嗜水氣單胞菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的金黃色葡萄球菌進(jìn)行糖抑制實(shí)驗(yàn)(表2)。

加入半乳糖、葡萄糖、甘露糖和麥芽糖4種糖后，PCRD與嗜水氣單胞菌的凝集明顯下降，尤其是甘露糖和麥芽糖會(huì)極大地干擾凝集。加入麥芽糖，PCRD與金黃色葡萄球菌的凝集明顯下降，而肽聚糖和甘露糖會(huì)使凝集受到抑制。

3 討論

CRD中的EPN基序是C-型凝集素分類(lèi)的重要標(biāo)志。一般來(lái)說(shuō)，EPN基序僅在膠原凝集素和選凝素中存在[8]。但選凝素是 C型凝集素中唯一一個(gè)CRD位于N端的成員，它介導(dǎo)細(xì)胞之間相互識(shí)別與黏附。因此，無(wú)論是在結(jié)構(gòu)上還是在功能上，膠原凝集素和選凝素都有較大的不同。另一方面，本研究克隆的草魚(yú)膠原凝集素(GQ141696)與斑馬魚(yú)的親緣關(guān)系最近(圖3)， 并與石斑魚(yú)、青 鳉 等膠原凝集素的序列長(zhǎng)度很相近，都有EPN基序和1個(gè)明顯的跨膜區(qū)。基于以上證據(jù)，推測(cè)GQ141696屬于C-型凝集素基因家族的膠原凝集素基因。

表1 PCRD對(duì)細(xì)菌和酵母的凝集作用Table 1 Agglutination of bacteria by PCRD

表2 PCRD對(duì)嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌的糖抑制凝集作用Table 2 Agglutination inhibition of sugars for Aeromonas hydrophila and Staphylococcus aureus by PCRD

細(xì)菌性疾病給草魚(yú)養(yǎng)殖帶來(lái)相當(dāng)大的危害。其中，嗜水氣單胞菌為革蘭氏陰性菌，能引起草魚(yú)的細(xì)菌性敗血癥、潰爛病等。金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，也會(huì)引起一些細(xì)菌性疾病癥狀。魚(yú)類(lèi)的免疫系統(tǒng)不像高等動(dòng)物那樣完善，膠原凝集素等非特異性免疫因子在防御病原微生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果初步證實(shí)：體外表達(dá)的PCRD不但能較為顯著地凝集嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌，此外，還能凝集大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌、枯草芽孢桿菌等多種細(xì)菌(表 1)。這表明草魚(yú)膠原凝集素能識(shí)別和結(jié)合多種不同的異種細(xì)胞，因此，它是一種非特異性、廣譜性的凝集因子。

草魚(yú)膠原凝集素的廣譜性凝集可能與其具有多價(jià)性的糖結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)，這些位點(diǎn)在識(shí)別和結(jié)合外源微生物的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜內(nèi)復(fù)雜的糖分子過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[14]。其中，EPN 3個(gè)氨基酸殘基的性質(zhì)可能是 CRD-配體結(jié)合特異性的主要決定因素[15]。為驗(yàn)證糖類(lèi)與凝集反應(yīng)的關(guān)系，本研究選擇了半乳糖、葡萄糖、肽聚糖、甘露糖、麥芽糖分別與嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌混合。從糖抑制效果來(lái)看，各種糖有很大的不同。其中，甘露糖對(duì)兩種菌的凝集都有干擾作用(表 2)。這種與甘露糖的特異性結(jié)合在人及小鼠等膠原凝集素中也廣泛存在[16]。奇怪的是，與甘露糖不同，麥芽糖雖然干擾了PCRD凝集嗜水氣單胞菌，但只是降低了金黃色葡萄球菌的凝集。同樣，半乳糖、葡萄糖降低了嗜水氣單胞菌的凝集，而肽聚糖則使PCRD失去對(duì)金黃色葡萄球菌的凝集。因此，膠原凝集素凝集細(xì)菌的分子機(jī)理可能十分復(fù)雜。一方面，可以理解的是膠原凝集素對(duì)不同糖分子的親和性有較大的差異，而另一方面，是什么原因造成了膠原凝集素對(duì)同一種糖類(lèi)分布在不同細(xì)胞上的凝集反應(yīng)的差異？是否膠原凝集素凝集反應(yīng)還需要其他的一些因子，特別是一些離子的參與？

雖然屬于C型凝集素家族成員，但草魚(yú)膠原凝集素發(fā)揮功能時(shí)并不需要 Ca2+的參與(表 1)。這可能與它不含鈣離子依賴(lài)性特征基序“QPD”、“KPS”和“LDN”有關(guān)。有趣的是，這種不依賴(lài) Ca2+的膠原凝集素同樣存在于其他魚(yú)和低等動(dòng)物中。例如，柳葉魚(yú)Osmerus lanceolatus的膠原凝集素有不依賴(lài)Ca2+的 β-半乳糖結(jié)合活性[17]；印度對(duì)蝦 Penaeus indicus和圣保羅對(duì)蝦Penaeus paulensis膠原凝集素也不需要二價(jià)離子(Ca2+和Mg2+)激活[18]。

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Cloning and functional analysis of the collectin gene from the grass carp Ctenopharyngodon idella

Qin Li, Meisheng Ma, and Chengyu Hu
Department of Bioscience, Nanchang University, Nanchang 330031, China

Received:July 18, 2009;Accepted:October 22, 2009

Supported by:Key Scientific and Technological Project of Jiangxi Province(No.20061B0260301), Educational Commission of Jiangxi Province(No.GJJ09057), Innovation Project in Graduate Education of Jiangxi Province(No.YC08A018).

Corresponding author:Chengyu Hu.Tel: +86-791-8785566; E-mail: hucy2008@21cn.com江西省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.20061B0260301)，江西省教育廳項(xiàng)目(No.GJJ09057)，江西省研究生創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(No.YC08A018)資助。