劉元方, 劉佳蕙, 王海芳

(1.上海大學(xué)納米化學(xué)與生物學(xué)研究所,上海 200444;2.北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,北京 100871)

未修飾碳納米管的細(xì)胞毒性機(jī)理及其影響因素

劉元方1,2, 劉佳蕙1,2, 王海芳1

(1.上海大學(xué)納米化學(xué)與生物學(xué)研究所,上海 200444;2.北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,北京 100871)

隨著碳納米管(carbon nanotubes,CNTs)制備技術(shù)的成熟和潛在應(yīng)用的開發(fā),CNTs的毒性也逐漸引起人們的重視.就未修飾 CNTs而言,目前已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道了它們的細(xì)胞毒性的效果、機(jī)理、影響因素等.一種觀點(diǎn)認(rèn)為,CNTs通過影響細(xì)胞粘附、細(xì)胞周期或引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的提高等手段,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡,存活率下降.但也有一些研究發(fā)現(xiàn),CNTs具有較高的生物安全性,沒有顯著的細(xì)胞毒性.存在對(duì)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要原因是影響CNTs細(xì)胞毒性的因素很多.CNTs雜質(zhì)的種類和含量、純化方法不同,細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的不同甚至生物終點(diǎn)檢測(cè)方法的不同,都會(huì)影響對(duì) CNTs細(xì)胞毒性的判斷.CNTs本身的性質(zhì),包括長(zhǎng)度 /直徑、分散性等也都影響著 CNTs的細(xì)胞毒性.為了更準(zhǔn)確地評(píng)估 CNTs的細(xì)胞毒性,建立標(biāo)準(zhǔn)樣品,統(tǒng)一檢測(cè)方法勢(shì)在必行,即建立 CNTs標(biāo)準(zhǔn)品和暴露劑量標(biāo)準(zhǔn),發(fā)展適合 CNTs的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法.歸納總結(jié)了以上各方面的研究成果,對(duì)今后的相關(guān)研究提出看法和建議.

碳納米管;細(xì)胞毒性;氧化應(yīng)激

Abstract:With the development of production and application of carbon nanotubes(CNTs),the toxicity of CNTs has attracted much research attention.Cytotoxicity of p ristine CNTs and its mechanism and influencing factors have been widely reported.CNTs are reported to induce cell apoptosis/necrosis and reduce cell viability by influencing cell adhesion,cell cycle p rogressor oxidative stress.On the contrary,some researchers report that CNTs have little effectson cells.The conflicting results come from the fact thatmany chemical and physical p roperties affect cytotoxicity of CNTs,including the impuritiesof CNTs,the purification method,the size of CNTs,aggregation/dispersion of CNTs,cell culture condition,and even analysismethods.It is essential to establish standard reference samp les and detection methods for accurate assessment of the CNTs cytotoxicity.This review summarizes the research achievements on the cytotoxicity of pristine CNTs,and gives the perspective of the future research.

Key words:carbon nanotubes(CNTs);cellular toxicity;oxidative stress

1991年,Iijima在高分辨透射電子顯微鏡下意外觀察到碳納米管 (carbon nanotubes,CNTs)之后,CNTs便成為了最受重視的納米材料之一.CNTs具有典型的層狀中空結(jié)構(gòu)特征,管身由六邊形碳環(huán)微結(jié)構(gòu)單元組成,是一種徑向尺寸為納米量級(jí)、軸向尺寸為微米量級(jí)的一維量子材料.根據(jù)管壁層數(shù)的差別,CNTs一般分為單壁 CNTs(single-walled CNTs,SWNTs)和 多壁 CNTs(multi-walled CNTs,MWNTs)[1-2].MWNTs在開始形成的時(shí)候,層與層之間保持固定的距離,約為 0.34 nm,直徑一般大于2 nm,層與層之間很容易成為陷阱中心而捕獲各種缺陷,因而管壁上通常布滿小洞樣的缺陷.與MWNTs相比,SWNTs是由單層圓柱型石墨層構(gòu)成,其直徑大小的分布范圍小,缺陷少,具有更高的均勻一致性.由于 CNTs獨(dú)特的結(jié)構(gòu),其研究具有重大的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值,如 CNTs具有高拉伸強(qiáng)度、低密度、獨(dú)特的電學(xué)性質(zhì),以及良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性等多種特性,在電子器件、復(fù)合材料等眾多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景.在生物學(xué)領(lǐng)域,CNTs作為一種高級(jí)生物傳感器材料已被實(shí)際應(yīng)用,如抗原識(shí)別、酶催化反應(yīng)和 DNA雜交等;CNTs擁有獨(dú)特的一維納米結(jié)構(gòu),是多種藥物理想的納米載體[3-6];CNTs的復(fù)合材料可以作為人造骨骼植入體內(nèi),為新生肌肉提供骨架和載體[7-8],并能誘導(dǎo)骨骼細(xì)胞的定向分化[9-10];CNTs還可以作為神經(jīng)生長(zhǎng)的基質(zhì)[8]、多功能生物傳輸器和近紅外射線選擇性殺傷癌細(xì)胞的媒介[11]等.

隨著制備技術(shù)的成熟和應(yīng)用潛力的開發(fā),CNTs的產(chǎn)量正逐年增長(zhǎng),人們直接或間接地接觸 CNTs的機(jī)會(huì)也隨之增加,隨之而來的 CNTs生物安全性也逐漸引起廣泛的重視[12-13].相關(guān)毒性研究已經(jīng)在分子、細(xì)胞、組織到整體動(dòng)物多個(gè)層次上展開,獲得了相當(dāng)多的數(shù)據(jù).特別是細(xì)胞水平的工作,由于模型簡(jiǎn)單,適合機(jī)理性的研究,受到了大家的關(guān)注.已有大量的文獻(xiàn)就 CNTs細(xì)胞毒性的效果、機(jī)理和影響因素進(jìn)行了報(bào)道.但是,至今對(duì)于 CNTs是否具有細(xì)胞毒性仍存在爭(zhēng)議[13-14].一部分研究者認(rèn)為 CNTs具有毒性,并給出了各種毒性產(chǎn)生的機(jī)理;另一部分研究者發(fā)現(xiàn) CNTs沒有細(xì)胞毒性.但可以肯定的是,之所以有這樣矛盾的結(jié)果,是因?yàn)橛兄T多的外在和內(nèi)在的因素影響了對(duì) CNTs細(xì)胞毒性的判斷.本文將總結(jié)歸納 CNTs的細(xì)胞生物效應(yīng)研究結(jié)果,探討影響其生物效應(yīng)的各種因素,在此基礎(chǔ)上對(duì)未來CNTs細(xì)胞毒性研究提出看法和建議.

1 未修飾碳納米管

未修飾碳納米管 (pristine CNTs)在理論上是指單純、完整的碳納米管結(jié)構(gòu),在本文中特指經(jīng)過純化但沒有被化學(xué)修飾的 CNTs.研究未修飾 CNTs的細(xì)胞毒性有著廣泛的意義.

首先,隨著研發(fā)的進(jìn)步,CNTs的應(yīng)用范圍越來越廣,產(chǎn)量也隨之逐年增長(zhǎng).CNTs已由實(shí)驗(yàn)室走進(jìn)人們的生活和環(huán)境,未修飾 CNTs已經(jīng)作為商品流通于市,人們不可避免地會(huì)接觸到 CNTs.因而,研究CNTs細(xì)胞毒性,對(duì)了解其對(duì)人類健康和安全的影響提供了重要數(shù)據(jù).

其次,雖然 CNTs的各種生物學(xué)應(yīng)用,包括生物傳感器、藥物載體等,往往要求 CNTs經(jīng)過各種修飾,具備良好的水溶性、生物相容性和特定的生物學(xué)功能,但是,這些 CNTs衍生物在各種環(huán)境和條件下,可能發(fā)生去修飾作用,重新成為未修飾 CNTs.因此,研究未修飾 CNTs的生物效應(yīng)對(duì) CNTs安全應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域至關(guān)重要.

最后,人們對(duì)未修飾 CNTs的各種物理性質(zhì)的控制也越來越精細(xì).對(duì)不同性質(zhì)未修飾 CNTs的細(xì)胞毒性的比較和研究,有利于闡明 CNTs細(xì)胞毒性的影響因素和機(jī)理.

2 碳納米管對(duì)細(xì)胞活性和功能的影響

CNTs對(duì)細(xì)胞的活性和功能可能會(huì)產(chǎn)生重要的影響.從 2003年 Shvedova等[15]首次報(bào)道了 SWNTs能使人表皮角化細(xì)胞活性降低以來,已有大量的文獻(xiàn)采用多種細(xì)胞系、多樣的檢測(cè)手段,研究了 CNTs的毒性.作為一種碳納米材料,CNTs相對(duì)于納米氧化鐵、納米氧化鋅、半導(dǎo)體量子點(diǎn)等納米材料,具有相對(duì)較小的毒性和較高的生物相容性[16-17].但是,仍有眾多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,在一定條件下,CNTs對(duì)細(xì)胞的存活率和功能有影響,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡.如圖1所示的研究結(jié)果,CNTs能夠降低細(xì)胞的粘附能力,提高細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平,阻礙細(xì)胞周期.通過這些過程,細(xì)胞可能會(huì)進(jìn)一步通過凋亡/壞死的途徑走向死亡.在某些情況下,細(xì)胞本身并未死亡,但增殖受到了抑制,并在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為總細(xì)胞活力的降低.

2.1 CNTs對(duì)細(xì)胞粘附的影響

細(xì)胞主要通過細(xì)胞粘附分子 (cell adhesion molecule,CAM)介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)間的相互接觸和結(jié)合.細(xì)胞正常粘附具有重要的生物學(xué)意義:①細(xì)胞的粘附影響細(xì)胞的存活與生長(zhǎng).正常真核細(xì)胞,除成熟血細(xì)胞外,大多需粘附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能避免凋亡而存活,稱為定著依賴性 (anchorage dependence).例如,上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞一旦脫離了細(xì)胞外基質(zhì)就會(huì)發(fā)生凋亡.②細(xì)胞粘附?jīng)Q定細(xì)胞的形狀.體外實(shí)驗(yàn)證明,各種細(xì)胞脫離了細(xì)胞外基質(zhì)呈單個(gè)游離狀態(tài)時(shí)多呈球形.③細(xì)胞通過與特定的細(xì)胞外基質(zhì)成分作用而發(fā)生分化.例如,成肌細(xì)胞在纖粘連蛋白上增殖并保持未分化的表型,而在層粘連蛋白上則停止增殖,進(jìn)行分化,融合為肌管.④參與細(xì)胞的遷移.細(xì)胞的遷移依賴于細(xì)胞的粘附與細(xì)胞骨架的組裝,粘著斑是聯(lián)系細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞骨架的“鉚釘”.

2005年,Cui等[18]發(fā)現(xiàn)用 SWNTs處理人胚胎腎細(xì)胞 HEK293后,細(xì)胞的活性減低.他們認(rèn)為這與經(jīng)過孵育后,細(xì)胞粘附能力明顯降低有關(guān).他們還發(fā)現(xiàn),經(jīng)過 SWNTs處理后,與細(xì)胞粘附相關(guān)的細(xì)胞因子層粘蛋白、纖連蛋白、粘著斑激酶 (focal adhesion kinase,FAK)、鈣粘蛋白和膠原蛋白等的表達(dá)都顯著降低.

2006年,Tian等[19]也發(fā)現(xiàn)人真皮纖維細(xì)胞與SWNTs接觸后細(xì)胞活力顯著降低.他們推測(cè) SWNTs產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機(jī)制是:正常細(xì)胞通過鈣粘分子等細(xì)胞粘附分子介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互接觸和結(jié)合,通過細(xì)胞骨架支持細(xì)胞完整的結(jié)構(gòu);而 SWNTs能夠干擾細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)組成,使細(xì)胞粘附相關(guān)分子的表達(dá)改變;進(jìn)而細(xì)胞骨架斷裂,細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞粘附能力發(fā)生改變,最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡或壞死 (見圖2).

圖1 CNTs對(duì)細(xì)胞的活性和功能的影響Fig.1 Effects of CNTs on the viability and function of cells

圖2 CNTs通過影響細(xì)胞的粘附能力產(chǎn)生毒性[19]Fig.2 CNTs induce cytotoxicity by changing the adhesion ability of cells[19]

W?rle-Knirsch等[20]通過免疫染色,在熒光顯微鏡下觀察到 FAK和肌動(dòng)蛋白在 SWNTs周圍的聚集.FAK是整合蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要成員,有酪氨酸蛋白激酶活性,并可自身磷酸化;FAK可抑制細(xì)胞凋亡,與細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在串話 (crosstalk),直接參與細(xì)胞多種功能的調(diào)節(jié).在他們的實(shí)驗(yàn)條件下,A549細(xì)胞團(tuán)繞 SWNTs生長(zhǎng),并將 SWNTs包裹起來,形成聚集體,并從培養(yǎng)皿底脫離開來.2008年,Zhang等[21]也研究了 CNTs對(duì) FAK蛋白表達(dá)的影響.他們發(fā)現(xiàn):在 SWNTs培養(yǎng)的細(xì)胞中,點(diǎn)狀和線狀的 FAK都分布在細(xì)胞的邊緣;而在MWNTs培養(yǎng)的細(xì)胞中,只有點(diǎn)狀的 FAK存在,并且均勻分布在細(xì)胞內(nèi).因此,CNTs的引入會(huì)影響細(xì)胞中 FAK的分布,并且不同種類的 CNTs對(duì) FAK表達(dá)的影響也不同.Walker等[22]也觀察到,被 SWNTs或MWNTs孵育后,細(xì)胞骨架崩解,鈣粘蛋白減少.

與干擾細(xì)胞粘附能力的報(bào)道相反,關(guān)于細(xì)胞能夠在 CNTs復(fù)合材料的縫隙中粘附、生長(zhǎng)、增殖、分化的報(bào)道也有很多[7,9,23-26].2009年,Tutak等[27]細(xì)致研究了 SWNTs薄膜對(duì)成骨細(xì)胞的影響.首先將SWNTs沉積到聚纖維素酯膜上,并在該基底上培養(yǎng)大鼠成骨干細(xì)胞.結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)胞與 SWNTs接觸24 h后,能夠吞噬少量的疏松 SWNTs,并引起急性的細(xì)胞毒性,誘發(fā)細(xì)胞死亡.然而,繼續(xù)培養(yǎng)該細(xì)胞卻發(fā)現(xiàn),殘余的細(xì)胞仍具有旺盛的增殖能力.在后續(xù)培養(yǎng)的 23 d時(shí)間內(nèi),細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增加,總蛋白含量遠(yuǎn)高于在聚苯乙烯基底上生長(zhǎng)的對(duì)照組細(xì)胞.他們認(rèn)為,SWNTs接觸的急性毒性引起少量的細(xì)胞死亡,促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)源性細(xì)胞毒性因子的表達(dá),刺激了細(xì)胞的生長(zhǎng).

經(jīng)過 CNTs的孵育,細(xì)胞中粘附相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞的粘附能力往往會(huì)發(fā)生變化,但這些變化是否導(dǎo)致 CNTs產(chǎn)生細(xì)胞毒性以及機(jī)制如何,在目前零散的數(shù)據(jù)中,還不能有確定的結(jié)論.CNTs對(duì)粘附相關(guān)蛋白的表達(dá)水平、粘附相關(guān)蛋白的信號(hào)通路以及細(xì)胞粘附的動(dòng)力學(xué)的影響,包括這些因素對(duì)細(xì)胞遷移、存活的影響都有待細(xì)致地研究.

2.2 CNTs對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2007年,De Nicola等[28]研究了用不同方法制備的、雜質(zhì)含量有差異的多種MWNTs對(duì) U937細(xì)胞的活力及增殖的影響.他們用直接計(jì)數(shù)法來判斷細(xì)胞的增殖,用臺(tái)酚蘭拒染實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞死亡率,用Hoechst 33342/PI雙染法判斷細(xì)胞凋亡.結(jié)果發(fā)現(xiàn),在與 25μg/mL的 CNTs孵育 48 h后,細(xì)胞的個(gè)數(shù)相對(duì)于對(duì)照組顯著減少,即增殖被抑制,但沒有明顯的壞死或凋亡.根據(jù)他們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),在 CNTs環(huán)境下孵育后,細(xì)胞增殖能力的改變是一個(gè)相對(duì)于細(xì)胞死亡的早期事件.

2007年,Herzog等[29]利用克隆形成法(clonogenic assay),在三種細(xì)胞系 (A549,HaCaT和BEAS-2B)中都觀測(cè)到了 CNTs對(duì)細(xì)胞增殖的影響.Casey等[30]報(bào)道的結(jié)果與此一致.

CNTs對(duì)細(xì)胞增殖的影響可以體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞周期的影響上.細(xì)胞周期是指能持續(xù)分裂的真核細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束后生長(zhǎng),再到下一次分裂結(jié)束的循環(huán)過程,即細(xì)胞增殖一次的過程.細(xì)胞周期的長(zhǎng)短反映了細(xì)胞所處狀態(tài).

研究發(fā)現(xiàn),CNTs能夠通過延滯細(xì)胞周期影響細(xì)胞的增殖.2005年,Cui等[18]用 SWNTs處理HEK293細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被阻滯在 G1期,無法正常分裂,進(jìn)而引發(fā)凋亡.相應(yīng)地,與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白激酶(CDK)和周期蛋白 (cyclin)有相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào).

2005年,Ding等[31]利用 BrdU標(biāo)記 DNA,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被阻滯在 G2/M期.但是,當(dāng)細(xì)胞暴露于低劑量的 CNTs時(shí),細(xì)胞內(nèi)與蛋白合成、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因表達(dá)降低,促 G1-S期轉(zhuǎn)換的基因表達(dá)也降低,細(xì)胞將被滯在 G1期.

2009年,Sargent等[32]報(bào)道 SWNTs能夠參入到有絲分裂紡錘體中,促使紡錘體分解,誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多倍體.

2.3 CNTs提高細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平

氧化應(yīng)激指機(jī)體在遭受刺激時(shí),體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基 (reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基 (reactive nitrogen species,RNS)產(chǎn)生過多,氧化程度超出細(xì)胞清除氧化物的能力,于是氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡,導(dǎo)致細(xì)胞損傷.它通常被認(rèn)為是納米顆粒導(dǎo)致細(xì)胞毒性的重要途徑[33].ROS是血管細(xì)胞增長(zhǎng)的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào),與血管狀態(tài) (如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化)有關(guān),在肺纖維化、癲癇、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、帕金森等疾病中均扮演重要角色.因而,在很多的 CNTs毒性試驗(yàn)中,人們很自然地對(duì)CNTs引起細(xì)胞氧化應(yīng)激水平進(jìn)行了測(cè)定.

早在 2003年,Shvedova等[15]發(fā)現(xiàn),在暴露于CNTs后,細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高,細(xì)胞抗氧化能力降低,細(xì)胞內(nèi)低分子量含巰基蛋白減少.CNTs引發(fā)的細(xì)胞內(nèi) ROS的提升,能夠進(jìn)一步引起細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子核因子 -κB(nuclear factor-κB,NF-κB)表達(dá)的提高,并最終引起細(xì)胞死亡[34].不過,在他們的實(shí)驗(yàn)中,所使用的 CNTs純度很低,鐵含量高達(dá) 30%,而鐵是已知的能強(qiáng)烈引起 ROS的物質(zhì).因而,他們推測(cè)氧化應(yīng)激主要來源于生產(chǎn) CNTs時(shí)引入的金屬催化劑.

2006年,Fenoglio等[35]利用純化后的 MWNTs,探討 CNTs與自由基的關(guān)系.他們通過NaOH和 SDS等的處理,將 MWNTs中的金屬含量控制在 1%以下.結(jié)果發(fā)現(xiàn),CNTs不僅沒有引發(fā)自由基的產(chǎn)生,反而有很強(qiáng)的捕獲自由基的能力.這佐證了細(xì)胞中自由基來源于金屬雜質(zhì)的說法.

Kagan等[36]探討了純化前 (w(Fe)=26%)和純化后 (w(Fe)=0.23%)的 SWNTs對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生自由基的影響.在他們的實(shí)驗(yàn)條件下,二者都沒有直接引起 RAW264.7細(xì)胞內(nèi)自由基含量的升高.但是,對(duì)于已經(jīng)被酵母聚糖 (zymosan)或十四烷酸乙酸佛波酯 (phorbol myristate acetate,PMA)刺激激活的 RAW264.7細(xì)胞,純化前和純化后的 SWNTs都能引起細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽 (GSH)含量的降低,以及脂過氧化的提高.含有雜質(zhì)較多的 SWNTs較純化后的 SWNTs能更顯著地改變兩個(gè)氧化應(yīng)激指標(biāo).他們還研究了這兩種碳管對(duì)鼠上皮細(xì)胞 (JB6 P+)的影響[37].結(jié)果發(fā)現(xiàn),在未純化的 SWNTs孵育過的細(xì)胞中檢測(cè)到了自由基信號(hào)和轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1(activating protein-1,AP-1)表達(dá)量升高,而純化后的SWNTs孵育的細(xì)胞中則沒有.不過,在兩種碳管孵育過的細(xì)胞內(nèi),另一種通常在氧化應(yīng)激中被激活的NF-κB表達(dá)量的提高程度卻非常相似.

2007年,Pulskamp等[38]探討了金屬雜質(zhì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生 ROS的影響.通過比較含催化劑少、純度高的酸處理過的 SWNTs與直接商業(yè)生產(chǎn)出的金屬含量較高的 SWNTs的細(xì)胞毒性,他們發(fā)現(xiàn),在 100μg/mL的濃度下,經(jīng)酸處理過且金屬含量較少的 SWNTs沒有引起細(xì)胞內(nèi) ROS的顯著提高,其他金屬量較多的CNTs都引起了 ROS的提高.

Pulskamp等[39]還發(fā)現(xiàn),修飾前的 CNTs樣品中通常混雜的金屬雜質(zhì)和不定形碳,都可能引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增高,但是,兩種雜質(zhì)可能通過刺激不同的途徑引起氧化應(yīng)激.他們發(fā)現(xiàn),不定形碳雜質(zhì)能夠在短短的 10 min內(nèi)迅速引起細(xì)胞內(nèi)自由基含量的升高,而金屬雜質(zhì)只有經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的接觸(如 24 h),才能引起細(xì)胞內(nèi)自由基含量的提高.

研究還發(fā)現(xiàn),雖然除掉雜質(zhì)能夠減弱 CNTs引起的氧化應(yīng)激,但是并不能完全消除.也就是說,碳管本身可能也具有導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激的能力.2009年,Choi等[40]在測(cè)定 SWNTs引起細(xì)胞內(nèi) ROS提高的實(shí)驗(yàn)中,使用了更高的濃度 (500μg/mL)和更久的孵育時(shí)間(72 h),結(jié)果得到的 ROS響應(yīng)非常明顯.更有意思的是,盡管以往的實(shí)驗(yàn)中都推測(cè),CNTs中含有的 Fe雜質(zhì)對(duì) CNTs產(chǎn)生氧化應(yīng)激起著關(guān)鍵的作用,但是在該實(shí)驗(yàn)中,SWNTs孵育過的細(xì)胞內(nèi)ROS水平高于同等濃度氧化鐵納米粒子孵育過的細(xì)胞 (見圖3).圖中:LMH(layered metal hydroxide)是一種復(fù)合納米材料 (Mg0.68Al0.32(OH)2(CO3)0.16·0.1H2O,尺寸為 200 nm);氧化鐵和硅的尺寸分別為20～30 nm和約 14 nm;SWNTs直徑為1.2～1.5 nm,最大長(zhǎng)度為 2.5μm.

圖3 CNTs孵育 A549細(xì)胞 72 h后 ROS的升高[40]Fig.3 CNTs induce the ROS generation in A549 cells after 72 h incubation[40]

Herzog等[41]的研究也認(rèn)為,減少 CNTs外的金屬含量,能夠顯著降低碳管在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧的能力.但是,純化的 CNTs仍然具有一定的引起細(xì)胞內(nèi)活性氧增高的能力,并且該能力與 CNTs在體系中的分散密切相關(guān).也就是說,不僅是金屬催化劑,碳管的表面性質(zhì)也是引發(fā)細(xì)胞內(nèi) ROS提升的原因.

2.4 CNTs促使細(xì)胞凋亡

凋亡,又稱程序化細(xì)胞死亡,是細(xì)胞主動(dòng)實(shí)施的一種死亡形式和機(jī)制.細(xì)胞粘附能力的降低,細(xì)胞增殖受阻,細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的提高,都可能引起細(xì)胞通過凋亡走向死亡.

2005年 ,Cui等[18]用 SWNTs處理 HEK293細(xì)胞,并利用形態(tài)學(xué)觀察、DNA Ladder和 PI單染等多種方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡.結(jié)果發(fā)現(xiàn),25μg/mL的SWNTs,經(jīng)過 4 d的孵育能夠引發(fā) 43.5%的細(xì)胞發(fā)生凋亡.凋亡發(fā)生的程度與孵育時(shí)間和暴露劑量成正比.他們認(rèn)為,凋亡的發(fā)生是由 CNTs改變細(xì)胞周期相關(guān)因子,以及細(xì)胞粘附相關(guān)因子引起的.

2005年 ,Ding等[31]利用 YO-PRO1/PI雙染的方法觀測(cè) MWNTs導(dǎo)致的細(xì)胞壞死與凋亡.他們發(fā)現(xiàn),MWNTs處理造成細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和壞死,并且具有劑量依賴性.基因芯片分析結(jié)果顯示:經(jīng)過 48 h的暴露,低劑量下 (0.06 mg/mL)MWNTs主要使得細(xì)胞活力降低;高劑量下 (0.6 mg/mL)MWNTs能引起大量的促進(jìn)細(xì)胞凋亡和壞死的基因,如 TNF家族蛋白、BCL2L2、MCL1等表達(dá)量升高.

2006年,Bottini等[42]研究了 CNTs誘導(dǎo) T細(xì)胞凋亡的效果,結(jié)果也顯示高劑量 (400μg/mL)的CNTs能引起嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡 (見圖4).2009年,Choi等[40]、Ravichandran等[43]也分別在兩種肺上皮細(xì)胞A549和 LE中,觀察到了 CNTs引起的細(xì)胞凋亡.

圖4 CNTs引起 Jurkat細(xì)胞凋亡[42]Fig.4 CNTs induce apoptosis of human Jurkat cells[42]

Muller等[44]也報(bào)道了 MWNTs引起上皮細(xì)胞MCF-7的凋亡,他們還同時(shí)發(fā)現(xiàn)MWNTs能夠引起細(xì)胞染色體斷裂和形成細(xì)胞內(nèi)的微核體.他們的結(jié)果在Lindberg等[45]和 Cveticanin等[46]的 DNA雙鏈的斷裂檢測(cè)和微核體的形成實(shí)驗(yàn)中得到了進(jìn)一步證實(shí).

利用相似的實(shí)驗(yàn)手段,一些文獻(xiàn)也報(bào)道了 CNTs不能引發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡.De Nicola等[28]就認(rèn)為CNTs僅影響細(xì)胞的增殖,不會(huì)讓細(xì)胞壞死和凋亡.Hirano等[47]報(bào)道 CNTs不能引起凋亡路徑上的Caspase 3和 PARP表達(dá)量提高.Tabet等[48]在研究CNTs對(duì) A 549的細(xì)胞毒性時(shí),用 DNA Ladder方法觀測(cè)細(xì)胞內(nèi) DNA的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞沒有發(fā)生凋亡的趨勢(shì).但要注意的是,在這些工作中使用的 CNTs的濃度都低于 100μg/mL,相對(duì)于那些觀測(cè)到細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)來說劑量偏低,并且作用時(shí)間偏短.要判斷 CNTs是否能引起細(xì)胞發(fā)生凋亡,還要考慮體外實(shí)驗(yàn)的暴露劑量是否遠(yuǎn)高于最大的機(jī)體真實(shí)暴露劑量,而使結(jié)果失去真實(shí)性.總體來說,CNTs是否引起細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死有一定的劑量效應(yīng),低劑量的CNTs常顯示出較高的安全性,而高劑量的 CNTs則有可能引起細(xì)胞凋亡或壞死.

2.5 CNTs對(duì)細(xì)胞的其他影響

除了上述影響外,經(jīng)過 CNTs暴露,細(xì)胞本身所具有的某些特性也有可能發(fā)生改變.2005年,Cui等[18]用 SWNTs處理 HEK293細(xì)胞 ,發(fā)現(xiàn) SWNTs會(huì)逐漸被細(xì)胞分泌出的蛋白包裹,以起到與細(xì)胞分隔的效果,這是細(xì)胞自我保護(hù)的一種手段.經(jīng)過電泳分析,發(fā)現(xiàn)這些蛋白是一組分子量在 20～30 kD的蛋白.Hirano等[47]否認(rèn)MWNTs刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激的能力,他們認(rèn)為 MWNTs表面能夠吸附和結(jié)合細(xì)胞表面的MARCO(macrophage recep tor w ith collagenous structure),促進(jìn)了巨噬細(xì)胞對(duì)MWNTs的吞噬和消化,并相應(yīng)地在巨噬細(xì)胞中體現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性.2005年,Jia等[49]研究了 CNTs對(duì)肺氣泡巨噬細(xì)胞 (alveolar macrophage,AM)的影響.他們發(fā)現(xiàn),當(dāng) SWNTs濃度高于 0.38μg/cm2,MWNTs濃度高于 3.06μg/cm2時(shí),AM的吞噬能力降低.另外,對(duì)于免疫細(xì)胞,CNTs通常能引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng),如IL-8[50],TNF-α[51]分泌的增加等.但是 ,Herzog等[52]報(bào)道 SWNTs能夠抑制 A549細(xì)胞和 NHBE細(xì)胞 IL-8和 TNF-α的表達(dá),尤其在二棕櫚酰磷脂酰膽堿 (肺液中的成分,能夠提高 CNTs的分散性)和 TNF-α的刺激下,SWNTs抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力更加顯著.

3 影響 CNTs細(xì)胞毒性的因素

3.1 外在因素

3.1.1 實(shí)驗(yàn)條件的影響

CNTs的劑量、接觸時(shí)間以及細(xì)胞系的選擇都會(huì)影響 CNTs毒性的大小.上文已經(jīng)提到,CNTs的細(xì)胞毒性存在劑量效應(yīng).通常來講,CNTs在低濃度下有較高的安全性,在較高濃度下毒性較強(qiáng).同時(shí),CNTs的細(xì)胞毒性也存在時(shí)間效應(yīng).在 Cui等[18]的實(shí)驗(yàn)中,相同劑量下,CNTs孵育細(xì)胞的時(shí)間越長(zhǎng),細(xì)胞的存活率越低.然而,在 Tutak等[27]的實(shí)驗(yàn)中,相同劑量下,短時(shí)間的 CNTs孵育后 (24 h內(nèi)),細(xì)胞有較多的死亡,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞增殖能力回復(fù),細(xì)胞數(shù)目不斷增長(zhǎng).在 CNTs的細(xì)胞毒性研究中,劑量和時(shí)間兩個(gè)變量的影響也非線性,可能存在復(fù)雜的機(jī)制.在同一研究中,使用相同的 CNTs、相同的暴露劑量和時(shí)間,選擇的細(xì)胞系不同,得到的毒性數(shù)據(jù)也存在差別[16-17,29,53].因此,劑量、時(shí)間點(diǎn)、細(xì)胞系等實(shí)驗(yàn)條件的選擇,對(duì)于檢測(cè)和評(píng)估 CNTs的細(xì)胞毒性至關(guān)重要.

3.1.2 雜質(zhì)的影響

CNTs制備過程中引入的,經(jīng)純化過程后殘留的金屬雜質(zhì)、碳雜質(zhì),能夠引起細(xì)胞內(nèi) ROS升高,消耗細(xì)胞內(nèi)還原性多肽和蛋白,引起細(xì)胞內(nèi) NF-κB表達(dá)的提高[33,38],增大 CNTs的細(xì)胞毒性[15,54-56].經(jīng)過基本的純化步驟,少量被封裝在碳結(jié)構(gòu)中的金屬,在細(xì)胞培養(yǎng)體系中仍有可能被釋放出來,并對(duì)其毒性產(chǎn)生重要影響[57].目前,CNTs的完全純化仍然是一個(gè)有待突破的課題[58].制備方法、純化步驟的不同,CNTs中雜質(zhì)的組成、比例也存在差異,這使得雜質(zhì)對(duì) CNTs毒性的影響更為復(fù)雜.

3.1.3 純化方法和混酸處理的影響

未修飾 CNTs在制備與直接接觸細(xì)胞之間,還涉及純化步驟.純化過程是一個(gè)化學(xué)過程,往往涉及強(qiáng)酸回流、高溫加熱、超聲等操作.這些操作在除去金屬雜質(zhì)的同時(shí),不可避免地在 CNTs的表面,尤其是缺陷位置引入官能團(tuán).Bottini等[42]比較了純MWNTs和酸處理后的MWNTs對(duì) T淋巴細(xì)胞系 Jurkat細(xì)胞的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn),酸處理后的 MWNTs的細(xì)胞毒性顯著提高.Albini等[59]用硝硫混酸處理 SWNTs,得到的氧化 SWNTs有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性.與之相對(duì)的是 Porter等[55]的實(shí)驗(yàn),他們也利用酸化后的分散性很好的SWNTs來檢驗(yàn) CNTs的毒性,并且利用 Raman技術(shù)確定了所用的 CNTs表面存在大量由于酸化而產(chǎn)生的官能團(tuán).但是,該實(shí)驗(yàn)中使用的 CNTs并沒有顯示出細(xì)胞毒性.這些結(jié)果提示我們,雖然在純化過程中產(chǎn)生的官能團(tuán)是少量和簡(jiǎn)單的,但是,這一部分官能團(tuán)的存在對(duì) CNTs的分散性可能有較大的影響,在生物體系中可能影響其生物效應(yīng).3.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境體系的影響

評(píng)價(jià) CNTs的細(xì)胞毒性,需要考慮到 CNTs與培養(yǎng)基等復(fù)雜液體環(huán)境相混合的過程和影響.CNTs具有大的比表面積,可以吸附環(huán)境體系中的蛋白質(zhì)、芳香類分子.在自身表面性質(zhì)變化的同時(shí),其毒性也受到影響.CNTs還受到生物體系中金屬離子 (緩沖體系)的影響,其分散性能發(fā)生顯著地變化.常用的培養(yǎng)基通常加入血清為細(xì)胞正常生長(zhǎng)提供營養(yǎng),加入酚紅指示培養(yǎng)基的 pH值變化.研究表明,CNTs可以吸附酚紅[60],改變其細(xì)胞毒性.CNTs在無血清體系中的細(xì)胞毒性較有血清體系顯著偏高[61-62],血清能夠包裹 CNTs,降低 CNTs在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生 ROS的能力[41].Casey等[30]研究發(fā)現(xiàn) CNTs之所以會(huì)顯現(xiàn)出細(xì)胞毒性,是因?yàn)檠逯械鞍妆?CNTs所吸附,相當(dāng)于消耗了培養(yǎng)基中的營養(yǎng),使所孵育的細(xì)胞缺乏營養(yǎng)而活力低于空白組,產(chǎn)生假陽性.他們將 CNTs在培養(yǎng)基中孵育一定時(shí)間,過濾培養(yǎng)基獲得不含有CNTs的培養(yǎng)基,用此培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著降低.但 Geys等[63]也做了相似的實(shí)驗(yàn),卻發(fā)現(xiàn)血清的存在與否對(duì) CNTs的毒性沒有產(chǎn)生影響.綜合上述工作,CNTs的吸附性能可能影響其細(xì)胞毒性,但目前對(duì)于培養(yǎng)基中究竟何種組分被 CNTs吸附帶來的影響更為關(guān)鍵,并產(chǎn)生了怎樣的影響還有待于進(jìn)一步細(xì)致、深入地研究.

3.1.5 實(shí)驗(yàn)方法的影響

要檢驗(yàn) CNTs細(xì)胞毒性各個(gè)方面的影響,需要使用多種實(shí)驗(yàn)方法.細(xì)胞毒性一個(gè)方面的變化,可以選擇的檢測(cè)方法也不唯一,而利用不同的方法檢驗(yàn)同一指標(biāo)的變化也有可能存在差異.例如,細(xì)胞存活率檢測(cè)方法包括臺(tái)盼蘭染色直接計(jì)數(shù)法、MTT染色測(cè)紫外吸收法、MTT的改進(jìn)方法WST和 MTS法、間接指示細(xì)胞死亡率的乳酸脫氫酶 (LDH)露出率法、用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率的碘化丙啶 (PI)法以及Bradford測(cè)蛋白濃度法等.這些方法主要是利用各種染料,與細(xì)胞內(nèi)恒定含量的組分結(jié)合,或被與活細(xì)胞數(shù)目相關(guān)的酶催化轉(zhuǎn)化,生成有特定吸光或熒光的物質(zhì),通過檢測(cè)光信號(hào)的變化來檢測(cè)細(xì)胞活力的變化.每種檢測(cè)方法都是從各自的角度來確定細(xì)胞毒性,因此,對(duì)于同樣的 CNTs,不同方法檢測(cè)得到的毒性結(jié)果可能有所不同[64].

CNTs對(duì)染料的吸附也有可能干擾通過使用這些染料得到結(jié)果.研究發(fā)現(xiàn),在MTT方法測(cè)定細(xì)胞活力的實(shí)驗(yàn)中,雖然 CNTs并不干擾甲臜 (MTT被線粒體內(nèi)酶催化氧化生成的產(chǎn)物)在細(xì)胞內(nèi)的形成,但是,吞噬到細(xì)胞中的 CNTs能夠吸附生成的甲臜.而通常所使用的用于溶解甲臜的 DMSO或 SDS的酸溶液無法將吸附在 CNTs上的那部分溶解下來 (見圖5),因而,實(shí)驗(yàn)上觀測(cè)到的吸光度比實(shí)際產(chǎn)生的甲臜完全溶解后的溶液的吸光度低,造成假陽性[20,65-66].

圖5 利用M TT方法檢測(cè) CNTs細(xì)胞毒性時(shí)假陽性產(chǎn)生的機(jī)制[65]Fig.5 Proposed m echan ism for the false positive cytotox icity of CNTs using M TT assay[65]

不使用染料評(píng)價(jià) CNTs細(xì)胞毒性的方法能夠避免染料與 CNTs相互作用帶來的影響.克隆形成法是一種不涉及染料的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法,該方法最初主要用于放射線毒性的檢查 (普通染料可能被輻射破壞),目前也被用于 CNTs的毒性研究中[29-30,67].該方法通過稀釋并得到單分散的細(xì)胞,在培養(yǎng)皿中經(jīng)過 10 d的培養(yǎng),使每個(gè)能正常繁殖的細(xì)胞在原位擴(kuò)增為肉眼可以觀察的集落 (見圖6).圖中,P90為 Printex炭黑,ArcD為電弧法生產(chǎn)的CNTs,Hipco為 Hipco 生產(chǎn)的 CNTs[29].集落數(shù)量的減少表示細(xì)胞存活率的降低,集落的大小則可反映增殖能力的變化.Herzog等[28]的結(jié)果和 W?rle-Knirsch等[20]、Casey等[30]得到的結(jié)果一致,即 CNTs沒有明顯地使細(xì)胞存活率降低.該方法的最大好處就是不受任何染料的影響,缺點(diǎn)是工作量較大,比較費(fèi)時(shí).該方法可以作為標(biāo)準(zhǔn)方法用來參比使用染料方法的準(zhǔn)確性.

綜上,CNTs細(xì)胞毒性的結(jié)論應(yīng)該是建立在綜合多種方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,這樣的結(jié)論也才是可靠的.

圖6 CNTs對(duì) A549細(xì)胞集落形成的影響[29]Fig.6 Effect of CNTs exposure on colony formation of A549 cells[29]

圖7 長(zhǎng)度對(duì) CNTs細(xì)胞毒性的影響[68]Fig.7 Influence of the length on the cytotoxic ity of CNTs[68]

3.2 內(nèi)在因素

3.2.1 長(zhǎng)度的影響

Sato等[51]研究了平均長(zhǎng)度為 220和 825 nm的兩種MWNTs對(duì)人急性白血病細(xì)胞系 HTP-1的細(xì)胞毒性.他們發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)MWNTs引起細(xì)胞內(nèi) TNF-α表達(dá)量升高的幅度比短 MWNTs大.他們推測(cè):短MWNTs更容易被細(xì)胞吞噬和包裹,因而引起的免疫反應(yīng)更小;長(zhǎng) CNTs更容易穿破細(xì)胞,造成細(xì)胞損傷(見圖7)[68].

在 Shi等[69]的研究中,長(zhǎng) SWNTs和短 SWNTs都沒有顯示出明顯的細(xì)胞毒性.在 Simon-Deckers等[65]的實(shí)驗(yàn)中,長(zhǎng)的和短的MWNTs都顯示了較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,但是二者之間沒有顯著性差別.

可以看到,長(zhǎng)度究竟怎樣影響CNTs的細(xì)胞毒性,目前還存在著爭(zhēng)議,值得進(jìn)行更深入研究.

3.2.2 聚集程度的影響

碳納米管的聚集程度會(huì)影響到 CNTs的形態(tài)、表面積等,對(duì)其細(xì)胞毒性影響顯著.Belyanskaya等[53]在研究 SWNTs對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的毒性時(shí)發(fā)現(xiàn),分散性好的 SWNTs對(duì)兩種細(xì)胞均顯現(xiàn)了更強(qiáng)的毒性.他們推測(cè),這是由于分散性好的 CNTs表面積更大,和細(xì)胞的作用更強(qiáng).Raja等[70]通過過濾的方法,將 CNTs中大的聚集體濾掉,發(fā)現(xiàn) CNTs表現(xiàn)出的毒性有所降低,但降低程度不明顯.然而,支持 CNTs的毒性來源于其纖維狀結(jié)構(gòu)的研究者卻發(fā)現(xiàn),分散性差的 CNTs由于具有較高的剛性而顯示出更大的細(xì)胞毒性[71].3.2.3 管壁層數(shù)的影響

盡管沒有能夠得出確切結(jié)論的報(bào)道,SWNTs的細(xì)胞毒性通常大于 MWNTs[21].在 Jia等[49]的研究中,SWNTs在 0.38μg/cm2濃度下就顯現(xiàn)出細(xì)胞毒性,而MWNTs在 3.06μg/cm2才開始引起細(xì)胞活力的損失.SWNTs有較大的比表面積和較強(qiáng)的管間作用力,容易形成納米管束,而MWNTs管壁通常存在更多的缺陷和官能團(tuán).雖然同為 CNTs材料,但二者無論在毒性,還是在毒性產(chǎn)生的機(jī)制上都存在差異.

綜上所述,CNTs的細(xì)胞毒性是一個(gè)多維的課題.要判斷 CNTs的細(xì)胞毒性,搞清楚 CNTs的毒性的機(jī)制,還需要很多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的積累和系統(tǒng)分析.

4 總結(jié)與展望

作為納米材料中的明星成員,碳納米管的細(xì)胞毒性受到人們的關(guān)注.隨著大量相關(guān)工作報(bào)道,我們也從中獲得關(guān)于 CNTs細(xì)胞效應(yīng)的諸多信息.然而,縱覽 CNTs細(xì)胞毒性的研究文獻(xiàn),會(huì)發(fā)現(xiàn)即使用相同的細(xì)胞生物學(xué)研究手段,就某一項(xiàng)指標(biāo)在結(jié)論上卻常常出現(xiàn)大相徑庭的結(jié)果.產(chǎn)生這些矛盾的影響因素很多,這些矛盾也為今后 CNTs細(xì)胞毒性的研究指明方向.

首先,CNTs的多樣性給 CNTs的毒性評(píng)價(jià)帶來困難.CNTs的制備方法、純化手段多種多樣,使得同實(shí)驗(yàn)室不同批次得到的 CNTs在長(zhǎng)度、管徑、純度方面都存在著不同[28].早期用于 CNTs毒性評(píng)價(jià)的CNTs樣品往往金屬雜質(zhì)含量偏高,CNTs的毒性也較高[15].隨著純化和分離手段的進(jìn)步,人們逐漸發(fā)覺 CNTs的純度[28]、長(zhǎng)度[51]、聚集程度[70,72]都會(huì)影響 CNTs的細(xì)胞毒性[73-74].同時(shí),關(guān)于這些因素是否真的會(huì)影響 CNTs的細(xì)胞毒性還存在爭(zhēng)議[66].CNTs的物化參量眾多,在比較 CNTs的細(xì)胞毒性時(shí),這個(gè)多維的體系需要保持單一的變量,所得到的結(jié)果才有意義,但目前還很難做到.而且,即使是使用同一種 CNTs,在同樣實(shí)驗(yàn)條件下,不同的細(xì)胞對(duì) CNTs的反應(yīng)也可能存在差異[29,70,75].這些變量對(duì) CNTs細(xì)胞毒性的影響需要系統(tǒng)研究.要使不同的實(shí)驗(yàn)室所得數(shù)據(jù)具有可比性,最有效的方法就是能夠建立一個(gè)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)品.在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的研究結(jié)果,才會(huì)有更廣泛的應(yīng)用意義.

其次,傳統(tǒng)的細(xì)胞生物學(xué)方法不一定適用于CNTs細(xì)胞毒性研究.CNTs作為一種高比表面積、高吸附能力的外源物質(zhì)被引入細(xì)胞培養(yǎng)體系,并可能被細(xì)胞吞噬.而表征細(xì)胞活性或機(jī)能的參數(shù)很多是通過特定分子發(fā)出的吸光或熒光信號(hào)給出的.CNTs是否會(huì)對(duì)這些表征產(chǎn)生影響正逐漸引起人們的關(guān)注,已經(jīng)有一些先期的工作發(fā)表.目前比較保守的做法是針對(duì)每一個(gè)指標(biāo)盡量用多種方法,從多個(gè)角度相互佐證,以提高結(jié)果的可靠性.當(dāng)然,在這些方法比較的過程中,必須建立標(biāo)準(zhǔn)和可靠的用于 CNTs甚至所有納米材料細(xì)胞毒性研究的方法.發(fā)展 CNTs細(xì)胞毒性標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是最終獲得 CNTs真實(shí)毒性的基礎(chǔ).

最后,納米材料的濃度界定模糊.許多納米材料,包括未修飾 CNTs,在水溶液中溶解性低,多以固體形式沉積于細(xì)胞表面,而不是懸浮于培養(yǎng)基中.利用單位體積內(nèi)的 CNTs數(shù)量、單位細(xì)胞的 CNTs數(shù)量、培養(yǎng)皿單位面積的 CNTs數(shù)量,作為 CNTs單位的文獻(xiàn)都已報(bào)道,因此,確立合適的 CNTs劑量描述單位,對(duì)納米材料的毒性研究意義深遠(yuǎn).

總體來說,對(duì)于 CNTs細(xì)胞毒性的研究,要獲得真實(shí)可信的結(jié)果,需要標(biāo)準(zhǔn)可信的檢測(cè)方法,需要標(biāo)準(zhǔn)的 CNTs樣品,需要系統(tǒng)研究各個(gè)影響因素造成的細(xì)胞應(yīng)答.

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(編輯:劉志強(qiáng))

Cytotoxicity of Pr istine Carbon Nanotubes:M echan ism and Influencing Factor s

L IU Yuan-fang1,2, L IU Jia-hui1,2, WANGHai-fang1
(1.Institute of Nanochemistry and Nanobiology,ShanghaiUniversity,Shanghai200444,China;2.College of Chemistry and Molecule Engineering,Peking University,Beijing 100871,China)

O 613.71

A

1007-2861(2010)05-0447-13

10.3969/j.issn.1007-2861.2010.05.002

2010-06-08

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)資助項(xiàng)目(2006CB705604)

劉元方 (1931～),男,教授,中國科學(xué)院院士,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)榧{米生物學(xué).E-mail:yliu@pku.edu.cn