張曉梅，竇文芳，許泓瑜，許正宏,2

1 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院 制藥工程研究室，無錫 214122

2 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122

細(xì)胞工廠的代謝網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控

谷氨酸棒桿菌SYPS-062合成L-絲氨酸的代謝通量分析

張曉梅1，竇文芳1，許泓瑜1，許正宏1,2

1 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院 制藥工程研究室，無錫 214122

2 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122

以一株由自然界篩選獲得的能夠利用糖質(zhì)原料直接產(chǎn) L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicumSYPS-062為研究對象，考察了一碳單元循環(huán)中的輔因子—葉酸和維生素B12對菌株生長、蔗糖消耗及L-絲氨酸生成的影響，同時(shí)對處于對數(shù)生長期的菌株進(jìn)行了代謝流量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加擾動(dòng)因子葉酸和維生素B12對磷酸戊糖途徑(HMP) 碳流影響較大，碳源主要用于細(xì)胞生長及合成能量，而流向目的產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸的碳流減少。同時(shí)在添加維生素B12時(shí)，增大了G3P節(jié)點(diǎn)的L-絲氨酸合成途徑的分流比，但造成三羧酸循環(huán) (TCA) 的流量不足，需要大量回補(bǔ)，從而限制了產(chǎn)物合成速率的進(jìn)一步提高。

谷氨酸棒桿菌，L-絲氨酸，一碳單元，代謝通量分析

Abstract:Corynebacterium glutamicumSYPS-062 was an L-serine producing strain stored at our lab and could produce L-serine directly from sugar. We studied the effects of cofactors in one carbon unit metabolism-folate and VB12on the cell growth, sucrose consumption and L-serine production by SYPS-062. In the same time, the metabolic flux distribution was determined in different conditions. The supplementation of folate or VB12enhanced the cell growth, energy synthesis, and finally increased the flux of pentose phosphate pathway (HMP), whereas the carbon flux to L-serine was decreased. The addition of VB12not only increased the ratio of L-serine synthesis pathway on G3P joint, but also caused the insufficiency of tricarboxylic acid cycle (TCA ) flux, which needed more anaplerotic reaction flux to replenish TCA cycle, that was an important limiting factor for the further increasing of the L-serine productivity.

Keywords:Corynebacterium glutamicum, L-serine, one carbon units, metabolic flux analysis

L-絲氨酸是生物體內(nèi)一種重要的中間代謝產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品領(lǐng)域[1]。L-絲氨酸的生產(chǎn)方法主要有蛋白水解法、化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法[2]。微生物和酶法均以甘氨酸及甘油酸鹽為前體，而直接利用糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的報(bào)道較為少見。Petra等最近分析研究了谷氨酸棒桿菌中 L-絲氨酸代謝途徑中的一些關(guān)鍵酶，首次構(gòu)建了產(chǎn) L-絲氨酸的基因工程菌，產(chǎn)量為86 mmol/L[3-5]；隨后為解決遺傳信息易丟失的問題，又構(gòu)建了葉酸缺陷型的基因工程菌C. glutamicum△pabABC△sdaA(pserACB)，L-絲氨酸產(chǎn)量可達(dá)346 mmol/L[6]。魏東等[7]對一株重組黃色短桿菌進(jìn)行誘變改良，篩選獲得色氨酸營養(yǎng)缺陷型的高產(chǎn)突變株，該菌株能以糖質(zhì)原料作為唯一碳源合成L-絲氨酸，但尚未見進(jìn)一步的研究報(bào)道。作者所在課題組從自然界中篩選得到一株能直接利用糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn) L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌C. glutamicumSYPS-062，并考察分析了6種維生素對L-絲氨酸積累的影響[8]，而野生型谷氨酸棒桿菌直接利用糖質(zhì)原料合成L-絲氨酸尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

近年來利用代謝通量分析的手段使目的氨基酸大量積累的例子在國內(nèi)外已有許多報(bào)道，張克旭等[9]建立了谷氨酸棒桿菌合成 L-色氨酸 (L-Try) 的代謝流量平衡模型，線性規(guī)劃得到L-色氨酸理想代謝流分布。Tomokazu等[10]對2株能夠合成谷氨酸的谷氨酸棒桿菌的代謝流作了比較，發(fā)現(xiàn)通過降低 α-酮戊二酸脫氫酶活性來提高谷氨酸產(chǎn)量效果明顯。Hua等[11]分析了不同溶氧水平對谷氨酸棒桿菌積累L-賴氨酸的影響。但到目前尚未見 L-絲氨酸代謝通量方面的研究，作者課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)一碳循環(huán)中的輔因子葉酸和維生素 B12對 L-絲氨酸生成的影響非常顯著，同時(shí)對生物量的積累有較大的促進(jìn)作用，因此本研究選擇葉酸和維生素B12作為擾動(dòng)因子，在不同條件下對C. glutamicumSYPS-062的L-絲氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行通量分析，定量研究該菌株細(xì)胞內(nèi)各代謝途徑之間的關(guān)系，具體分析了限制L-絲氨酸進(jìn)一步積累的因素，為下一步的菌種改良和發(fā)酵工藝優(yōu)化控制等奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

C. glutamicumSYPS-062為本研究室分離保藏，能利用糖質(zhì)原料直接合成L-絲氨酸。

1.2 培養(yǎng)基

保藏培養(yǎng)基 (g/L)：牛肉膏 10，蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 3，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基 (g/L)：玉米漿20，豆餅水解液20，葡萄糖 30，KH2PO41，尿素 1.5，MgSO40.5，(NH4)2SO420，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：蔗糖 60，(NH4)2SO430，KH2PO40.3，MgSO40.5，MnSO40.02，F(xiàn)eSO40.02，CaCO320，pH7.0。VB1、VB2、VB6、VB12、生物素和葉酸根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加。

1.3 培養(yǎng)方法

從新鮮斜面上接一環(huán)菌入種子培養(yǎng)基(30 mL/250 mL錐形瓶)，在30℃轉(zhuǎn)速110 r/min (往復(fù)式搖床) 下培養(yǎng)24 h后，以5% (V/V) 接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。搖瓶發(fā)酵裝液量為20 mL/250 mL錐形瓶，在30℃轉(zhuǎn)速110 r/min (往復(fù)式搖床) 下發(fā)酵96 h。

1.4 分析方法

1.4.1生物量的測定

發(fā)酵液用0.25 mol/L的鹽酸稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，測定562 nm處的光密度，按照1OD=0.27 g/L DCW，換算為菌體干重。

1.4.2L-絲氨酸和蔗糖濃度的測定

L-絲氨酸濃度采用安捷倫 1 100液相色譜儀測定。色譜柱：HypersilODS-C18 4 mm×125 mm；柱溫：40℃；體積流量：1.0 mL/min；檢測器：熒光檢測器；激發(fā)波長：340 nm；發(fā)射波長：450 nm；流動(dòng)相：20 mmol/L醋酸鈉∶乙醇∶乙腈= 1∶2∶2 (V/V)。蔗糖濃度采用間苯二酚法測定[12]。

1.4.3有機(jī)酸含量測定

HPLC分析法(HP1100)，色譜條件：ZORBAX SB C18，流動(dòng)相0.1 mol/L磷酸-磷酸二氫鉀緩沖液，進(jìn)樣量5 μL，紫外檢測波長為210 nm。

接種后和發(fā)酵結(jié)束后分別測定每個(gè)搖瓶的重量。分別將測得的濃度換算為恢復(fù)成原重后的濃度(文中出現(xiàn)的均為換算后的濃度)。

1.5C. glutamicum的L-絲氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

綜合文獻(xiàn)分析[13]，本研究基于以下原則或假設(shè)建立代謝網(wǎng)絡(luò)：

1) 早期的許多研究都報(bào)道C. glutamicum及其相關(guān)菌株胞內(nèi)含有完整的EMP和TCA循環(huán)及磷酸戊糖途徑 (PP途徑)[14]。Vallino等的研究表明，TCA循環(huán)是谷氨酸菌屬發(fā)酵過程中的主要氧化途徑[15]；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)是TCA循環(huán)的主要回補(bǔ)反應(yīng)。基于此，作者在構(gòu)建C. glutamicumSYPS-062的代謝網(wǎng)絡(luò)時(shí)未考慮乙醛酸途徑；以葡萄糖為底物的谷氨酸細(xì)菌胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn) ED途徑[16]，因此本代謝網(wǎng)絡(luò)未考慮ED途徑。

2) 由于利用菌株SYPS-062生產(chǎn)L-絲氨酸屬于偶聯(lián)型發(fā)酵過程，因此選擇在L-絲氨酸快速合成的階段作分析，在該階段細(xì)胞同樣增殖迅速，因此生物量的積累是不可忽略的；細(xì)胞組成采用Vallino and Stephanopoulos測得的數(shù)據(jù)：C 47.6%；H 6.46%；O 31.0%；N 11.8%；灰分3.02%。

3) NADPH、NADH、ATP供需平衡，即反應(yīng)途徑中消耗的與EMP途徑、HMP 途徑、TCA循環(huán)產(chǎn)生的總數(shù)相等。

4) 按照固定比例進(jìn)行的反應(yīng)以及無分支點(diǎn)的中間反應(yīng)，可簡化為一個(gè)反應(yīng)方程。

5) 于不同發(fā)酵階段對可能的有機(jī)酸代謝副產(chǎn)物如乙酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、乳酸、檸檬酸、丙酸、丁酸及甲酸進(jìn)行了檢測 (數(shù)據(jù)未列出)，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)發(fā)酵過程中，始終未檢測到乙酸、乳酸、丙酸、丁酸、甲酸，因此，在代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建中不考慮這幾種物質(zhì)的合成途徑，丙酮酸、α-酮戊二酸和檸檬酸在細(xì)胞外有微量積累，但在L-絲氨酸大量合成時(shí)期基本不變化，因此將這3種物質(zhì)視為中間代謝產(chǎn)物，不向胞外積累。

1.6C. glutamicum的 L-絲氨酸代謝流平衡模型的建立

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以及以上分析，L-絲氨酸生物合成的代謝網(wǎng)絡(luò)見圖 1，各步反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量方程見附錄。

1.7 代謝流研究的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)和代謝方程組的求解

代謝網(wǎng)絡(luò)分析理論的基本原理如下：1) 根據(jù)細(xì)胞生化特征確定約束條件。2) 準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)假設(shè)(Pseudo-steady-state)：假設(shè)細(xì)胞內(nèi)的中間代謝物均處于準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)，即其濃度變化速率為 0。3) 通過測定胞外代謝產(chǎn)物的積累速率計(jì)算發(fā)酵過程代謝流量，構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)。

對于代謝網(wǎng)絡(luò)中的每個(gè)組分，都符合質(zhì)量守恒定律，即組分的積累速率等于該組分的生成減去消耗速率，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

式中，xj(t)：第j步反應(yīng)的反應(yīng)速率[mmol/(L·h)]；xk(t)：第k步反應(yīng)的反應(yīng)速率[mmol/(L·h)]；αj：第j步反應(yīng)的反應(yīng)計(jì)量系數(shù)；αk：第k步反應(yīng)的反應(yīng)計(jì)量系數(shù)；ri(t)：中間代謝物i的積累速率[mmol/(L·h)]。

將代謝網(wǎng)絡(luò)中涉及的m個(gè)組分的物料平衡式聯(lián)立，就得到如下代謝網(wǎng)絡(luò)平衡矩陣：

式 (2) 中的A是n×k階的代謝反應(yīng)行列矩陣，r是k×1階的反應(yīng)速度的向量。其中n表示簡化后代謝網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)；而k則表示反應(yīng)速度的總個(gè)數(shù)，它是簡化代謝網(wǎng)絡(luò)模型的反應(yīng)式個(gè)數(shù)與著眼物質(zhì)速度式的個(gè)數(shù)之和。如果k個(gè)總反應(yīng)速度中有m個(gè)是在線可測的，對應(yīng)的可測速度向量為rm，而其余不可測速度向量為rc，則式(2)可以分解成下列形式：

這樣，不可測速度向量為rc就可以利用式(4)，由可測速度向量rm和代謝反應(yīng)行列矩陣A來進(jìn)行推定：

r的元素列于附錄，由r元素可得節(jié)點(diǎn)數(shù)為 34個(gè)，方程數(shù)26個(gè)，方程自由度為8，需要測得8個(gè)速率方可確定代謝網(wǎng)絡(luò)中的流量分布，在L-絲氨酸的發(fā)酵過程中，離線檢測的胞外代謝物為蔗糖、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、生物量的濃度，對時(shí)間微分得到各物質(zhì)的積累速率，即rm，將這些速率帶入式 (4)，使用 PC-Matlab軟件對進(jìn)行矩陣運(yùn)算，可求得代謝流分布。

圖1C. glutamicumSYPS-062 L-絲氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)模型Fig.1 The Metabolic network model of L-serine inC. glutamicumSYPS-062. Suc: sucrose; Suc-6-P: sucrose-6-phosphate; G-6-P:glucose-6-phosphate; F-6-P: fructose-6-phosphate; GAP: glyceradehyde-3-phosphate; G3P: 3-phosphoglycerate; PEP:phosphoenolpyruvate; Pyr: pyruvate; AccoA: acetyl coenzyme A; IsoCit: isocitrate; α-KG: α-ketoglutarate; OAA: oxaloacetate; Asp:L-aspartate; Met: L-methionine; Pro: L-proline; Val: valine; CHO: chorismic acid; Phe: L-phenylalanine; ser(i): L-serine(intracellular);ser(e): L-serine(extracellular); Gly: glycine; THF: tetrahydrofolic acid; METHF: methylenetetrahydrofolic acid; MYTHF:methyltetrahydrofolic acid; ser(i): L-serine(intracellular); ser(e): L-serine(extracellular); Glu: glutamate; Pro: praline; NADPH:nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; NADH; nicotinamide adenine dinucleotide-re-duced; NADP: nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate; NAD: nicotinamide-adenine dinucleotide; ATP: adenosine triphosphate; ADP: adenosine diphosphate; E4P:erythrose-4-phosphate; R5P: ribose-5-phosphate; X5P: xylulose-5-phosphate; Ribu5P: ribulose-5-phosphate.

2 結(jié)果與分析

2.1C. glutamicumSYPS-062在不同條件下發(fā)酵過程比較

作者課題組前期研究表明，葉酸和 VB12對C. glutamicumSYPS-062發(fā)酵影響最為顯著，對L-絲氨酸積累有很大的促進(jìn)作用[8]，因此選擇單獨(dú)添加40 μg/L葉酸和0.4 μg/L VB12作為擾動(dòng)因子，考察其對L-絲氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，深入剖析這兩種維生素的影響機(jī)制。

圖2為不同條件下菌株C. glutamicumSYPS-062的發(fā)酵過程參數(shù)，從圖2可以看出添加葉酸和VB12對菌體生長及L-絲氨酸積累的顯著促進(jìn)作用。其中0～48 h為延滯期，在這幾種條件下菌體生長都非常緩慢，糖耗也非常少，僅為3 g/L左右；48～96 h為細(xì)胞的對數(shù)生長期，此時(shí)菌體增殖的速率達(dá)到最大值，L-絲氨酸的積累也較迅速，葉酸和VB12也表現(xiàn)出對菌體生長及L-絲氨酸積累的顯著促進(jìn)作用，其中VB12的促進(jìn)作用非常顯著，葉酸次之。之后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體增長速度明顯下降，而對于L-絲氨酸的積累，則在初始條件下，仍有緩慢的增加，但在分別添加兩種擾動(dòng)的情況下，L-絲氨酸的積累量基本不變，或有一定的下降。這個(gè)結(jié)果表明，添加這兩種擾動(dòng)，不但能夠提高產(chǎn)量，而且會(huì)在一定程度上提前結(jié)束發(fā)酵，縮短發(fā)酵周期。

在不同的培養(yǎng)條件下，蔗糖的消耗情況總趨勢大體一致，但消耗速度受擾動(dòng)因子的影響很大。圖2D表示了產(chǎn)物 L-絲氨酸對蔗糖轉(zhuǎn)化率也同樣受到擾動(dòng)的影響，結(jié)果顯示隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)化率不斷升高，但初始條件下，增長幅度較添加擾動(dòng)的情況較小。結(jié)合以上分析，選擇在L-絲氨酸積累速度最快的細(xì)胞對數(shù)生長期后期 (72～88 h) 進(jìn)行代謝通量分析。

2.2C. glutamicumSYPS-062胞內(nèi)的代謝流量分析

細(xì)胞代謝是由一個(gè)受到精密調(diào)控而又彼此協(xié)調(diào)的代謝網(wǎng)絡(luò)來完成的，通常情況下，細(xì)胞對不同的環(huán)境條件會(huì)有不同的反應(yīng)，通過自身協(xié)調(diào)來使細(xì)胞代謝盡可能維持最優(yōu)的資源配置。表 1比較了在不同條件下C. glutamicumSYPS-062發(fā)酵72 ～88 h的碳代謝流通量分配。從表 1可以看出，這兩種擾動(dòng)改變了細(xì)胞內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)流量分布，即產(chǎn)生了有效的刺激。以下對代謝網(wǎng)絡(luò)分布作具體分析。

2.2.1C. glutamicum SYPS-062在不同條件下HMP途徑的流量分配

磷酸戊糖途徑 (HMP途徑) 是合成細(xì)胞物質(zhì)的重要途徑，對SYPS-062的代謝網(wǎng)絡(luò)模型而言，HMP途徑具有3方面的作用：1) 合成細(xì)胞物質(zhì)，在該模型中，5-磷酸核糖、4-磷酸赤蘚糖都是對生物量積累貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)；2) 合成還原力，以供細(xì)胞合成產(chǎn)物，積累細(xì)胞物質(zhì)；3) 合成該菌株發(fā)酵過程中的重要的代謝副產(chǎn)物脯氨酸。結(jié)果顯示 HMP(r13) 在初始條件下分流較添加擾動(dòng)的情況分流少，即體現(xiàn)出在該條件下，細(xì)胞繁殖不活躍，生長不旺盛，對碳流需求不大。而在添加擾動(dòng)的情況下，尤其是添加VB12，細(xì)胞增殖迅速，HMP途徑的流量增大 (r13=64)，這個(gè)結(jié)果再次證明了葉酸和 VB12對促進(jìn)細(xì)胞生長方面的有效影響。

圖2 不同發(fā)酵條件下的參數(shù)曲線Fig.2 The parametric curves in different fermentation condition.

表1 不同條件對C. glutamicumSYPS-062中碳代謝流量的影響Table 1 Effect of different condition on the distribution of carbon flux inC. glutamicumSYPS-062

2.2.2磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 節(jié)點(diǎn)流量分析

PEP在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PPC) 的催化下轉(zhuǎn)化為草酰乙酸 (OAA) (r12)，這個(gè)反應(yīng)在C.glutamicum的代謝過程中也占有極其重要的地位，因?yàn)樗窃擃惣?xì)菌在較低碳源濃度的培養(yǎng)基上生長時(shí)的唯一一條磷酸烯醇式丙酮酸羧化反應(yīng)(Anaplerotic reaction，r12)，即碳流較少時(shí)的唯一一條進(jìn)入TCA循環(huán)的回補(bǔ)途徑，在3種不同條件下，PEP節(jié)點(diǎn)流量分布如圖3所示。

在初始條件下，PEP回補(bǔ)途徑的流量最少，而添加VB12時(shí)最大，這個(gè)結(jié)果體現(xiàn)了添加擾動(dòng) (尤其是VB12) 促進(jìn)L-絲氨酸積累，提高生物量的合成，從而導(dǎo)致了碳流在進(jìn)入TCA循環(huán)之前被大量分流，TCA循環(huán)碳流不足，需要通過大量回補(bǔ)途徑補(bǔ)充碳流。這個(gè)結(jié)果也可從TCA循環(huán)中r11的數(shù)據(jù)體現(xiàn)出來，在添加 VB12的情況下，該步反應(yīng)的流量僅為14.4，而初始條件流量為151.7。如果進(jìn)一步增大生物量積累速度，產(chǎn)物積累速度，則會(huì)導(dǎo)致TCA循環(huán)嚴(yán)重不足，限制正常的生理活動(dòng)，因此，TCA循環(huán)碳流不足成為進(jìn)一步提高產(chǎn)量的瓶頸因素。

圖3 不同發(fā)酵條件下PEP節(jié)點(diǎn)代謝流量分布情況Fig 3 Metabolic flux distribution of PEP node in different fermentation condition.

2.2.33-磷酸甘油酸 (G3P) 節(jié)點(diǎn)流量分析

G3P節(jié)點(diǎn)是 L-絲氨酸合成途徑中第一個(gè)反應(yīng)物，該節(jié)點(diǎn)的分流比在很大程度上體現(xiàn)了單位底物L(fēng)-絲氨酸的合成效率。由圖 4知，在初始條件下，ser/G3P的分流比 (r18/r5) 為 11%，添加葉酸和VB12的情況下，分別為14%和22%，這個(gè)結(jié)果體現(xiàn)出VB12對G3P節(jié)點(diǎn)流量的重新分配非常有效，而葉酸相比較對該節(jié)點(diǎn)影響較小。因此，葉酸和VB12雖然都促進(jìn)L-絲氨酸發(fā)酵，但作用機(jī)理是不同的。

圖4 不同發(fā)酵條件下G3P節(jié)點(diǎn)代謝流量的分布情況Fig.4 Metabolic flux distribution of G3P node in different fermentation condition.

2.2.4C. glutamicum SYPS-062在不同條件下合成能量分析

C. glutamicumSYPS-062代謝網(wǎng)絡(luò)中反應(yīng)33中的ATP為網(wǎng)絡(luò)中正常進(jìn)行時(shí)所需要另外合成的以補(bǔ)充細(xì)胞生理代謝的ATP，由表2可見，ATP通量與L-絲氨酸的積累呈負(fù)相關(guān)，ATP通量高時(shí)，L-絲氨酸合成通量低；反之，ATP通量低時(shí)，L-絲氨酸合成通量則高。這個(gè)結(jié)果體現(xiàn)了在添加擾動(dòng)的情況下，尤其是添加VB12對能量合成有促進(jìn)作用，即細(xì)胞不但加速生長，快速合成產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸，并且通過正常的自身代謝產(chǎn)生了較多的能量，以維持細(xì)胞正常的生理代謝活動(dòng)，導(dǎo)致所需要另外合成的能量減少。

表2 不同條件下L-絲氨酸合成通量與ATP通量的關(guān)系Table 2 Relationship between L-serine production and biomass flux and ATP generation under different conditions

2.2.5C. glutamicum SYPS-062不同條件下合成的副產(chǎn)物的比較

由表 3可見，L-脯氨酸是合成速率最大的副產(chǎn)物，L-蛋氨酸次之，如能從遺傳角度或發(fā)酵控制方面使副產(chǎn)物生成減少，可以達(dá)到代謝流遷移的目的，從而增大目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸的積累。這幾種副產(chǎn)物中，甘氨酸與L-絲氨酸代謝關(guān)系密切，甘氨酸是L-絲氨酸的下一級代謝產(chǎn)物，其流量隨著L-絲氨酸合成流量的增大而增大是顯而易見的，但添加葉酸雖然L-絲氨酸的合成流量沒有達(dá)到最大值，但甘氨酸的合成速率達(dá)到最大值，這是因?yàn)槿~酸是該反應(yīng)的輔因子，對這步轉(zhuǎn)化有一定的促進(jìn)作用。

表3 不同發(fā)酵條件對副產(chǎn)物合成的影響Table 3 Synthesis rate of byproducts under different conditions

2.2.6C. glutamicum SYPS-062在不同條件下一碳循環(huán)的探討

一碳循環(huán)在微生物體內(nèi)非常重要，參與許多氨基酸、核酸、脂類的合成，對細(xì)胞生理行為影響非常大。在本模型中，由于目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸是一碳單元的前體，是微生物體內(nèi)重要的一碳單元的來源，所以構(gòu)建了一碳單元的部分循環(huán)路徑，即通過r29，L-絲氨酸降解為甘氨酸和一碳單元，再由四氫葉酸(THF) 作為載體攜帶一碳單元 (r30)，生成甲叉四氫葉酸 (METHF) (r31)，后者被氧化為甲基四氫葉酸(MYTHF) 后釋放出一碳單元。本模型中，包括一個(gè)重要的需要一碳的反應(yīng)，即 r24：由天門冬氨酸(Asp) 生成甲硫氨酸 (Met)。雖然由于模型具有一定的簡化，不能囊括所有一碳單元參與的反應(yīng)，但單就目前這兩個(gè)生成及消耗一碳的反應(yīng)來看，仍然具有一定的規(guī)律性：即在初始條件下，生成的一碳單元的流量 (r30) 明顯較少，添加擾動(dòng)后，生成一碳的流量顯著提高，雖然不能對生成甲硫氨酸的流量(r27) 和 MYTHF釋放一碳的途徑作定量的關(guān)系描述，但添加擾動(dòng)同樣使甲硫氨酸的合成速率顯著提高。尤其添加VB12時(shí)，達(dá)到最大值，這是由于VB12是生成甲硫氨酸的過程中甲基轉(zhuǎn)移酶的輔因子，會(huì)促進(jìn)一碳單元的轉(zhuǎn)移與利用。

3 討論

采用代謝網(wǎng)絡(luò)分析方法對C. glutamicumSYPS-062進(jìn)行研究表明，擾動(dòng)因子葉酸和 VB12影響了HMP途徑的分流，更多的碳流流入HMP途徑產(chǎn)生更多的能量及細(xì)胞物質(zhì)，導(dǎo)致了細(xì)胞生長旺盛，增殖迅速，同時(shí)使流向目的產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸的分流減少。何寧等[17]對利用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)生物絮凝劑REA-11的代謝網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行通量分析，結(jié)果與本研究一致。

對 G3P節(jié)點(diǎn)分析得到 VB12可以顯著提高 L-絲氨酸合成途徑的分流比，而葉酸對該節(jié)點(diǎn)分流比的提高較小，說明雖然這兩種輔因子都可以提高L-絲氨酸合成途徑的流量。但通過對PEP節(jié)點(diǎn)的比較分析發(fā)現(xiàn)，添加VB12時(shí)，由于大量碳流進(jìn)入L-絲氨酸合成途徑，同時(shí)生物量也大量積累，致使TCA循環(huán)中碳流不足，r11流量僅為14.4，需要大量回補(bǔ)，已經(jīng)限制了進(jìn)一步的提高合成L-絲氨酸的速度，成為進(jìn)一步提高產(chǎn)量的一個(gè)瓶頸因素。

由于在對數(shù)生長中后期產(chǎn)物合成速率達(dá)到最大值，此時(shí)培養(yǎng)基的蔗糖已有很大程度上的消耗 (圖2C)，因此可以考慮在后期采用補(bǔ)糖策略，提供充足的碳源，一定程度上緩解這種矛盾。同時(shí)還應(yīng)看到，雖然L-絲氨酸屬于I型發(fā)酵，產(chǎn)物合成與菌體生長有密切的關(guān)系，但細(xì)胞的快速生長繁殖對碳流的消耗同樣很大，尋求高產(chǎn)量和高細(xì)胞濃度之間的平衡點(diǎn)，提高單位菌體的產(chǎn)酸率是進(jìn)一步提高產(chǎn)量所需要慎重考慮的。

一碳循環(huán)是微生物的一個(gè)重要的循環(huán)，并且與L-絲氨酸的積累關(guān)系密切，本模型對一碳循環(huán)作了較大的簡化，得知在添加葉酸和VB12的情況下，一碳單元利用更充分、有效，尤其在添加VB12時(shí)，對HMP途徑和合成甲硫氨酸這兩個(gè)需要一碳的反應(yīng)有較顯著的促進(jìn)。關(guān)于一碳循環(huán)更多的信息，沒有辦法從本模型中分析得到，有待于進(jìn)一步的研究。

附錄：化學(xué)計(jì)量學(xué)方程式

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Metabolic flux analysis of L-serine synthesis byCorynebacterium glutamicumSYPS-062

Xiaomei Zhang1, Wenfang Dou1, Hongyu Xu1, and Zhenghong Xu1,2

1Laboratory of Pharmaceutical Engineering,School of Medicine and Pharmaceutics,Jiangnan University,Wuxi214122,China
2Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi214122,China

Received:May 26, 2010;Accepted:August 26, 2010

Supported by:State Key Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB707804), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA020104), Program for New Century Excellent Talents in University of China (No. NCET-07-0380).

Corresponding author:Zhenghong Xu. Tel/Fax: +86-510-85918206; E-mail: zhenghxu@163.com

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2007CB707804)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2006AA020104)，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃 (No. NCET-07-0380) 資助。