王果平，王川易，賈新岳，郭寶林*

（1.新疆中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所，北京 100193）

中藥資源

新疆鎖陽線粒體nad 1基因第2內(nèi)含子序列居群間變異分析△

王果平1，王川易2，賈新岳1，郭寶林2*

（1.新疆中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所，北京 100193）

目的：對分布于新疆的鎖陽Cynomorium songaricum4個居群22個個體進(jìn)行了線粒體nad1基因第2內(nèi)含子序列的比較研究，分析序列居群差異。方法：提取鎖陽DNA，用通用引物擴(kuò)增線粒體nad1基因第2內(nèi)含子序列，ClustalW軟件比較分析序列。結(jié)果：鎖陽22個樣本的nad1基因第2內(nèi)含子序列變異均表現(xiàn)為插入和缺失，無堿基替換發(fā)生，有13個個體序列完全一致，9個個體有變異位點(diǎn)，變異位點(diǎn)為10個；4個居群間分化不明顯，其中b居群可能存在一定的分化，有兩個個體y 4和a 19存在較大的變異，可能具有一定的遺傳學(xué)意義。結(jié)論：線粒體nad1基因第2內(nèi)含子序列給出的鎖陽4個居群分化不明顯。

鎖陽；nad1基因第2內(nèi)含子；序列分析

相對于植物的核基因和葉綠體基因，利用線粒體基因組的DNA片段進(jìn)行分子標(biāo)記研究的較少，一方面是因?yàn)橹参锞€粒體基因組的進(jìn)化速率比葉綠體基因組更慢，從而提供的信息有限，另一方面由于植物基因組在大小和結(jié)構(gòu)上十分不穩(wěn)定（高頻率重排、重復(fù)或缺失以及外源DNA的轉(zhuǎn)入等）。但最新的研究表明，植物線粒體基因組中有些片段，如與呼吸代謝有關(guān)的基因相對穩(wěn)定，且其中存在進(jìn)化較快的內(nèi)含子，因此某些線粒體DNA片段信息同樣可以提供重要的分子標(biāo)記信息［1］。nad1基因編碼線粒體呼吸鏈的復(fù)合體Ⅰ-泛醌氧化還原酶（NADH，即NADH脫氫酶）的nad1亞基，是一個結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定的線粒體基因，由5個外顯子組成，其中的第2內(nèi)含子被較多研究和關(guān)注，如Sperisen C［2］分析了挪威云杉種群間的差異，Gugerli F［3］則討論了松屬部分種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，Sanjur等［4］利用線粒體nad1基因第2內(nèi)含子序列分析闡明了南瓜屬Cucurbita馴化種與野生種間的親緣與進(jìn)化關(guān)系。郭亞龍等［5］基于nad1基因第2內(nèi)含子序列討論了Porteresia coarctata在稻族中的系統(tǒng)位置。張婷［6］報(bào)道了nad1基因第2內(nèi)含子序列在石斛屬鑒定中的應(yīng)用。譚功燮［7］根據(jù)nad1基因第2內(nèi)含子序列對糯玉米進(jìn)行系統(tǒng)分類，驗(yàn)證了糯玉米在玉蜀黍?qū)僦械南到y(tǒng)學(xué)價(jià)值。已有的報(bào)道均表明該序列在種以上的系統(tǒng)學(xué)研究中具有價(jià)值，本文首次報(bào)道nad1基因第2內(nèi)含子在常用中藥鎖陽Cynomorium songaricum分布于新疆的4個居群間的變異情況。

1 材料、試劑和儀器

1.1 材料

研究樣品于2008年5～6月采自新疆鎖陽兩個自然分布區(qū)，包含3個縣4個居群的22個樣本，采集信息詳見表1。

表1 鎖陽樣品來源

1.2 主要試劑

天根DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］；2×PCR StarMix（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）。

1.3 儀器

美國BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)，Gene Quant 100紫外可見光分光光度計(jì)，TG16-W微量高速離心機(jī)，MG96＋Long Gene基因擴(kuò)增儀等。

2 方法

2.1 總DNA提取

按照天根試劑盒方法提取植物基因DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測總DNA的質(zhì)量和濃度。

2.2 PCR擴(kuò)增引物

根據(jù)南瓜屬［2］（NCBI登錄號gi18378499）序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物nad1-2intron-up（5′-GGTCTTATTCTT ATTGTGCGCCT-3′）和nad1-2intron-low（5′-TTC GTCTATACCAGACCATAAGG-3′）以及一對測序引物WCY-F（5′-GACCATATCTGCTTTTGCG-3′）和WCY-R（5′-GTCATAGGG TGGGCTTCG-3′）。反應(yīng)體系（20μL）：2×Taq PCR starmix 10μL，2μm primers 12μL，2μm primers22μL，template DNA 100 ng左右，補(bǔ)足ddH2O至20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1min，52℃退火40 s，72℃延伸1 min 50 s，35個循環(huán)，72℃保溫7min。送北京六合華大基因公司測序。

2.3 序列分析

序列比對以ClustalW軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增產(chǎn)物為長度約1 000 bp的單一條帶，部分樣品PCR產(chǎn)物擴(kuò)增見圖1。

圖1 nad 1第2內(nèi)含子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

3.2 序列變異特點(diǎn)

本研究測得的鎖陽線粒體nad 1基因第2內(nèi)含子序列長度范圍為924～999 bp，22個個體樣品中有13個樣品序列一致，長925 bp，但各居群均有變異樣本：y居群有1個變異樣本，a和t居群各有2個變異樣本，b居群有4個變異樣本，見表2。所有變異位點(diǎn)以插入為主，有單堿基插入，如t 1和t 9僅在一個位置上有單堿基插入，y 4則在6個不同的位置上有單堿基插入；也有多堿基插入，如b 21、b 25、b 26、b 215均在685～694 bp位點(diǎn)有10堿基的插入，而a 19則有長達(dá)74個堿基的插入，成為最長的一個序列，長達(dá)999 bp，僅有一個樣本a 16出現(xiàn)單堿基缺失，成為最短的序列，長924 bp。

如果把每一次插入或缺失作為一個變異位點(diǎn)，變異位點(diǎn)數(shù)10個。

表2 新疆鎖陽樣品序列變異表

3.3 居群間和居群內(nèi)變異分析

全部變異位點(diǎn)中僅t9和y 4在102 bp位置上有單堿基插入，b居群4個個體在685～694 bp位置有10堿基插入，共2個信息位點(diǎn)，其他均為單一變異位點(diǎn)，難以進(jìn)行樣本間的系統(tǒng)學(xué)分析。

每個居群幾乎都有超過50%的樣本（b居群稍少）序列表現(xiàn)為完全一致，表明鎖陽表現(xiàn)在nad 1基因第2內(nèi)含子上的居群間分化不明顯，但其中的b居群中研究的7個個體中有4個個體都存在同一位點(diǎn)的10堿基插入，表明b居群可能存在一定的遺傳分化。

而在各居群內(nèi)，以個別樣本出現(xiàn)特有的單堿基插入或缺失為主，表明了植物線粒體序列變異以堿基的插入和缺失為主要特點(diǎn)，且以隨機(jī)的單堿基插入和缺失較為易于發(fā)生，從而弱化了這些變異的系統(tǒng)學(xué)意義，同樣的情況在譚功燮［7］等研究糯玉米在玉蜀黍?qū)僖约凹曳N玉米品種中的系統(tǒng)學(xué)位置中也出現(xiàn)過，難以據(jù)此建立比較好的分子系統(tǒng)樹。

不過樣本y 4在6個位置上都出現(xiàn)單堿基插入，樣本a 19出現(xiàn)了1個74 bp的長片段插入，可能是有意義的，有待于結(jié)合其他分子標(biāo)記和形態(tài)學(xué)特征等的研究加以證實(shí)。

［1］Demesure B，Sodzi N，Petit R J，et al.A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrialand chloro-plastDNA in plants［J］.Molecular Ecology，1995，4：129-131.

［2］Sperisen C，Bfichler U，Gugerli F，et al.Tandem repeats inplant mitochondrial genomes：application to analysis of population differentiation in the conifer Norway spruce［J］.Mol Ecol，2001，10：257-263.

［3］Gugerli F，Senn J，AnzideiM，et al.Chloroplastmicrosatellites and mitochondrial nad 1 intron 2 sequences indicate congruent phylogenetic relationships among Swiss stone pine（Pinus cembra），Siberian stone pine（Pinus sibirica）and Siberian dwarf pine（Pinus pumila）［J］.Mol Ecol，2001，10：1489-1497.

［4］Sanjur O I，Piperno D R，Andres TC，et al.Phy-logenetic relationships among domesticated and wild species of Cucurbita（Cucurbitaceae）inferred from a mitochondrial gene：Implications for cro Pplant evolution and areas of origin［J］.PNAS，2002，99（1）：535-540.

［5］郭亞龍，葛頌.線粒體nad1基因內(nèi)含子在稻族系統(tǒng)學(xué)研究中的價(jià)值——兼論P(yáng)orteresiad的系統(tǒng)學(xué)位置［J］.植物分類學(xué)報(bào)，2004，42（4）：333-344.

［6］張婷，王崢濤，徐珞珊，等.線粒體nad 1內(nèi)含子2序列在石斛屬植物分子鑒定中的應(yīng)用［J］.中草藥，2005，36（7）：1059-1062.

［7］譚功燮，田孟良，黃玉碧.根據(jù)線粒體nad1基因第2內(nèi)含子的序列多態(tài)性對糯玉米進(jìn)行系統(tǒng)分類［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，25（1）：31-34.

The Variation Study of Mitochondrial nad 1 Gene Intron 2 among Populations of Cynomorium Songaricum in Xinjiang

Wang Guoping1，Wang Chuanyi2，Jia Xinyue1，Guo Baolin2
（1.XinJiang Institute of Chinese Medicine and Ethical Medicine，Urumqi Xinjiang830002，China；2.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100193，China）

Objective：To examine population variation of mitochondrialnad1 intron 2 within 22 individual samples from 4 populations ofcynomorium songaricumin Xinjiang.Methods：Total DNA was extracted，then the mitochondrial nad1 intron 2 of samples were PCR amplified and sequenced.Sequences alignment were performed using Clustal W software package.Results：The variation of mitochondrialnad1 intron 2 sequences among twenty-two individuals is base insertions or deletions，the sequences of13 individuals are completely the same，the rest9 samples have 10 mutation sites in total.Among the 4 populations only population bmay have differentiation in the sequence，in which the variation of y 4 and a 19 sample is significant.Conclusion：The sequecnce differentiation ofnad1 intron 2 incynomorium songaricumisn′t obvious among 4 populations.

Cynomorium songaricum；nad1 intron 2；Sequence analysis

中國重點(diǎn)藥用生物資源調(diào)查項(xiàng)目——新疆紫草等四種藥用生物資源調(diào)查（YSZ-428-0816）；新疆中藥民族藥研究所基金項(xiàng)目——新疆鎖陽遺傳多樣性研究

*郭寶林，Tel：（010）62895049，E-mail：guobaolin010＠yahoo.com.cn

2010-04-22）