張寧，張雪梅，劉明軍，譚立新

1 新疆維吾爾自治區(qū)動物生物技術重點開放實驗室，烏魯木齊 830000

2 新疆畜牧科學院 農業(yè)部草食家畜繁育生物技術重點開放實驗室，烏魯木齊 830000

動物及獸醫(yī)生物技術

綿羊Follistatin基因表達及其結構域的功能分析

張寧1,2，張雪梅1,2，劉明軍1,2，譚立新1,2

1 新疆維吾爾自治區(qū)動物生物技術重點開放實驗室，烏魯木齊 830000

2 新疆畜牧科學院 農業(yè)部草食家畜繁育生物技術重點開放實驗室，烏魯木齊 830000

為研究羊Follistatin基因的功能，提取了綿羊卵巢總RNA，通過RT-PCR方法獲得羊Follistatin cDNA的完整開放閱讀框 (1 038 bp)。去除信號肽序列后與原核表達載體pET41a連接，構建重組表達質粒pFSsig?，經大腸桿菌誘導表達獲得FS sig?蛋白 (66 kDa)。通過RT-PCR克隆了包含N端和結構域1的Follistatin突變體 (FS N+D1)，將FS N+D1片段插入慢病毒載體 (pLEX-MCS) 構建了pFS-N+D1慢病毒重組表達質粒。在293T細胞中進行慢病毒的包裝，再感染綿羊肌肉原代細胞，得到穩(wěn)定表達FS N+D1的肌肉細胞系，通過細胞生長曲線結果顯示穩(wěn)定表達FS N+D1的肌肉細胞明顯比正常肌肉細胞增殖快，且差異極顯著 (P＜0.01)，表明綿羊FS N+D1結構域有促進肌肉細胞生長的功能。

綿羊Follistatin基因，原核表達，慢病毒，細胞生長曲線

Abstract:In order to study ovine follistatin function, we amplified the total of 1 038 base pair of ovine complete follistatin cDNA and cloned into pGEM-T vector by RT-PCR from ovine ovary RNA. After removal of the signal peptide it was subcloned into the pET41a to construct the prokaryotic expression vector, named pFSsig?. SDS-PAGE and Western blotting identified the 66 kDa product of the expression of follistatin cDNA. Based on the complete CDS sequence, we cloned follistatin N-terminal domain and domain 1 with PCR and inserted into pLEX-MCS lentiviral vector, named pFS-N+D1. After package and passage of lentivirus in 293T cells, and then infected sheep primary muscle cells (SPMC). The expression of FS N+D1 in SPMC was assayed by Western blotting. The cell growth curve of the infected SPMC and noninfected control cells displayed that FS N+D1 stablly transfected SPMC proliferated significantly faster than the control cells (P<0.01). Our data inferred that ovine FS N+D1 domain had the function to stimulate sheep muscle cell growth.

Keywords:ovineFollistatingene, prokaryotes expression, lentivirus, cell growth curve

卵泡抑素 (Follistatin，FS) 是1987年自卵泡液 中分離的一種前垂體細胞分泌的對卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，FSH) 起拮抗作用的單鏈多肽，富含半胱氨酸，又名垂體促卵泡素抑制蛋白 (FsH-suppressing protein，FsP)，隨后發(fā)現FS能與激活素 (Activin) 結合，對卵母細胞的成熟和卵泡的發(fā)育[1]、精子的生成[2]、胚胎發(fā)育與分化、催產素的釋放等起著重要的調節(jié)作用。FS基因敲除小鼠研究表明FS基因的缺失能引起肌肉、皮膚等生長發(fā)育的異常[3]。FS對TGF-β超家族許多成員具有拮抗作用，因此對不同細胞如神經細胞[4]、成骨細胞[5]、肌肉細胞、紅細胞生成[6]等有廣泛的調節(jié)作用，具有多方面的生物學功能[7]。肌肉抑制素基因(Myostatin，簡稱MSTN) 屬轉化生長因子-β超家族(Transforming growth factor-β super family，TGF-β)成員，是一種抑制肌肉細胞生長增殖的負調控基因[8]，也是目前已知的最強的骨骼肌生長抑制物[9-10]。該基因的突變失活，能阻斷MSTN對肌細胞生長增殖的抑制作用，引起所謂的“雙肌性狀”。最近研究表明 FS與畜禽骨骼肌發(fā)育有密切的關系。FS能與MSTN C-端競爭性結合，抑制MSTN跟受體結合，阻斷下游信號傳導，減弱MSTN對肌肉生長的抑制作用，引起轉基因小鼠肌肉異常增生肥大，肌纖維的直徑增長28%，單位面積肌纖維數量增長66%[10]。

對人FS晶體結構研究發(fā)現FS由3個結構域、N端及C端區(qū)組成，1～63位氨基酸為N端區(qū)，64～136位氨基酸為結構域1 (D1)，137～211位氨基酸為結構域 2 (D2)，212～288位氨基酸為結構域 3 (D3)，288～315位氨基酸為C端區(qū)[11]。FS的每個結構域都有不同的配體結合活性，FS結構域2與Activin結合能力強，結構域1是與MSTN結合的最小區(qū)域，且結合能力在3個結構域中最強，刪除FSD2或用D1替代D2后仍然表現出與MSTN強有力的結合能力[12]。目前對人及小鼠FS各結構域功能的研究已有很多，但在家畜方面的研究還未見詳細報道，為進一步研究綿羊FS對肌肉細胞生長的調節(jié)作用，本研究克隆了綿羊 FS全長 ORF，并在大腸桿菌中進行了表達，在此基礎上克隆了N端及結構域1 (N+D1)片段并構建了慢病毒表達載體。通過慢病毒載體轉化綿羊肌肉細胞在綿羊肌肉細胞上研究了FS N+D1結構域對綿羊肌肉細胞生長的調節(jié)功能，為今后研制促肌肉生長制劑及轉基因動物打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種、試劑、質粒

載體 pET41a為本實驗室保存；pLEX-MCS由美國克羅拉多大學李川源教授實驗室贈送；TRIzol、大腸桿菌感受態(tài)菌株 BL21 (DE3)、DH5α、鼠抗HIS、HA單抗均購自北京天根公司；IRDye?800CW 標記的羊抗鼠 IgG抗體購自美國 LI-COR Biosciences公司；限制性內切酶、T4 DNA連接酶、IPTG等試劑均購自大連TaKaRa公司；反轉錄酶、小量質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自杭州博日公司；中量質粒提取試劑盒購自 QIAGEN公司；LipofectamineTM2000購自 Invitrogen公司；高糖DMEM、Opti-MEM購自GIBCO公司；胎牛血清購自HYCLONE公司；其他試劑均為國產分析純產品。

1.1.2動物材料

實驗中所用的綿羊卵巢取自天鷹屠宰廠；293T細胞、綿羊肌肉原代細胞由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1RNA的提取、全長cDNA及N+D1結構域的克隆

取新鮮綿羊卵巢置于液氮中冷凍并進行研磨后提取總 RNA，按反轉錄酶說明書進行 RT-PCR。參照牛 (GenBank Accession No. NM_175801)、羊FS基因序列 (GenBank Accession No. M63123) 進行特異性引物設計。去除信號肽的FS (FS sig?) 上游引物為：5′-GTAAGCTTTAGGAAATTGCTGGCTCCG-3′，下游引物為5′-GGCTCGAGAGGGTTTACCACTCTA GAATG-3′，分別引入了Hind Ⅲ、XhoⅠ酶切位點。FS N+D1結構域上游引物為：5′-AAGGATCCCTCA GGATGGCCCGTCCTA-3′，下游引物為：5′-TTCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAT TTACATTTGCCCTGGT-3′，分別引入了BamH I、XhoI酶切位點，下劃線部分為血球凝集素 (HA) 序列。去除信號肽后的FS PCR擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸80s，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。FS N+D1結構域PCR擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30s，57℃退火40s，72℃延伸60s，35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結果。

1.2.2原核及慢病毒表達質粒的構建

FS全長片段PCR產物經膠回收后，用Hind III/XhoI酶切，與同樣酶切處理的pET41a載體進行連接，FS N+D1片段PCR產物經膠回收用BamH I/XhoI酶切，與同樣酶切處理的pLEX慢病毒載體進行連接，熱擊法轉化 DH5α，挑選克隆進行 PCR、酶切鑒定，挑選陽性克隆送上海生工生物有限公司進行DNA測序分析。重組質粒分別命名為pFSsig?、pFS-N+D1。

1.2.3Fs sig?的原核表達及鑒定

將鑒定后的原核重組表達質粒 pFSsig?和空載體質粒pET41a分別轉化宿主菌大腸桿菌BL21。分別挑選單菌落接種到3 mL含Kan+的LB培養(yǎng)基中，于37℃劇烈搖動培養(yǎng)12 h，取上述培養(yǎng)物按1∶100的比例接種到2個5 mL含Kan+的新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈搖動培養(yǎng)1.5 h，使菌液的OD600達到0.6～0.8。取1 mL作為誘導前對照，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。收集培養(yǎng)液，6 000 r/min離心10 min，棄上清。用PBS漂洗菌體沉淀，加入適量PBS重懸菌體沉淀，再加入2×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸10 min后，按常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳并以考馬斯亮藍染色。同時進行Western blotting免疫印跡，使用的His標簽為載體自帶，具體方法如下：將凝膠放入電轉緩沖液中，濕轉法35 V轉印110 min后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗為鼠抗HIS單抗1∶8 000稀釋，4℃過夜孵育，PBST洗滌5次，每次10 min，二抗為IRDye?800CW標記的羊抗鼠IgG抗體1∶12 000稀釋，室溫孵育50 min，PBST洗滌5次，每次10 min，最后用PBS洗滌1次，Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng) (Li-COR Biosciences) 掃描成像。

1.2.4綿羊原代肌肉細胞培養(yǎng)

將2月齡胎羊用Hanks液清洗3次，剪開皮膚用攝子剪下肌肉組織，去除結締組織及脂肪，剪碎至2～3 mm3的小塊，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶8 mL，移至15 mL離心管中，37℃消化1.5 h，每隔20 min取出用吸管吹打，取出消化液鏡下觀察至消化成單個細胞，用不銹鋼網過濾消化液至15 mL離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清，用含10%血清及1%雙抗的DMEM 8 mL重懸細胞，調整細胞密度至1.5×105個/mL，放入細胞瓶中37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。

1.2.5FS N+D1重組慢病毒的包裝及穩(wěn)定表達細胞系的建立

用DMEM (含10% FCS) 培養(yǎng)液培養(yǎng)293T細胞，待匯合度達到90%時用0.05%胰蛋白酶消化傳代，取5×105個細胞鋪入6孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞匯合度達到70%～80%時將pFS-N+D1 重組質粒 2 μg，包裝質粒 pSPAX2 1.5 μg，包膜質粒pMD2.G 0.5 μg，按 LipofectamineTM2000說明書進行共轉染，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育3 h后換為正常DMEM (含10% FCS) 培養(yǎng)液，次日上午移至 32℃、5% CO2培養(yǎng)箱，同時正常細胞作對照。48 h后收集上清液，用0.45 μm過濾器過濾，收集濾過液保存于?70℃。

將培養(yǎng)好的綿羊肌肉原代細胞用 0.05%胰蛋白酶消化后取5×105個細胞鋪入6孔培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進行病毒感染，移出正常培養(yǎng)液，加入解凍的病毒液 1 mL，按終濃度為10 μg/mL加入聚凝胺 (Polybrene)，細胞置于32℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過夜，次日上午移回37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，8 h后更換正常培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。病毒感染48 h后，按常規(guī)方法將細胞轉入10 cm培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后加入600 ng/mL的puromycin進行加壓篩選，3 d后更換含同樣濃度的 puromycin選擇性培養(yǎng)液，同時設置正常細胞對照組，待 7 d后即可得到穩(wěn)定轉染的細胞。將穩(wěn)定轉染的綿羊肌肉細胞在10 cm培養(yǎng)皿中進行擴大培養(yǎng)，取細胞裂解物后進行 Western blotting免疫印跡檢測。

1.2.6綿羊肌肉細胞生長曲線的繪制

將穩(wěn)定轉染的細胞更換正常培養(yǎng)液后，培養(yǎng)至90%匯合，消化計數鋪入24孔培養(yǎng)板，每孔細胞數為 1×104個，分 7組，每組 3孔，同時設置正常細胞對照組。培養(yǎng)1周，期間3 d換液1次，逐日檢測一組，計數。最后把7 d的細胞數值繪成圖，即為細胞生長曲線，上述實驗重復 3次后獲得數據用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 FS sig?及FS N+D1結構域的克隆

通過RT-PCR及PCR擴增，獲得1 038 bp的FS ORF序列及948 bp的去除信號肽的FS序列 (圖1)，經PCR、酶切及測序鑒定，與GenBank中牛FS cDNA進行 Blast比對，結果表明序列一致性為 98%。在此基礎上擴增的FS N+D1結構域，獲得495 bp的DNA片段，大小與預期結果一致 (圖2)。

圖1 Follistatin ORF及sig?的PCR擴增Fig.1 PCR products of Follistatin ORF and Follistatin sig?. 1:PCR products of FS sig?; 2: PCR products of FS ORF; M:100 bp marker.

圖2 FS N+D1的PCR擴增Fig.2 PCR products of Follistatin N+D1. 1: PCR products of FS N+D1; M: 150 bp marker.

2.2 Fs sig?在大腸桿菌中的表達及鑒定

從SDS-PAGE結果 (圖3) 可以看出，誘導后的樣品有明顯的蛋白表達條帶，其表達產物的分子量約為66 kDa，與理論推算值一致。Western blotting免疫印記實驗顯示：經誘導后的表達產物在66 kDa處呈現陽性結果 (圖4)，說明克隆的FS sig?在大腸桿菌得到了高效表達。

圖3 pFS sig?的SDS-PAGE檢測Fig.3 SDS-PAGE analysis of FS sig?expression products inE. coli. M: prestained protein ladder; 1: pET41a after IPTG induction; 2: pFS sig?His before IPTG induction; 3: pFSsig?His after IPTG induction.

圖4 pFSsig?的Western blotting檢測Fig.4 Western blotting analysis of FS sig?expression products inE. coli. M: prestained protein ladder; 1: pET41a after IPTG induction; 2: pFSsig?His before IPTG induction; 3:pFSsig?His after IPTG induction.

2.3 綿羊原代肌肉細胞培養(yǎng)、重組慢病毒的包裝及穩(wěn)定表達細胞系的建立

37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后傳代培養(yǎng)的綿羊原代肌肉細胞在鏡下觀察可見形態(tài)為長梭形均勻生長，狀態(tài)良好 (圖 5)。重組質粒 pFS-N+D1轉染293T細胞48 h后，收集并裂解細胞后用HA單克隆抗體做Western blotting免疫印跡檢測，可見在18 kDa處有特異性條帶出現，說明病毒包裝成功并能表達FS N+D1重組蛋白，且與預期大小一致 (圖6)。用包裝病毒感染綿羊肌肉原代細胞加壓篩選7 d后，正常細胞對照組全部死亡，而經感染的綿羊肌肉原代細胞生長良好；收集并裂解細胞進行Western blotting免疫印跡檢測，結果顯示在18 kDa處有特異性條帶出現，說明在綿羊肌肉原代細胞中可以穩(wěn)定表達FS N+D1重組蛋白，即得到穩(wěn)定表達的綿羊肌肉細胞系 (圖7)。

圖5 綿羊原代肌肉細胞 (100×)Fig.5 Sheep primary muscle cells (100×).

圖6 pFS-N+D1轉染293T細胞Western blotting檢測Fig.6 Western blotting analysis of 293T cell by pFS-N+D1 transfection. 1: 293T cell; 2: pLEX-MCS transfected 293T cell;3: pFS-N+D1 transfected 293T cell; M: prestained protein ladder.

圖7 pFS-N+D1感染綿羊原代肌肉細胞Western blotting檢測Fig.7 Western blotting analysis of sheep primary muscle cell by pFS-N+D1 infection. 1: pFS-N+D1 infected sheep primary muscle cell; 2: pLEX-MCS infected sheep primary muscle cell;3: sheep primary muscle cell; M: prestained protein ladder.

2.4 綿羊肌肉細胞生長曲線的繪制

將穩(wěn)定表達肌肉細胞系與正常肌肉細胞傳至24孔培養(yǎng)板，其起始細胞數量一致，將 7 d的計數結果繪制成圖，細胞生長曲線結果顯示表達了 FS N+D1蛋白的肌肉細胞在第 3～7天增殖較正常肌肉細胞快，在細胞對數生長期中第3天差異顯著 (P＜0.05)，第 4～7天均差異極顯著 (P＜0.01)，說明在FS N+D1過量表達的情況下能顯著促進綿羊肌肉細胞生長(圖8)。

圖8 綿羊肌肉細胞生長曲線Fig.8 Growth curve of sheep primary muscle cell.

3 討論

MSTN是目前已知的最強的骨骼肌生長抑制物[10]，通過生物技術手段阻斷MSTN對肌細胞的抑制作用來促進肌肉的生長、減少脂肪的生成已成為目前動物生物技術的研究熱點，國內目前只對豬、牛等動物的FS進行了克隆，何新等[13]克隆了全長1 038 bp豬FS cDNA的完整開放閱讀框，在大腸桿菌表達了63 kDa的GST-FS融合蛋白，該表達產物可作為飼料添加劑，以期達到促進豬肌肉持續(xù)增長的目的。趙振春等[14]克隆了牛FS cDNA并在大腸桿菌中表達44 kDa的HIS-FS融合蛋白，為促進家畜肌肉的生長提供了一定的實驗基礎。本實驗首次克隆了綿羊FS cDNA，與人、牛、鼠的標準序列進行比對，同源性分別為93%、98%、90%。信號肽去除后構建重組表達質粒 pFSsig?進行原核表達得到了66 kDa的融合蛋白，并以包涵體形式存在，為后續(xù)在體外研究FS各結構域的功能做好前期準備。

本研究為在短時間內篩選到穩(wěn)定表達細胞系，選擇使用的pLEX慢病毒載體是第2代慢病毒表達系統(tǒng)，該載體系統(tǒng)由包裝質粒、包膜質粒及載體質粒組成。將慢病毒載體分成 3個質粒，使其共同重疊序列最小化，降低了產生具有復制能力病毒的可能性，同時可獲得較高滴度的慢病毒[15]，因其缺乏HIV-1增強子及啟動子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉錄出病毒RNA，因此該載體系統(tǒng)比第一代載體更安全可靠。慢病毒顆粒感染細胞快速、穩(wěn)定并且效率可高達 90%以上，篩選時間一般在7～10 d左右，可保證細胞的穩(wěn)定表達及良好狀態(tài)?；谝陨下《鞠到y(tǒng)的優(yōu)點，本實驗將FS N+D1片段克隆至 pLEX載體的多克隆位點上，構建重組表達質粒與其包裝質粒、包膜質粒一起共轉染293T細胞48 h，得到病毒顆粒。因為原代細胞不能無限傳代，篩選時間長短決定細胞狀態(tài)的好壞，細胞代次高會導致細胞核型發(fā)生改變，無法進行后續(xù)轉基因研究，因此我們用病毒顆粒感染綿羊原代肌肉細胞，篩選7 d即得到了穩(wěn)定表達的綿羊肌肉細胞系，大大縮短篩選時間，提高篩選效率，避免細胞核型變化及細胞老化。

國外對 FS的研究開始于 20世紀 90年代，用FS進行了小鼠的轉基因研究，Lee[16]于2007年在肌肉專一性啟動子的調控下將 FLRG (Follistatin related protein)及FS分別進行小鼠轉基因實驗，在轉基因小鼠肌肉組織都能檢測到 FLRG或 FS的表達，而在非肌肉組織中無表達，且肌肉明顯增重，說明FS或FLRG都有抑制MSTN的功能。由于FS有多種多樣的生物學功能，為了避免FS對其他生物學功能和繁育能力的影響，國外大多學者開始了FS結構域的功能研究。Nakatani等[17]克隆了小鼠 FS的各個結構域，比較了FS結合Activin和MSTN的活性，根據FS的晶體結構發(fā)現結合MSTN最小結構域為 FSD1。而 Schneyer等[12]分析 FS-ACT復合體，發(fā)現 FSD2與 ACT結合力強，另外還證實了FSD1與 MSTN結合能力強。而在牛、羊等大動物上至今仍沒有對FS的各個結構域進行研究的報道，因此本實驗利用慢病毒系統(tǒng)建立了穩(wěn)定表達 FS N+D1綿羊原代肌肉細胞系，在此基礎上繪制了正常細胞與穩(wěn)定表達FS N+D1細胞系的生長曲線，根據生長曲線，第1、2天細胞增殖緩慢，第3天開始進入對數生長期并快速增殖，第 5天后趨于穩(wěn)定，符合細胞生長規(guī)律。比較FS N+D1穩(wěn)定表達肌肉細胞系與正常肌肉細胞，結果顯示第1天與第2天沒有明顯差異。在細胞對數生長期，轉化細胞系的細胞增殖速度比正常肌肉細胞明顯加快，從第3天開始差異顯著 (P＜0.05)，到第 4～7天差異變?yōu)闃O顯著(P＜0.01)，說明FS N+D1的表達對細胞增殖有明顯的促進作用，證明了綿羊FSD1的功能與小鼠FSD1功能相似，能與MSTN結合并對細胞增殖起到促進作用。但對于結合能力的強弱沒有與其他結構域進行比較，有待于進一步研究。本項研究為下一步在綿羊上分析 FS各結構域的功能和轉基因動物的研究打下了基礎。

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OvineFollistatingene expression and functional analysis of follistatin domains

Ning Zhang1,2, Xuemei Zhang1,2, Mingjun Liu1,2, and Lixin Tan1,2

1Key Laboratory of Animal Biotechnology of Xinjiang,Urumqi830000,China
2Key Laboratory of Livestock Reproduction & Biotechnology of Ministry of Agriculture,Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi830000,China

Received:February 9, 2010;Accepted:May 13, 2010

Supported by:Project of High Technology Research and Development of Xinjiang (No. 200611106).

Corresponding author:Mingjun Liu. Tel: +86-991-4813258; Fax: +86-991-4841417; E-mail: xjlmj2004@yahoo.com.cn

新疆維吾爾自治區(qū)高技術研究發(fā)展計劃 (No. 200611106) 資助。