張燁，于在江，辛麗，陳永坤，唐啟慧，陳禹保，陳清軒，舒躍龍

1 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所 國(guó)家流感中心，北京 100052 2 北京標(biāo)凱科技有限公司，北京 100094 3 北京中亞國(guó)瑞生物經(jīng)濟(jì)研究所，北京 102206

流感病毒H1N1血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因在酵母菌中的表達(dá)

張燁1，于在江1，辛麗1，陳永坤1，唐啟慧2，陳禹保3，陳清軒2，舒躍龍1

1 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所 國(guó)家流感中心，北京 100052 2 北京標(biāo)凱科技有限公司，北京 100094 3 北京中亞國(guó)瑞生物經(jīng)濟(jì)研究所，北京 102206

在成功克隆流感病毒H1N1全長(zhǎng)HA(Hemagglulinin，HA)、NA(Neuramidinase，NA)基因并測(cè)序的基礎(chǔ)上，將部分基因序列克隆到表達(dá)載體pMETA上，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pMETA/HA(52～1 557 bp)、pMETA/NA(121～1 263 bp)，電轉(zhuǎn)化真核酵母菌pMAD16，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni2+親和層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，并用Western blotting和ELISA方法檢測(cè)其抗原性。SDS-PAGE顯示重組蛋白在酵母菌中可以高效表達(dá)，蛋白純度占總蛋白的 95%以上，ELISA和Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)，重組蛋白具有良好的抗原性。成功克隆和表達(dá)了流感病毒H1N1 HA、NA基因序列，為流感病毒H1N1診斷試劑和疫苗的開(kāi)發(fā)等進(jìn)一步的研究提供了參考。

流感病毒H1N1，血凝素，神經(jīng)氨酸酶，酵母表達(dá)

Abstract:On the basis of successful cloning the full length hemagglulinin(HA)and neuramidinase(NA)gene and sequence analysis of influenza virus H1N1, part of the gene was ligated into pMETA.Expression vectors pMETA/HA(52–1 557 bp)and pMETA/NA(121–1 263 bp)were constructed and expressed in pMAD16 induced by methanol.Recombinant protein was purified through Ni2+affinity chromatography.Western blotting and ELISA were used to determine the antigenic activity of the recombinant protein.SDS-PAGE showed that the recombinant capsid gene could be overexpressed inPichia methanolica.ELISA and Western blotting showed that the recombinant protein had antigenicity.

Keywords:influenza virus H1N1, hemagglutinin, neuramidinase, yeast express

A型流感病毒H1N1亞型也稱H1N1病毒，是A型流感病毒的一種，也是人類最常感染的流感病毒之一。一些 H1N1的種類可以在人類間傳播，包括1918 年的流感大爆發(fā)，另一些可在雀鳥(niǎo)和豬 隻 間傳播。H1N1亞型流感病毒不僅能導(dǎo)致上呼吸道和肺部的感染，同時(shí)還能導(dǎo)致腦部、心臟、胰腺等全身性多器官的感染。流感病毒點(diǎn)突變?cè)斐傻目乖瓶蓪?dǎo)致流感每年季節(jié)性流行，而基因重配造成的抗原轉(zhuǎn)換則可能產(chǎn)生新的亞型，因人類對(duì)新亞型普遍缺乏免疫力而可能導(dǎo)致流感世界大流行[1-4]。

導(dǎo)致 2009年流感大流行的病毒為新型甲型H1N1病毒，是由豬流感病毒演變而來(lái)，主要通過(guò)呼吸道引起人與人之間的傳播。其癥狀與季節(jié)性流感相似，其病毒基因組包含有禽流感、豬流感和人流感3種流感病毒的核糖核酸基因片段[5-7]。流感病毒正是通過(guò)不斷改變其抗原性來(lái)逃避宿主特異性免疫的識(shí)別，從而不斷引起流行，尤其以HAl區(qū)的抗原決定簇位點(diǎn)的變異最為重要[8]，因此，有關(guān)流感病毒 H1N1生物學(xué)特性、致病機(jī)理、診斷和預(yù)防的研究日益受到衛(wèi)生防疫人員的重視。

血凝素(Hemagglulinin，HA)蛋白是病毒表面的主要糖蛋白之一，屬于主要的保護(hù)性抗原，它不僅可以誘導(dǎo)特異性中和抗體產(chǎn)生，而且還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。另外，HA在病毒吸附、穿膜以及決定病毒的宿主特異性和致病力方面均發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。NA基因編碼的神經(jīng)氨酸酶(Neuramidinase，NA)蛋白是體液免疫的靶抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，抗體具有免疫保護(hù)作用[10]。

本研究利用真核酵母菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了H1N1病毒HA、NA蛋白，并對(duì)重組蛋白抗原性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，為血清流行病學(xué)調(diào)查及診斷試劑的開(kāi)發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

流感病毒 H1N1由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所國(guó)家流感中心分離培養(yǎng)；大腸桿菌E.coliDH5α、DNA marker為北京標(biāo)凱科技有限公司產(chǎn)品；pMETA載體為Invitrogen公司產(chǎn)品；pMD20-T載體、蛋白marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、RNA抽提試劑盒為北京標(biāo)凱科技有限公司產(chǎn)品；Ni-NTAgrose為Qiagen公司產(chǎn)品；其他試劑為分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 流感病毒H1N1(安徽分離株)全基因組提取以及HA、NA基因的克隆

病毒基因組的提取按病毒 RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。根據(jù) GenBank中流感病 H1N1(GenBank Accession No.EU516079.1)基因序列，設(shè)計(jì)出針對(duì)H1N1 HA和NA大片段的引物。以提取的病毒 RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄HA和NA基因。操作步驟為：模板與引物70℃保溫10 min后迅速在冰上急冷3 min，瞬離再加入已混合好的緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、無(wú) RNA酶水，42℃保溫 1 h。以逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；93℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR結(jié)束后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性的片段，用膠回收試劑盒回收純化后，克隆至pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α，PCR鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒送北京標(biāo)凱科技有限公司測(cè)序鑒定。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.2 HA、NA蛋白抗原片段表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)HA、NA蛋白基因陽(yáng)性重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物(表 1)。以流感病毒 H1N1蛋白基因陽(yáng)性重組質(zhì)粒(pMD20-T-HA/NA)為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；93℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增出尾部截短150 bp的兩端帶有酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的HA和NA基因序列。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化后雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pMETA載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α，挑單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，PCR鑒定出陽(yáng)性克隆。重組質(zhì)粒pMETA/HA(52～1 557 bp)、pMETA/NA(121～1 263 bp)PCR陽(yáng)性克隆送北京標(biāo)凱科技有限公司測(cè)序。

表1 文中所用的引物序列Table 1 The primer sequences in this study

1.2.3 HA、NA蛋白抗原片段的表達(dá)

pMETA/HA(52～1 557 bp)、pMETA/NA(121～1 263 bp)陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)AscI線性化，電轉(zhuǎn)化P.methanolicapMAD16，涂MD平板，挑單克隆，接種入10 mL BMDY培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min振搖過(guò)夜。次日將10 mL培養(yǎng)物離心收集菌體，懸浮于100 mL BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，每天補(bǔ)充甲醇至終濃度0.5%，3 d后離心收集菌體，并用PBS洗1次，?40℃凍融2次，用1/10體積的PBST(PBS，0.5%Triton-X100，pH 7.4)懸浮菌體，加 PMSF至終濃度為1 mmol/L，玻璃珠渦旋振蕩破碎菌體，4℃、12 000 r/min離心30 min，分別收集沉淀和上清，沉淀再次溶于8 mol/L尿素中，4℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清，棄沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示蛋白獲得了高效表達(dá)，分子量大小比預(yù)期的大，推測(cè)是蛋白經(jīng)過(guò)了糖基化修飾，可溶性分析證明蛋白既有可溶性表達(dá)也有包涵體表達(dá)。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化

用Ni-NTA agarose按QAGEN手冊(cè)方法純化上清(可溶性表達(dá))，PBS透析。

1.2.5 純化產(chǎn)物抗原性的鑒定

ELISA檢測(cè)：以梯度稀釋的表達(dá)重組蛋白抗原包被，梯度稀釋的兔抗流感病毒 H1N1血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，并設(shè)空白對(duì)照和免疫前小鼠血清為陰性對(duì)照，待測(cè)樣本OD值大于陰性對(duì)照OD值2倍以上為陽(yáng)性。

Western blotting檢測(cè)：以重組蛋白為抗原，兔抗流感病毒H1N1血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行Western印跡檢測(cè)，并設(shè)誘導(dǎo)的pMAD16(轉(zhuǎn)入pMETA空質(zhì)粒)為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 H1N1病毒全基因組提取以及HA、NA基因的克隆

病毒RNA模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖電泳顯示得到一條1 700 bp和一條1 400 bp左右的條帶(圖1)，此條帶與T載體連接轉(zhuǎn)化后得到多個(gè)陽(yáng)性克隆，測(cè)序結(jié)果分析，這 2條基因序列是H1N1病毒的血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因。

圖1 HA、NA基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR analysis for HA and NA.M: DNA marker; 1: PCR products of HA gene; 2: PCR products of NA gene.

2.2 HA、NA蛋白抗原片段表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化后，上下游酶切位點(diǎn)雙酶切，同時(shí)也同樣的酶處理pMETA載體，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α，小量抽提質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示條帶大小與預(yù)期相符(圖2)，測(cè)序結(jié)果也正確，表明目的基因已經(jīng)成功亞克隆至pMETA載體。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pMETA/HA(52～1 557 bp)、pMETA/NA(121～1 263 bp)的酶切及PCR鑒定Fig.2 Enzyme digestion analysis and PCR identification of recombinant plasmid pMETA/HA(52?1 557 bp), pMETA/NA(121?1 263 bp).1: pMETA; 2: pMETA digested withBamH I;3: pMETA/HA(52?1 557 bp); 4: pMETA/HA(52?1 557 bp)digested withBamH I; 5: pMETA/HA(52?1 557 bp)digested withBamH I andNotI; 6: PCR for HA(52?1 557 bp); 7: pMETA/NA(121?1 263 bp); 8: pMETA/NA(121?1 263 bp)digested withEcoR I; 9: pMETA/NA(121?1 263 bp)digested withEcoR I andNotI; 10: PCR for NA(121?1 263 bp); M: DNA marker.

2.3 HA、NA蛋白抗原片段的表達(dá)

重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)AscI線性化，電轉(zhuǎn)化P.methanolicapMAD16，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)3 d后，SDS-PAGE分析可見(jiàn)特異性表達(dá)帶，分子量比預(yù)期大，推測(cè)是蛋白表達(dá)后經(jīng)過(guò)了糖基化修飾?？扇苄苑治鲲@示此蛋白既有可溶性表達(dá)也有包涵體形式表達(dá)。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化

用 Ni-NTA agarose親和層析柱純化上清，在300 mmol/L咪唑洗脫時(shí)Bradford試劑有強(qiáng)烈的顏色變化，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，表明目的蛋白得到純化，占總蛋白的95%以上(圖3和圖4)。純化后的蛋白經(jīng)PBS透析后保存。

圖3 HA重組蛋白的表達(dá)和純化Fig.3 Expression and purification of HA.M: protein marker;1: pMAD16 before methanol induction; 2: pMAD16 after methanol induction; 3: ultrasonic supernatant after methanol induction; 4: crude extract of infusibility protein; 5: purified recombinant protein.

圖4 NA重組蛋白的表達(dá)和純化Fig.4 Expression and purification of NA.M: protein marker; 1:pMAD16 before methanol induction; 2: pMAD16 after methanol induction; 3: ultrasonic supernatant after methanol induction; 4:crude extract of infusibility protein; 5: purified recombinant protein.

2.5 純化產(chǎn)物抗原性的鑒定

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：重組蛋白與兔抗流感病毒H1N1血清有陽(yáng)性反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)，提示表達(dá)的重組蛋白與病毒自身蛋白有相似的免疫原性。

Western blotting結(jié)果顯示重組蛋白與兔抗流感病毒H1N1血清反應(yīng)有特異性條帶產(chǎn)生，分子量大小與預(yù)期一致(圖5)。

圖5 重組蛋白與兔抗禽流感病毒H1N1血清的Western blotting分析Fig.5 Western blotting analysis of recombinant protein and influenza virus H1N1 antiserum.Negative: pMAD16 control; M:prestained protein marker; H1: recombinant protein HA; N1:recombinant protein NA.

3 討論

流感病毒(Influenza virus，IV)屬于單股負(fù)鏈RNA 病毒，基因組大約為13.6 kb，由大小不等的8個(gè)基因片段組成。編碼PB2、PB1、PA聚合酶、血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質(zhì)蛋白M1和離子通道蛋白M2、非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NEP共 10種不同的基因產(chǎn)物[11-12]。其中血凝素(Hemagglutinin，HA)基因?qū)儆谥饕谋Ｗo(hù)性抗原，它不僅可以誘導(dǎo)特異性中和抗體產(chǎn)生，而且還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。另外，HA在病毒吸附、穿膜以及決定病毒的宿主特異性和致病力方面均起著關(guān)鍵作用。因此，HA 基因的變異程度將直接影響對(duì)該病毒的防治[13-14]。NA基因編碼的神經(jīng)氨酸酶(Neuramidinase，NA)蛋白也是AIV的主要表面抗原之一，具有水解唾液酸的活性，當(dāng)成熟的流感病毒經(jīng)出芽的方式脫離宿主細(xì)胞之后，病毒表面的血凝素會(huì)經(jīng)由唾液酸與宿主細(xì)胞膜保持聯(lián)系，需要由神經(jīng)氨酸酶將唾液酸水解，切斷病毒與宿主細(xì)胞的最后聯(lián)系。有利于子代病毒粒子的成熟和釋放。NA的另一種作用是穿透呼吸道表面的黏膜，促進(jìn)病毒在機(jī)體內(nèi)的傳播，與病毒的宿主嗜性及毒力有關(guān)。NA是體液免疫的靶抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，抗體具有免疫保護(hù)作用，可抑制酶活性，抑制病毒從感染細(xì)胞釋放，從而減少病毒的增殖[15-17]。

H1N1流感病毒的流行范圍遍及全球且目前尚無(wú)有效地預(yù)防措施[18]，因此，H1N1病毒基因工程疫苗和快速診斷試劑的研制有著廣闊的前景。在臨床上進(jìn)行 H1N1病毒感染的快速診斷時(shí)常需要獲得特異性強(qiáng)的高效價(jià)病毒抗體。而傳統(tǒng)的純化病毒方法制備病毒抗體費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且往往難以得到特異性較高的抗體。

本研究利用真核酵母菌表達(dá)系統(tǒng)具有成本低、操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、表達(dá)產(chǎn)量高且表達(dá)的蛋白易于純化等優(yōu)點(diǎn)[19]。利用基因工程手段將HA、NA基因的信號(hào)肽缺失掉，采用真核表達(dá)載體 pMETA表達(dá)了缺失信號(hào)肽的HA和NA蛋白部分基因序列(HA(52～1 557 bp)，NA(121～1 263 bp))，我們對(duì)基因序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)尾部150 bp是基因的穿膜區(qū)，與免疫原性無(wú)關(guān)且體外表達(dá)時(shí)會(huì)因?yàn)槭杷远绊懕磉_(dá)，故決定截去尾部150 bp，結(jié)果獲得了高效表達(dá)，蛋白分子量大于預(yù)期，推測(cè)是糖基化修飾，純化效果也非常好，達(dá)到了95%以上。

免疫學(xué)鑒定確定表達(dá)的蛋白都具有較好的免疫反應(yīng)性，后續(xù)的試驗(yàn)將利用此重組蛋白進(jìn)行單克隆抗體和免疫學(xué)快速檢測(cè)試劑的研制，本工作為研制開(kāi)發(fā)相關(guān)的診斷試劑和基因工程疫苗打下了基礎(chǔ)。

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Expression of the hemagglutinin and neuramidinase gene of influenza A virus H1N1 in Pichia methanolica

Ye Zhang1, Zaijiang Yu1, Li Xin1, Yongkun Chen1, Qihui Tang2, Yubao Chen3, Qingxuan Chen2,and Yuelong Shu1
1 Department of Influertza, Nattonat Institute of Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China 2 Beijing Biokit Science and Technology Limited Company, Beijing 100094, China 3 Sinogreen Institute for Bioeconomy, Beijing 102206, China

Received:January 23, 2010;Accepted:May 4, 2010

Supported by:National Science and Technology Pillar Program(No.2006BAD06A15).

Corresponding author:Yuelong Shu.Tel/Fax: +86-10-63577499; E-mail: yshu@vip.sina.com國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No.2006BAD06A15)資助。