許麗梅，劉丑生，張利平，王志剛，韓旭，李曉霞，常爽

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730070

2 全國(guó)畜牧總站 畜禽牧草種質(zhì)資源保存利用中心，北京 100193

3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002

動(dòng)物及獸醫(yī)生物技術(shù)

山羊群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析

許麗梅1，劉丑生2，張利平1，王志剛2，韓旭2，李曉霞1，常爽3

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730070

2 全國(guó)畜牧總站 畜禽牧草種質(zhì)資源保存利用中心，北京 100193

3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002

為了保護(hù)和合理利用我國(guó)地方山羊品種遺傳資源提供理論基礎(chǔ)，本研究利用國(guó)際農(nóng)糧組織和國(guó)際家畜研究所推薦的10對(duì)微衛(wèi)星引物，結(jié)合熒光標(biāo)記PCR，檢測(cè)了中國(guó)9個(gè)地方山羊品種和1個(gè)引進(jìn)山羊品種的遺傳多樣性。所研究的10個(gè)品種中7個(gè)呈現(xiàn)出高度多態(tài)，3個(gè)呈現(xiàn)出中度多態(tài)。并共檢測(cè)到119個(gè)等位基因，有效等位基因數(shù)在1.4641～9.2911之間，座位平均雜合度在0.2618～0.7672之間，品種平均雜合度在0.5196～0.7024之間，其中SRCRSP23位點(diǎn)和河西絨山羊 (HXR) 平均雜合度最高。聚類關(guān)系 (NJ和UPGMA) 和主成分分析結(jié)果與其起源、育成歷史及地理分布基本一致。

山羊，微衛(wèi)星，遺傳多樣性

Abstract:Fluorescence PCR was applied to investigate the genetic diversities of 9 indigenous Chinese goat breeds and 1 exotic breed with 10 microsatellite DNA markers recommended by the Food and Agriculture Organization of the United Nations and the International Livestock Research Institute of Animal Genetics, which provide data for the preservation and utilization of indigenous goat breeds genetic resource. We found that the 7 breeds were high polymorphic while 3 breeds were moderate polymorphic. We also detected 119 alleles, and the effective allele number ranged from 1.4641 to 9.2911. The average heterozygosity of loci and breeds respectively varied from 0.2618 to 0.7672 and from 0.5196 to 0.7024. As well as SRCRSP23 site and Hexi cashmere goat had the highest average heterozygosity. Then we analyzed the phylogenetic trees (NJ and UPGMA), and found both of them were generally in accordance with their original breeding history and localities.

Keywords:goat, microsatellite, genetic diversity

山羊?yàn)榉植挤秶鷱V、產(chǎn)品類型多、適應(yīng)性較強(qiáng)的物種，因此其表現(xiàn)出了豐富的遺傳多樣性。我國(guó)地方山羊品種資源十分豐富，根據(jù)2004年《中國(guó)畜禽遺傳資源狀況》，我國(guó)山羊品種為 50個(gè)，地方品種有43個(gè)[1]。但近年來(lái)隨著國(guó)外優(yōu)良品種的大量引入、生態(tài)環(huán)境的逐漸惡化，我國(guó)許多地方固有品種處于瀕?；?yàn)l臨滅絕狀態(tài)。對(duì)于山羊這種幾千年來(lái)持續(xù)馴養(yǎng)的家畜物種，其所攜帶的優(yōu)良基因一旦消失，無(wú)論是從種質(zhì)資源保護(hù)的深遠(yuǎn)意義，還是從社會(huì)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益考慮，都將是無(wú)法挽回的損失[2-4]。本研究利用10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，結(jié)合熒光引物PCR技術(shù)，利用ABI3130XL自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行基因型判定，對(duì)10個(gè)山羊品種進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，探討品種內(nèi)和品種間的遺傳多樣性和遺傳分化關(guān)系，旨在為我國(guó)地方山羊種質(zhì)資源的保護(hù)和合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本

10個(gè)山羊品種共計(jì)447個(gè)個(gè)體，樣品具體信息見(jiàn)表 1。本實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)樣本均由農(nóng)業(yè)部全國(guó)畜牧獸醫(yī)總站畜禽牧草種質(zhì)資源保存利用中心提供。

1.2 試劑及器材

pBR322/MspⅠ購(gòu)自北京華美生物工程公司；普通下游引物、rTaq酶購(gòu)自大連寶生物技術(shù)有限公司；全血基因組提取試劑盒購(gòu)自 TIANGEN公司；ABI3130XL測(cè)序儀、熒光引物購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 (ABI)，引物具體信息見(jiàn)表2。

表1 樣品采集信息Table 1 Sample information

表2 10個(gè)微衛(wèi)星座位信息Table 2 Information of 10 microsatellite loci

1.3 血樣處理及基因組DNA提取

將冷凍的血樣在20℃水浴中解凍，用全血基因組提取試劑盒提取 DNA，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

1.4 PCR體系及條件

PCR 反應(yīng)體系為：10×buffer 1.5 μL，Mg2+1.2～1.5 μL，引物 0.2～0.5 μL，dNTPs 1.2～1.5 μL，rTaq酶0.3 μL，ddH2O補(bǔ)足至15 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，50℃～61℃退火1 min，72℃延伸1 min，30～36個(gè)循環(huán)；72℃延伸60 min；4℃保存。

1.5 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

PCR 擴(kuò)增后，先取7 μL產(chǎn)物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法檢測(cè)。然后再用ABI3130XL 測(cè)序儀進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsatellite Toolkitve version 3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)格式的轉(zhuǎn)化；利用 GENEPOP軟件進(jìn)行 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)；利用POPGENE軟件計(jì)算等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)等；利用 DISPAN軟件構(gòu)建NJ和UPGMA系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)[5-6]；利用MVSP軟件進(jìn)行群體分化成分分析。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

微衛(wèi)星DNA本身是選擇中性的，不受選擇的壓力，因此在一個(gè)理想群體中各等位基因在群體中的分布頻率應(yīng)該是穩(wěn)定的[7]。利用 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表3 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)各座位P值Table 3 ThePvalue of every locus in Hardy-Weinberg

表4 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)各群體P值Table 4 ThePvalue of every population in Hardy-Weinberg

2.2 等位基因的檢測(cè)及其平均雜合度和平均多態(tài)信息含量

本實(shí)驗(yàn)研究10個(gè)山羊群體的10個(gè)微衛(wèi)星等位基因數(shù)據(jù)都是通過(guò) ABI3130XL測(cè)序儀分析獲得(具體座位信息見(jiàn)表2)，數(shù)據(jù)用GeneMapper軟件分析。ABI3130XL檢測(cè)的部分微衛(wèi)星座位結(jié)果見(jiàn)圖1(A、B)。

利用 Nei[8-9]公式，根據(jù)各微衛(wèi)星座位等位基因頻率，計(jì)算各位點(diǎn)的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、期望雜合度和平均雜合度 (表5)。

圖1 座位INRA023雜合子 (A) 和座位INRABERN 185純合子 (B) 的ABI3130XL檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection of loci INRA023 He (A) and loci INRABERN185 Ho (B) on ABI313OXL.

表5 各位點(diǎn)的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、期望雜合度、平均雜合度Table 5 Na/Ne/Exp-He/Average He of all loci

2.3 群體間的遺傳距離

用Dispan軟件計(jì)算出各品種間的遺傳距離，見(jiàn)表6。

2.4 10個(gè)山羊品種的聚類分析

利用Dispan軟件構(gòu)建Nj和UPGMA系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果如圖2A、2B所示。依圖2A所示，XJ和HXR聚到一起，再和CDM聚到一起；SNB和FQ先聚到一起，然后再和CDM、HXR、XJ聚為一類；LL和JC先聚到一起，然后和MG聚到一起，再和BJ聚為一類；最后是對(duì)照品種BE。依圖2B所示，XJ和HXR聚到一起，再和CDM聚到一起，隨后依次和 SNB、BJ、FQ先聚為一類；LL和 MG先聚到一起，然后再和 JC聚到一起；最后是對(duì)照品種 BE。兩種聚類分析方法得到的聚類結(jié)果基本一致。

表6 10個(gè)山羊品種間的遺傳距離Table 6 Genetic distance between ten goat breeds

2.5 群體間遺傳分化的主成分分析

群體間遺傳分化是研究多個(gè)群體間在多個(gè)標(biāo)記座位上的差異性，具有多變量的特征，因而通過(guò)主成分分析可以揭示群體間遺傳分化程度并反映群體間的遺傳關(guān)系[10-12]。利用MVSP軟件對(duì)10個(gè)山羊群體進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖3所示，其中第1主成分、第2主成分、第3主成分分別占總變異的31.42%、25.52%和11.77%。

圖2 10個(gè)山羊品種的DA/NJ聚類圖 (A) 和DA/UPGMA聚類圖 (B)Fig.2 DA/NJ tree (A) and DA/UPGMA tree (B) among 10 goat breeds.

圖3 10個(gè)山羊品種群體間遺傳分化的第1主成分、第2主成分、第3主成分散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of showing the first, the second and the third principal components of genetic differentiation among 10 goat breeds.

3 結(jié)論

3.1 Hardy-Weinberg平衡

根據(jù)Hardy-Weinberg定律，在一個(gè)沒(méi)有選擇、突變和遷移的隨機(jī)大群體中，基因頻率和基因型頻率在世代之間保持不變[1]。群體遺傳不平衡是生物體在長(zhǎng)期自然進(jìn)化過(guò)程中形成的群體特征，是遺傳資源評(píng)價(jià)、經(jīng)濟(jì)性狀標(biāo)記等研究中的重要內(nèi)容。在生態(tài)系統(tǒng)中，基因的流動(dòng)遵循Hardy-Weinberg定律，但由于基因突變、選擇和遺傳漂變等多種因素的作用，Hardy-Weinberg平衡往往被打破，造成基因頻率和基因型頻率的非隨機(jī)分布 (即遺傳不平衡)，其中選擇在這一過(guò)程中發(fā)揮主要作用[13]。選擇包括人工選擇和自然選擇，同時(shí)由于動(dòng)物個(gè)體的體質(zhì)差異，自由交配不等于隨機(jī)交配。本研究中的大部分群體處于不平衡狀態(tài)，利用P值的無(wú)偏估測(cè)對(duì)各群體和各座進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)10個(gè)群體只在座位OARAE54(P=0.2161) 和 SRCRSP9 (P=0.4196) 上處于平衡狀態(tài)，而在其他座位都不同程度地偏離平衡；除CDM(P=0.2415)、JC (P=0.8236) 處于平衡狀態(tài)，其他群體均處于哈溫不平衡。出現(xiàn)這種情況的原因首先可能與樣品的采集有關(guān)，主要是由于人工不能作到隨機(jī)選擇。其次可能與樣本含量有關(guān)，樣本含量是誤差的決定因素。要把取樣誤差降低到統(tǒng)計(jì)學(xué)所允許的范圍之內(nèi)，必須要有一個(gè)足夠大的樣本。Barker等[14]提出每個(gè)品種應(yīng)分析25個(gè)個(gè)體樣品，如果樣本含量達(dá)到50個(gè)，則能夠彌補(bǔ)可能的失誤。在本實(shí)驗(yàn)中平均每個(gè)群體有40個(gè)左右，基本滿足以上條件，研究結(jié)果可以代表整個(gè)群體的全部遺傳信息，故可以排除這點(diǎn)影響。最后可能與群體的繁育方式有關(guān)，由于地方品種公畜數(shù)量有限和地域的限制，長(zhǎng)時(shí)間的自由交配導(dǎo)致群體遺傳不平衡。

3.2 群體遺傳多樣性

多態(tài)信息含量和平均雜合度是群體內(nèi)遺傳變異的量度，可以用來(lái)描述微衛(wèi)星座位的變異程度[15-16]。本實(shí)驗(yàn)的10個(gè)山羊群體均表現(xiàn)出了多態(tài)性，平均多態(tài)信息含量大于0.5，其中HXR多態(tài)信息含量高達(dá)0.666，然后依次是XJ、CDM、BJ、SNB、JC、BJ、LL、FQ，最低的為 BE多態(tài)信息含量為 0.471，平均雜合度的結(jié)果與多態(tài)信息含量一致。10個(gè)位點(diǎn)中TCRVB6等位基因數(shù)最多為19個(gè)，等位基因數(shù)目最少的座位是ETH10，檢測(cè)到6個(gè)。10個(gè)群體平均有效等位基因數(shù)在 4.3～2.4之間，HXR平均有效等位基因數(shù)最多為4.3個(gè)。

本實(shí)驗(yàn)的群體遺傳多樣性量度的范圍與國(guó)內(nèi)其他研究結(jié)果稍有差異，狄冉[3]報(bào)道新疆山羊平均雜合度為 0.7049，多態(tài)信息含量為0.6584，HXR平均雜合度為 0.6052，多態(tài)信息含量為 0.5587；王杰等[17]用10個(gè)微衛(wèi)星檢測(cè)JC平均雜合度為0.7739，多態(tài)信息含量為 0.7352。這是由于本實(shí)驗(yàn)所采用的微衛(wèi)星位點(diǎn)與其他研究不同造成的。

在本實(shí)驗(yàn)中新疆山羊和河西絨山羊都表現(xiàn)了豐富的遺傳多樣性，這可能是由于其產(chǎn)區(qū)的地理環(huán)境復(fù)雜，長(zhǎng)期不定向培育和不斷引進(jìn)其他品種雜交造成的結(jié)果[18]。新疆山羊在新疆各地均有分布，是肉、毛、絨、乳兼用的地方品種，也有可能成就其豐富的遺傳多樣性。而且新疆和河西走廊這些地方皆位于古絲綢之路，中亞地區(qū)的山羊品種被引入是可能的。波爾山羊的遺傳多樣性較低，主要是由于采集數(shù)量較少；另外波爾山羊繁育歷史悠久，是世界上最優(yōu)秀的肉用山羊品種，是優(yōu)良公羊的重要品種來(lái)源，作為終端父本能顯著提高雜交后代的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)肉性能，國(guó)內(nèi)繁育的波爾山羊數(shù)量有限，近交現(xiàn)象比較嚴(yán)重。

3.3 遺傳距離和聚類分析

遺傳距離的度量對(duì)品種間遺傳變異提供了一個(gè)最佳的有效而客觀的描述[19]。本研究采用 DA、DS分別構(gòu)建NJ樹(shù)、UPGMA樹(shù)和計(jì)算群體間遺傳距離，并采用主成分分析進(jìn)行聚類分析。Takezaki等[20]認(rèn)為在物種內(nèi)群體間的遺傳變異 DA是獲得準(zhǔn)確系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的最有效方法；而 DS用于估計(jì)群體分化時(shí)間上為最優(yōu)。狄冉[3]也證明了 DA用來(lái)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的準(zhǔn)確性。另外，本研究中NJ聚類圖自檢值相對(duì)較低，與 UPGMA聚類圖略有差異。由 DA構(gòu)建的UPGMA聚類圖較符合樣本的地理分布與育種歷史。從表 6中可以看出：XJ和 HXR的遺傳距離最近(DA=0.0297)，XJ和 CDM 距離次之 (DA=0.0457)，LL和BE之間的遺傳距離最遠(yuǎn) (DA=1.1549)。品種間的親緣關(guān)系不僅要從地理位置和起源上來(lái)確定，還應(yīng)考慮到遷移、突變、環(huán)境效應(yīng)以及微衛(wèi)星座位數(shù)目等其他因素的影響[21]。

根據(jù)聚類分析可以看出XJ和HXR聚為一類，再和 CDM 聚到一起，結(jié)果與山羊群體的地理分布一致[22-23]。FQ明顯有別于其他云南地方品種，這與地理位置不一致。云南省地形復(fù)雜多樣，自然氣候和生態(tài)環(huán)境類型甚多，確有研究證實(shí)鳳慶無(wú)角黑山羊有別于云南其他山羊品種。鳳慶無(wú)角黑山羊是云嶺山羊和臨滄長(zhǎng)毛山羊經(jīng)多年繁育雜交和后代選育形成的品種[24]，極可能受近交的影響。李彥屏等[25]認(rèn)為鳳慶無(wú)角黑山羊從體尺、體重、生長(zhǎng)速度、產(chǎn)肉性能等均有別于馬關(guān)無(wú)角山羊。此外因云南省與四川省接壤，部分地區(qū)的自然條件極為相似，也可能是造成建昌山羊、龍陵山羊和馬關(guān)無(wú)角山羊 3個(gè)遺傳距離相近的原因；也有可能是位點(diǎn)數(shù)和取樣數(shù)不足的原因，因?yàn)楫?dāng)遺傳距離期望值較低時(shí)，相對(duì)測(cè)定誤差較大，因此要準(zhǔn)確確立較相似品種間的遺傳關(guān)系，還應(yīng)在位點(diǎn)數(shù)和取樣個(gè)體數(shù)上多加考慮，使變異系數(shù)控制在較低水平上，進(jìn)而準(zhǔn)確區(qū)分其品種。

3.4 主成分分析

從散點(diǎn)圖可以看出，XJ、HXR、CDM、SNB聚為一類；JC、LL、MG聚為一類；BJ和FQ位于兩類之間；BE與其它山羊群體明顯分開(kāi)。這與聚類分析結(jié)果一致，足以證明結(jié)果的可靠性。

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Genetic diversity in goat breeds based on microsatellite analysis

Limei Xu1, Chousheng Liu2, Liping Zhang1, Zhigang Wang2, Xu Han2, Xiaoxia Li1,and Shuang Chang3

1Gansu Agricultural University,Lanzhou730070,China
2National Animal Husbandry & Veterinary Service of the Ministry of Agriculture (MOA),Beijing100193,China
3Henan Agricultural University,Zhengzhou450002,China

Received:January 19, 2010;Accepted:March 17, 2010

Supported by:Ministry of Agriculture 2009 Protection Project of Animal Germplasm Resources (No. [2009]99).

Corresponding author:Chousheng Liu. Tel: +86-10-62814021; E-mail: liuchousheng@sina.com

農(nóng)業(yè)部2009年畜禽種質(zhì)資源保護(hù)項(xiàng)目 (農(nóng)財(cái)發(fā)[2009]99號(hào)) 資助。