王芳，張秋萍，吳翰昱

（常熟雷允上制藥有限公司，江蘇 常熟 215500）

HPLC測(cè)定天佛參口服液中蟾酥的含量

王芳，張秋萍*，吳翰昱

（常熟雷允上制藥有限公司，江蘇 常熟 215500）

目的：建立HPLC同時(shí)測(cè)定天佛參口服液中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。方法：采用Waters SymmetryShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈-0.5%磷酸二氫鉀（38∶62）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為296 nm；流速為1.0 mL·min－1。結(jié)果：在建立的色譜條件下，華蟾酥毒基的回歸方程為Y＝1 000 000X－648.2，r＝0.999 0，表明華蟾酥毒基在0.013 9～0.695μg與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系；脂蟾毒配基的回歸方程為Y＝5 000 000X＋42 394，r＝0.999 5，脂蟾毒配基在0.021 0～1.052 5μg與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。結(jié)論：本法簡(jiǎn)便、快捷，準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可用于華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量測(cè)定。

HPLC；華蟾酥毒基；脂蟾毒配基；含量測(cè)定

天佛參口服液是常熟雷允上制藥有限公司研發(fā)并已被批準(zhǔn)生產(chǎn)的新品種，在含量測(cè)定中需要檢測(cè)西洋參和蟾酥的含量，其中，檢測(cè)蟾酥含量時(shí)，需要檢測(cè)華蟾酥毒基和脂蟾毒配基兩個(gè)成分。法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)YBZ08752008中，采用高效液相色譜法測(cè)定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，但其介紹的流動(dòng)相在實(shí)際使用中分離度較差，重現(xiàn)性也不是很穩(wěn)定。歷來(lái)文獻(xiàn)中也有對(duì)制劑中蟾酥含量測(cè)定的報(bào)道［1-2］，本文對(duì)天佛參口服液法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的流動(dòng)相進(jìn)行了調(diào)整，對(duì)柱溫進(jìn)行調(diào)節(jié)，使華蟾酥毒基和脂蟾毒配基能夠完全分離，且分離時(shí)間較合理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本法簡(jiǎn)便、快捷，準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可用于華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2487-1525-1500高效液相色譜儀。

1.2 試藥

華蟾酥毒基對(duì)照品、脂蟾毒配基對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；天佛參口服液（自制，批號(hào)0911141，0911161，0911181）；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、三氯甲烷、無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水乙醇為分析純；水為純化水；甲醇、乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry ShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相：乙腈-0.5%磷酸二氫鉀（38∶62）；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：296 nm；流速：1.0 mL·min－1；進(jìn)樣量：20μL。理論塔板數(shù)按華蟾酥毒基峰、脂蟾毒配基峰計(jì)算應(yīng)分別不低于4 000，實(shí)際測(cè)量值分別為7 893，8 920。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的華蟾酥毒基對(duì)照品、脂蟾毒配基對(duì)照品各適量，加甲醇配制成每1mL含華蟾酥毒基10μg、脂蟾毒配基50μg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品25 mL，置分液漏斗中，加水25 mL，混勻，加三氯甲烷提取5次（30，30，30，20，20 mL），合并三氯甲烷液，用氫氧化鈉溶液（0.1 mol·L－1）50 mL洗滌1次，棄去氫氧化鈉液，再用水50 mL洗滌1次，棄去水液，三氯甲烷液用適量無(wú)水硫酸鈉脫水，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方量，制備不含華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的空白樣品，照供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別取陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液各20μL，按照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處有一致的色譜峰，陰性溶液在與對(duì)照品溶液相同的保留時(shí)間處無(wú)吸收峰，見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品及供試品HPLC圖

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取華蟾酥毒基和脂蟾毒配基混合溶液3 m L，置同一25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣1，2，5，10，15，30，50μL，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積，以峰面積積分值對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸，求得回歸方程，華蟾酥毒基：Y＝1 000 000X－648.2，r＝0.999 0，表明華蟾酥毒基在0.013 9～0.695μg與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系；脂蟾毒配基：Y＝5 000 000X＋42 394，r＝0.999 5，脂蟾毒配基在0.021 0～1.052 5μg與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品溶液（0911141批），在0，4，12，18，24 h時(shí)分別進(jìn)樣5次，記錄峰面積，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，華蟾酥毒基成分與脂蟾毒配基成分的RSD分別為0.06%和0.31%。

2.8 精密度試驗(yàn)

取華蟾酥毒基和脂蟾毒配基對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣7次，記錄峰面積，結(jié)果表明華蟾酥毒基和脂蟾毒配基精密度良好，RSD分別為0.10%和0.06%。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取0911141批樣品，按上述色譜條件測(cè)定6次，樣品中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的總量為12.41μg·mL－1，華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的RSD值分別為0.17%和0.15%。

2.10 回收率試驗(yàn)

分別精密量取樣品（批號(hào)0911141）25 mL，共6份，分別精密加入對(duì)照品溶液（每1 mL含華蟾酥毒基0.011 6 mg，脂蟾毒配基0.042 1 mg）2，3，4 mL，混勻，加水至50 mL，混勻后，自“加三氯甲烷提取5次”始，按正文中擬定的方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，2。

表1 華蟾酥毒基回收率

表2 脂蟾毒配基回收率

2.11 樣品含量測(cè)定

分別取3批樣品，按上述方法測(cè)定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 天佛參口服液樣品中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量測(cè)定 ／mg·（100mL）－1

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

作者篩選了4種流動(dòng)相系統(tǒng)，（1）甲醇-水（65∶35），（2）乙腈-水（50∶50）［3］，（3）乙腈－0.5%磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.2）［4］，（4）乙腈－0.5%磷酸二氫鉀溶液（38∶62）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.5），并對(duì)流動(dòng)相的pH值進(jìn)行了考察，結(jié)果第4種流動(dòng)相系統(tǒng)分離效果好，峰形良好，且保留時(shí)間適中，故確定上述流動(dòng)相系統(tǒng)為本法的流動(dòng)相。

3.2 柱溫的選擇

通過(guò)在不同的柱溫條件下進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)柱溫40℃時(shí)分離度較好，分離時(shí)間適中，可保證在正常時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)任務(wù)。

3.3 提取次數(shù)的選擇

在前期試驗(yàn)過(guò)程中，取批號(hào)為0911141的樣品，按供試品溶液制備方法，分別以三氯甲烷提取3、4、5次，測(cè)定含量。樣品提取3次的峰面積明顯小于提取4、5次，而提取4次和5次的無(wú)明顯差別。由此確定樣品提取4次已基本提取完全，故提取次數(shù)定為4次。

本文用一個(gè)色譜系統(tǒng)同時(shí)測(cè)定兩個(gè)組分的含量，具有簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。因此，可以使用本法用于天佛參口服液中蟾酥含量的質(zhì)量控制。

［1］王京輝，金偉，金紅宇，等.高效液相色譜法測(cè)定蟾酥中有效成分的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，1998，23（11）：651.

［2］紀(jì)玲，王清華，叢保忠，等.高效液相色譜法測(cè)定牛黃消炎片中酯蟾毒配基的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，1998，4（1）：2-4.

［3］羅虹，李文，孫麗燕，等.PHLC法測(cè)定蟾麝救心丸中蟾酥的含量［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2005，22（3）：544.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：360.

Content Determination of Venenum Bufonis in Tianfushen Oral Solution by HPLC

Wang Fang，Zhang Qiuping，Wu Hanyu
（Changshu Leiyunshang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Changshu Jiangsu215500）

Objective：To establish a HPLCmethod to determine the contents of cinobufagin and resibufogenin for chief components of venenum bufonis in tianfushen oral solution.Methods：The method were determined by HPLC with Waters Symmetry ShieldTMRP18（4.6 mm×250 mm，5μm）as column，amixture of acetonitrile：0.5%potassium dihdyrogen phosphate（38∶62）asmobile phase，UV detector at 296nm and flow rate of 1.0mL·min－1.Results：The calibration curves are linear in the range of 0.013 9～0.695μg for cinobufagin（r＝0.999 0），0.021 0～1.052 5μg（r＝0.999 5）for resibufogenin，respectively.regression equations wereY＝1 000 000X－648.2 andY＝5 000 000X＋42 394，respectively.Conclusion：The method is simple，rapid and accurate，which can be used to determine chief components of venenum bufonis in tianfushen oral solution.

HPLC；Cinobufagin；Resibufogenin；Content determination

*張秋萍，E-mail：zqp922＠sina.com

2010-03-01）