劉梅，武梅，周世權，高鵬，魯濤，王日昕，石戈，廖智

1 浙江海洋學院海洋科學學院 海洋生物資源及分子工程實驗室，舟山 316000 2 舟山醫(yī)院-中科院北京基因組研究所免疫基因組學聯(lián)合實驗室，舟山 316004

基于厚殼貽貝Mytilin-1的抗菌肽設計、固相合成及抗菌譜分析

劉梅1，武梅1，周世權2，高鵬1，魯濤1，王日昕1，石戈1，廖智1

1 浙江海洋學院海洋科學學院 海洋生物資源及分子工程實驗室，舟山 316000 2 舟山醫(yī)院-中科院北京基因組研究所免疫基因組學聯(lián)合實驗室，舟山 316004

貽貝抗菌肽Mytilin是貽貝免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對其結構與功能的研究表明，其序列中連接兩段β-折疊的發(fā)夾區(qū)域是其抗菌功能的關鍵所在。為驗證該區(qū)域是否具有抗菌活性，通過對厚殼貽貝Mytilus coruscus抗菌肽Mytilin進行空間結構模擬，選取其中 β-發(fā)夾部分肽段，采用了固相化學合成的方法合成了兩條 10肽，分別命名為 Mytilin Derived Peptide-1(MDP-1)和 Mytilin Derived Peptide-2(MDP-2)。高效液相色譜以及質譜檢測結果表明，合成是成功的?？咕V研究表明，MDP-1和MDP-2 對革蘭氏陽性菌、陰性菌以及真菌均具有明顯的抑制作用，同時，合成的MDP由于序列短且有兩對二硫鍵，因此對于溫度及人血漿均表現(xiàn)出很強的穩(wěn)定性。上述研究結果為深入了解厚殼貽貝抗菌肽Mytilin的抗菌機制以及在此基礎上開發(fā)具有應用價值的新型抗菌肽奠定了基礎。

Mytilin，MDP，固相化學合成，抗菌譜

Abstract:As a key role in mussel defense system, Mytilin is an important antibacterial peptide isolated from the mussel serum.The structural and functional researches on Mytilin showed that the fragment connecting two β-sheets in a stable β-hairpin structure was probably required for antimicrobial activity.To elucidate the structural features and the antimicrobial activity of this fragment,we re-designed and synthesized two peptides corresponding to the main mimic structures of Mytilin-1 fromMytilus coruscus, we named these two peptides Mytilin Derived Peptide-1 and Mytilin Derived Peptide-2, respectively.Using a liquid growth inhibition assay, we evaluated their activity towards Gram-positive, Gram-negative bacteria and fungus.The results showed that both peptidescan inhibit the growth of Gram-positive, Gram-negative bacteria and fungus.Besides, these two peptides showed high stability in heat water and human serum.These works laid the foundation for further research on the molecular mechanism of Mytilin and for further exploitation of antibacterial peptides with lower molecular mass and more stable structure.

Keywords:Mytilin, Mytilin derived peptide(MDP), solid-phase synthesis, antimicrobial activity

貽貝抗菌肽是海洋生物抗菌肽研究中的一個重要內(nèi)容，其特殊的結構與高效的抗菌功能使其具有重要的理論研究價值，同時也具有開發(fā)成為新型生物抗生素的潛力[1]。Mytilin是貽貝抗菌肽家族中的一類重要成員，目前已從不同種的貽貝中分離純化到 5種 Mytilin分子，分別為 MytilinA、B、C、D和 G1[2-3]，是目前貽貝抗菌肽研究中發(fā)現(xiàn)成員最多的家族。鑒于其在貽貝血清中的高豐度以及在體外抗菌實驗中表現(xiàn)出的高效抗菌功能，Mytilin被認為是貽貝防御機制中最重要的一類抗菌肽分子[4]。

抗菌肽的抗菌功能與其空間結構具有密切關系，因此，針對抗菌肽的結構研究一直受到人們的關注，也是深入了解抗菌肽結構與功能的關系及其抗菌機制的關鍵所在。Roch等最近對來自地中海貽貝Mytilus galloprovincialis的Mytilin B進行了核磁共振研究[5]，結果表明，Mytilin B的結構屬于典型的二硫鍵穩(wěn)定的 α/β 結構(Cysteine-stabilized-α/β)，分子中包含有一段α-螺旋和兩段β-折疊片，由4對二硫鍵穩(wěn)定整個結構。該結構類型既不屬于抗菌肽常見的α-螺旋結構，也不屬于單純β-折疊型抗菌肽結構，是一類比較特殊的空間結構，且該結構類似于Yang等早期解析的貽貝防御素MGD-1的空間結構[6]。而通過對 MGD-1的結構與功能的研究，Romestand等認為由兩段 β-折疊片及連接這兩段 β-折疊片的環(huán)(Loop)上的帶正電荷的氨基酸殘基是貽貝抗菌肽發(fā)揮抗菌活性的關鍵部位[7]。

厚殼貽貝Mytilus coruscus是我國具有重要經(jīng)濟價值的養(yǎng)殖貽貝之一，在前期的研究中，本研究室已從厚殼貽貝血清中分離純化到一種Mytilin，命名為 Mytilin-1(GenBank Accession No.FJ973154)，該抗菌肽分子量為3885.3 Da，含34個氨基酸殘基，其中包括8個半胱氨酸并形成4對二硫鍵。體外抗菌實驗中，Mytilin-1對滕黃疊球菌Sarcina luteus及大腸桿菌Escherichia coli均具有明顯的抑制作用[8]。為進一步了解厚殼貽貝Mytilin-1的結構與功能的關系，鑒于厚殼貽貝Mytilin-1與地中海貽貝的Mytilin B具有較高的序列相似性(64%)，本實驗以地中海貽貝Mytilin B(PDB編號：2EEM)為模板，對厚殼貽貝Mytilin-1進行了空間結構模擬。根據(jù)結構模擬結果發(fā)現(xiàn)，厚殼貽貝Mytilin-1同樣具有兩段β-折疊片及連接這兩段β-折疊片的環(huán)(Loop)，且環(huán)上分布有堿性氨基酸殘基(Arg)，為驗證該區(qū)域是否為Mytilin-1的活性位點，根據(jù)該部位的氨基酸序列和結構特點，人工設計并合成了兩條新的多肽，分別命名為Mytilin Derived Peptide-1(MDP-1)和Mytilin Derived Peptide-2(MDP-2)，并對其抗菌譜做了分析。上述研究為深入了解厚殼貽貝抗菌肽 Mytilin的結構與功能的關系，以及在此基礎上進行新型抗菌肽分子的設計和改造奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸、側鏈保護基 Cys(Acm)、Cys(Trt)、二氯甲烷(DCM)、二異丙基乙胺(DIEA)、1-羥基-苯并-三氮唑(HOBt)、1-氧-3-雙二甲胺羰基苯駢三氮唑四氟化硼鹽(TBTU)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為上海吉爾公司的產(chǎn)品。N-甲基嗎啉(NMM)、哌啶(Piperidine)、Fmoc-Rink-AM-Resin 樹脂、三氟乙酸(TFA)、苯并三唑四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)、1-羰基苯并四唑(HOBt)均為Sigma公司產(chǎn)品。乙腈購自美國TEDIA公司。其他試劑均為國產(chǎn)色譜純試劑。實驗用去離子水由 Millipore synergy純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制取。

1.2 方法

1.2.1 厚殼貽貝Mytilin-1的結構模擬及多肽設計

利用結構模擬軟件 ESyPred3D[9]，以地中海貽貝Mytilus galloprovincialis的Mytilin B(PDB編號：2EEM)為模板，對厚殼貽貝 Mytilin-1進行空間結構模擬，獲得厚殼貽貝Mytilin-1主鏈的空間結構。根據(jù) Mytilin-1的空間結構，選擇 20號丙氨酸(Ala20)到 29號半胱氨酸(Cys29)之間的 10肽片段，將Ala20及Ser22分別替換成Cys，獲得一條新的多肽，命名為MDP-1，該多肽的N端設計為乙?；珻端設計為酰胺化以去除末端電荷，其序列為Ac-Cys-Val-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Cys-Ile-Cys-NH2；同時，另外設計了一條反向序列，命名為MDP-2，其序列為 Ac-Cys-Ile-Cys-Arg-Arg-Gly-Phe-Cys-Val-Cys-NH2(圖1)。

圖1 厚殼貽貝Mytilin-1的序列及衍生多肽(MDP-1和MDP-2)的設計Fig.1 Amino acid sequences of Mytilin-1 fromMytilus coruscusand derived peptides based on selected fragments.

1.2.2 MDP-1及MDP-2的固相合成、復性及純化

應用固相合成法(Solid-phase peptide synthesis，SPPS)，利用 Fmoc-Cys(Trt)-OH(Cys1 和Cys4)和 Fmoc-Cys(Acm)-OH(Cys2和 Cys3)的不同性質，分別利用三苯甲基(Trt)和乙酰氨甲基(Acm)保護作為一對要形成二硫鍵的Cys合成出所需線性多肽，結合分步去保護和復性以便二硫鍵的正確配對(Cys1-Cys4，Cys2-Cys3)。

多肽合成參照文獻[9]的方法在Tetras多肽合成儀(美國 ThuraMed公司)上進行，基本流程為：Fmoc-Rink-AM-Resin樹脂以DCM進行充分溶脹；取第1個Fmoc-氨基酸于DCM中溶解，再加入DIEA混合后加入反應容器中，吹N2反應2 h，將反應液過濾除去加入甲醇，封閉反應1 h后分別用DCM、異丙醇及DMF洗滌樹脂；之后用20%哌啶脫Fmoc，經(jīng) DMF充分洗滌后，加第 2個氨基酸與 HOBt及DIEA混合后進行偶聯(lián)，反應1 h后，用茚三酮檢測，樹脂無色透明為反應完全，然后以DMF充分洗滌；重復上述步驟直到最后一個氨基酸反應完全。利用K試劑(K Reagent，含82.5%的TFA，5%的苯酚，5%的苯甲硫醚，以及2.5%的巰基乙醇的水溶液)對合成后的多肽進行側鏈去保護以及從樹脂上切割。

獲得的合成粗品首先在90%TFA中反應2 h，以去除Cys1和Cys4的保護基團Trt，之后利用雙氧水進行氧化復性，以確保Cys1和Cys4之間形成二硫鍵；第一對二硫鍵形成后的粗品經(jīng)高效液相色譜純化并經(jīng)質譜檢測以確定第一對二硫鍵正確形成，之后分別以碘/甲醇/DMF混合溶液及抗壞血酸進行Cys2和Cys3的保護基團Acm的去除以及復性，以形成第二對二硫鍵。復性完全后的多肽樣品用反相高效液相色譜純化2次。第一次純化：Sunfire C18 柱(10 mm×250 mm，Waters)，洗脫梯度：0～40 min，5%～30%乙腈(含0.1%TFA)；第二次純化：Vydac C18 柱(4.6 mm×250 mm)，洗脫梯度：0～40 min，5%～20%乙腈(含 0.1% TFA)。

用Waters ZQ2000質譜儀分析目的峰的精確分子量，質譜檢測條件為毛細管電壓：3.50 kV；錐孔電壓：35 V；干燥氣流速：500 L/h；離子源溫度：120℃；輔助氣溫度：380℃；離子檢測方式：選擇性離子檢測(SIM)；離子極性：正離子(Positive)；離子化方式：氣動輔助電噴霧離子化(ESI)。

1.2.3 抗菌譜分析

根據(jù)文獻方法[3]，采用培養(yǎng)基倍比稀釋法測定MDP-1和MDP-2抗菌活性。細菌用Poor-Broth液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后用相應培養(yǎng)基稀釋至A630為0.001；在預先經(jīng)滅菌處理的96孔板中每個孔加入90 μL菌液。多肽以滅菌處理后的純水溶解，最高濃度為1 mmol/L，然后倍比稀釋，最低濃度為5 μmol/L，以純水作為陰性對照，將各濃度多肽溶液加入96孔板中，10 μL/孔，并以經(jīng)滅菌處理的錫箔紙覆蓋 96孔板，以防止培養(yǎng)過程中的雜菌污染。

將 96孔板在振蕩器上輕柔振蕩使樣品和菌液充分混合，置于搖床(轉速為 200 r/min)37℃培養(yǎng)16～24 h。采用酶標儀測定每個孔的OD值以衡量多肽對于細菌生長的抑制作用，每種細菌平行做 3次重復。多肽的最低抑制濃度(Minimal inhibitory concentrations，MIC)用[a]–[b]表示，其中[a]代表細菌繼續(xù)生長的最大濃度，而[b]代表細菌完全被殺滅的最低濃度?？拐婢囼炁c上述基本相同，只是真菌在Sabourand 液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48 h后檢測。

1.2.4 MDP-1和MDP-2的穩(wěn)定性分析

將MDP-1和MDP-2分別于30℃、60℃和90℃水浴中加熱30 min(樣品濃度為100 μmol/L)，熱處理后的樣品以0.22 μm針頭過濾器過濾；以藤黃疊球菌S.luteus為指示菌檢測經(jīng)熱處理后的抗菌肽的抑菌活性，以不經(jīng)熱處理的樣品為對照，對照組抑菌活性設為 100%；抑菌活性采取常規(guī)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基涂平板法，將抗菌肽經(jīng)不同條件處理后的抑菌圈直徑除以對照組抑菌圈直徑，計算抑菌效果。

健康成年人血漿由舟山醫(yī)院-中科院北京基因組研究所提供。將 MDP-1和 MDP-2溶于血漿(濃度為 100 μmol/L)，37℃分別孵育 30 min、2 h、4 h、8 h和24 h。處理后的樣品經(jīng)0.22 μm針頭過濾器過濾后進行抑菌活性測試，指示菌為藤黃疊球菌 S.luteus，抑菌活性測試方法同上。

2 結果

2.1 厚殼貽貝Mytilin-1的結構模擬

圖2為厚殼貽貝Mytilin-1 的模擬空間結構，由圖2可見，Mytilin-1采取了典型的二硫鍵穩(wěn)定的α/β結構，二硫鍵連接方式為CysI-CysV、CysII-CysVI、CysIII-CysVII和 CysIV-CysVIII；N 端肽段Cys2-Arg13形成 α-螺旋，而肽段 Gly17-Ser22和Cys27-Phe32形成兩段 β-折疊，肽段 Phe23-Arg26形成連接兩段 β-折疊的環(huán)狀結構(Loop)，堿性氨基酸Arg25和Arg26突出于環(huán)表面。

2.2 MDP-1及MDP-2的固相合成及鑒定

合成后的 MDP粗品經(jīng)冷凍干燥后呈白色粉末狀，經(jīng)兩步反相高效液相色譜純化后，得到單一洗脫峰(圖3A)，其純度＞95%；質譜檢測結果(圖3B)表明，合成后的多肽純品的單同位素分子量([M+H]+)分別為1197.34 Da(MDP-1)和1197.46 Da(MDP-2)，這與 MDP 的理論分子量(含兩對二硫鍵，1197.51 Da)是一致的，提示合成是成功的，同時也表明兩對二硫鍵已經(jīng)正確配對。

對合成過程中Fmoc基團的檢測表明合成過程中氨基酸的偶聯(lián)率＞99%；合成粗品經(jīng)復性后的得率為 65%，經(jīng)兩次分離純化后，最終產(chǎn)品得率為25%。

2.3 MDP的抗菌譜分析

通過倍比稀釋法測定了MDP-1和MDP-2的抗菌活性(表1)。分別測得了MDP-1和MDP-2對于6種革蘭氏陰性菌、4種革蘭氏陽性菌以及 2種真菌的MIC。在所選定的微生物中，MDP-2在20 μmol/L內(nèi)均有較好的殺滅作用，尤其對于哈維氏弧菌Vibrio harveyi、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus以及藤黃疊球菌Sarcina luteus等。而MDP-1的殺菌作用較弱，除了對大腸桿菌Escherichia coli和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis有較好的抑制作用外，對其他微生物的MIC都在20 μmol/L以上。此外，從表1可以看出MDP-1和MDP-2對于革蘭氏陰性菌、陽性菌以及真菌未表現(xiàn)出明顯的選擇性，說明兩者都是廣譜抗菌活性。

圖2 Mytilin-1的模擬空間結構、活性區(qū)域及MDP的設計Fig.2 Mimic space structure of Mytilin-1(using 2EEM as template)fromMytilus coruscusand the designation of Mytilin-derived-peptides based on the key region(represented by a circle)of antimicrobial activity.The structure predicted and viewed software were ESyPred3D and Swiss-PdbViewer4.0, respectively.The N- and C-terminal of peptides were labeled by N and C, respectively.The disulfides were labeled by dashed line.

圖3 MDP-1及MDP-2合成后的反相高效液相色潽純化圖(A)和質譜鑒定結果(B)Fig.3 HPLC isolation(A)and MS analysis(B)of synthesized MDP-1and MDP-2.

表1 MDP-1和MDP-2對于各種細菌和真菌的最低抑菌濃度(MIC)Table 1 Activity spectrum of MDP-1 and MDP-2

同時，以藤黃疊球菌為指示菌，對厚殼貽貝天然Mytilin-1與人工合成的MDP的抑菌活性進行了比較。結果表明，MDP-2對于藤黃疊球菌的MIC相比Mytilin-1下降了約10倍，而MDP-1對于藤黃疊球菌的MIC相比Mytilin-1下降了約200倍，說明合成的抗菌肽較天然抗菌肽相比，其抑菌活性有所下降。

2.4 MDP的穩(wěn)定性分析

MDP-1和MDP-2熱穩(wěn)定性較好，其中MDP-1在30℃、60℃和90℃水浴中加熱30 min后其抑菌活性未見明顯下降，而 MDP-2經(jīng) 30℃、60℃和90℃水浴加熱30 min后，其抑菌活性也分別下降不到5%。

MDP在人血漿中也表現(xiàn)出很強的穩(wěn)定性，在人血漿中經(jīng)37℃ 孵育30 min、2 h、4 h、8 h和24 h之后，MDP-1和MDP-2的抑菌活性與未處理樣品相比未見明顯下降?？瞻兹搜獫{在本次試驗中未觀察到抑菌活性。

3 討論

生物抗菌肽具有高效的殺菌作用以及對細菌不容易產(chǎn)生耐受性等優(yōu)勢，因而在新型生物抗生素的開發(fā)中具有重要的研究價值。但相對于傳統(tǒng)的有機小分子抗生素，生物抗菌肽因其屬于蛋白質，其分子量較大，結構不夠穩(wěn)定且容易被降解，因而限制了其應用。如何保留生物抗菌肽的抗菌功能，同時又盡量減小其分子體積并增強其結構穩(wěn)定性是目前生物抗菌肽開發(fā)中的重要內(nèi)容，目前這方面已有許多成功的例子[11-12]。

貽貝抗菌肽是海洋生物抗菌肽研究中的一個熱點，目前已從貽貝血淋巴中提取到4類抗菌肽分子，分別為 Mytilin、myticin、MGD和 mytimicin[1]。其中，Mytilin以及MGD抗菌肽的空間結構已被解析，對其結構與抗菌功能關系的研究表明，Mytilin和MGD抗菌肽分子結構中，連接兩段 β-折疊的 β-發(fā)夾結構是其抗菌活性關鍵區(qū)域[5-6]。該類型結構域在其他抗菌肽分子也有所發(fā)現(xiàn)并也已被證明是其發(fā)揮抗菌作用的關鍵區(qū)域，而根據(jù)類似的 β-發(fā)夾結構設計并合成的，具有抗菌活性的人工抗菌肽也大量報道，例如Chiou等根據(jù)抗菌肽Cecropins的結構特點合成了一個新的具有 β-發(fā)夾結構的 17肽，命名為CF17，體外實驗表明，CF17具有明顯的抗菌及抗病毒活性[11]；Tamamura等[12]以及 Shankaramm 等[13]根據(jù)抗菌肽protegrin的結構特點設計合成了一種衍生多肽，為18肽，同樣具有β-發(fā)夾結構以及體外的抗菌及抗病毒活性。目前，具有這一結構特點的抗菌肽已經(jīng)在臨床上獲得應用，例如，基于抗菌肽protegrin-1設計合成具有 β-發(fā)夾結構的新抗菌肽iseganan已被應用于臨床三期[14]。

貽貝抗菌肽Mytilin也具有典型的β-發(fā)夾結構，而天然Mytilin分子具有4對二硫鍵，不論是進行重組表達還是進行固相化學合成，均面臨很大的困難。為進一步驗證Mytilin抗菌肽的結構與功能的關系，同時為抗菌肽的人工設計與合成提供新的思路，本實驗對此前從厚殼貽貝血清中提取到的抗菌肽Mytilin-1進行了空間結構模擬，根據(jù)其空間結構特點，對形成連接兩段β-折疊的β-發(fā)夾結構所包含的肽段進行了重新設計，在原有2個Cys的基礎上引入 2個新的 Cys，通過分步氧化方法促使二硫鍵的正確配對(C1-C4，C2-C3)，同時并將肽末端分別乙?；王０坊诖嘶A上合成了兩條新的序列相反的10肽：MDP-1和MDP-2(圖2)。因MDP序列較短，且只有兩對二硫鍵，因此其合成產(chǎn)率較高，最終產(chǎn)品得率為25%。體外抗菌實驗表明，MDP-1和MDP-2均具有廣譜抗菌活性，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌均具有殺滅活性，尤其是MDP-2對于部分海洋弧菌類以及人類常見致病菌均有明顯的抑制作用。此外，由于序列較短且有兩對二硫鍵的存在，MDP-1和MDP-2均表現(xiàn)出很強的結構穩(wěn)定性，90℃水浴中加熱30 min后其抑菌活性下降不到 5%；同時其在人血漿中也表現(xiàn)很好的穩(wěn)定性，在血漿中經(jīng)37℃孵育24 h后其抗菌活性未見明顯下降。令人感興趣的是，MDP-2的活性要明顯強于MDP-1，在所測試的大多數(shù)菌種中，MDP-2的抗菌活性要比MDP-1高10～20倍，而兩者僅僅只是序列相反，兩者間抗菌活性的差異尚有待進一步研究。目前，MDP-1和 MDP-2 的空間結構仍在解析中。上述研究結果為深入了解具有 β-發(fā)夾結構的抗菌肽的抗菌機制以及在此基礎上開發(fā)新型生物抗生素奠定了基礎。

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Designation, solid-phase synthesis and antimicrobial activity of Mytilin derived peptides based on Mytilin-1 from Mytilus coruscus

Mei Liu1, Mei Wu1, Shiquan Zhou2, Peng Gao1, Tao Lu1, Rixin Wang1, Ge Shi1, and Zhi Liao1
1 Laboratory of Marine Living and Molecular Engineering, College of Marine Science, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316000, China 2 Joint Laboratory of Immunogenomics, Zhoushan Hospital-BIG/CAS, Zhoushan Hospital, Zhoushan 316004, China

Received:October 26, 2009;Accepted:March 18, 2010

Supported by:National Key Technology R&D Program of China(No.2007BAD43B08), General Agricultural Programs of Science and Technology Commission Foundation of Zhejiang Province(Nos.2008C22026, 2009C32016), the Seeding Grants Programs of Science and Technology Commission Foundation of Zhejiang Province(No.2008R40G2110003), the Projection of Zhoushan Technical Bureau(No.Y20082080).

Corresponding author:Zhi Liao.Tel/Fax: +86-580-2550826; E-mail: liaozhi@zjou.edu.cn國家科技支撐計劃(No.2007BAD43B08)，浙江省科技廳面上科研農(nóng)業(yè)項目(Nos.2008C22026, 2009C32016)，浙江省科技廳新苗人才計劃項目(No.2008R40G2110003)，浙江省舟山市科技局計劃項目(No.Y20082080)資助。