朱 月，包 楠

（赤峰學院 生命科學系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

青春牡丹多糖對自由基清除作用的研究

朱 月，包 楠

（赤峰學院 生命科學系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

采用鄰二氮菲-Fe氧化法測定了青春牡丹多糖清除羥自由基（·OH）的作用，應用鄰苯三酚自氧化反應體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-）的方法測定青春牡丹多糖對超氧陰離子自由基的清除作用.結(jié)果表明，青春牡丹多糖具有清除羥自由基的作用，且呈明顯的量效關(guān)系；對超氧陰離子自由基也具有清除作用.該結(jié)果提示青春牡丹多糖具有抗氧化作用.

青春牡丹多糖；羥自由基；超氧陰離子自由基；抗氧化作用

青春牡丹（Paeonia rockii‘Qing Chun’）是芍藥科芍藥屬牡丹組紫斑牡丹品種群中的一個品種的變種.

紫斑牡丹是我國特有植物，為落葉灌木，是珍貴的花卉種質(zhì)資源.牡丹自古以來皆用根皮入藥.根皮中以牡丹酚為主要的藥用成份，具有抗菌、降血壓、清熱涼血、活血化瘀的功能[1].關(guān)于牡丹多糖對自由基清除作用的研究卻很少見報道.

本文以青春牡丹葉片多糖為試驗材料，通過鄰二氮菲-Fe氧化法、鄰苯三酚自氧化法分別測定青春牡丹多糖對羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-）的作用，以探討青春牡丹多糖的抗氧化作用.為紫斑牡丹的進一步利用提供科學根據(jù)，提高紫斑牡丹的藥用價值、經(jīng)濟價值和應用價值.

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

青春牡丹葉片干制粉末由內(nèi)蒙古赤峰學院趙雪酶老師主持的“紫斑牡丹的引種馴化”課題組提供.

1.2 儀器與試劑

DZKW—4恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司），分析天平（上海天平儀器廠），TD低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），UV-9100型紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司），Milli-Q超純水純化系統(tǒng).

無水乙醇、三氯乙酸、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、鄰二氮菲、鄰苯三酚、FeSO4，H2O2，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，鹽酸，三羥基甲基氨基甲烷，以上試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.超純水從實驗室Milli-Q超純水純化系統(tǒng)獲得.

2 方法

2.1 多糖的提取和純化[2-5]

稱取100目過篩干燥的青春牡丹葉片粉末10g，加入80%乙醇80ml，于80℃恒溫水浴浸提40min,4000r/min離心20min，收集上清液.將沉淀再浸提一次.合并兩次上清液，再將上清液與10%三氯乙酸按12：1混勻，冷藏靜置24小時，離心15min,棄蛋白質(zhì)沉淀.將除掉蛋白質(zhì)的上清液加入適量無水乙醇,使上清液含醇量達80%，再將上清液濃縮至10ml，得青春牡丹粗多糖溶液.

2.2 多糖含量的測定[6]

2.2.1 葡萄糖標準曲線的制備

配制質(zhì)量濃度為0.04mg/ml的標準葡萄糖溶液,低溫保存?zhèn)溆?

分別取0.04mg/ml的標準葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml于10ml的試管中，不足1.0ml的用去離子水補齊，向試管中分別加入苯酚溶液2.0mL和濃硫酸4.0mL混勻，靜置5min,于60℃的水浴中保溫30min,490nm處測吸光值，以吸光度A為縱坐標，葡萄糖濃度C（ug/mL）為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線，求出直線方程.

2.2.2 樣品液的制備

取青春牡丹粗多糖溶液0.1ml置于100ml容量瓶中，用去離子水定容至刻度，制成多糖樣品液于低溫處保存?zhèn)溆?

2.2.3 樣品多糖含量的測定

取1ml青春牡丹多糖樣品液于干燥的試管中，向試管中加入苯酚溶液2ml和濃硫酸4ml，靜置5min,于60℃的水浴中30min.490nm處測吸光度，重復三次，將光吸收值的平均值代入直線方程，計算青春牡丹多糖的含量.

2.3 青春牡丹多糖對羥自由基的作用[7-9]

取干燥潔凈的試管按表1加入各試劑，每加入一種試劑要立即搖勻，在樣品對照管和加樣管中分別加入濃度為0.1256mg/ml青春牡丹多糖樣品液0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml.使各樣品管所含 多 糖 的 濃 度 分 別 0，0.00628，0.01256，0.01884，0.2512，0.03410mg/ml.最后加超純水使每試管的總體積為10ml.37℃水浴保溫1小時,于536nm比色測定吸光度.計算羥自由基清除率.

羥自由基清除率（d）=[A536（加樣）-A536（損傷）-A536（樣品對照）]/[A536（未損傷）-A536（損傷）]×100%

表1 加樣順序表

2.4 青春牡丹多糖對超氧陰離子自由基的作用[10]

2.4.1 自氧化速率的測定

取兩支試管按表2加入25℃預熱的緩沖液,然后加入預熱的鄰苯三酚（空白管用0.01mol/L HCl代替鄰苯三酚），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在320nm波長處測定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化.

表2 加樣順序表

2.4.2 樣品的活性測定

各試管試劑成分見表3.測定方法同2.4.1.所不同的是要對加入同體積不同濃度多糖溶液的樣品空白管的光吸收值和樣品管鄰苯三酚自氧化速率分別進行測定.計算清除率.

表3 加樣順序表

清除率(I%)計算公式為:I%＝ [A1-(A3-A2) /A1]×100%

3 結(jié)果

以標準葡萄糖濃度為橫坐標，以其對應的光吸收值為縱坐標作圖，得直線方程Y＝0.0102x-0.0047,相關(guān)系數(shù)r＝0.9995.標準葡萄糖濃度在8.0–40.0ug/ml范圍內(nèi)葡萄糖的含量與吸光度呈良好的線性關(guān)系.依據(jù)直線方程，求得青春牡丹葉片多糖含量為10.1%.

在 2.3中青春牡丹多糖濃度在 0.05～0.25mg/ml時，對羥自由基的清除率為14.21%～98.48%（見圖1）.

在 2.4中青春牡丹多糖濃度在 0.01～0.07mg/ml時，對超氧陰離子的清除率為4.9%～8.1%（見圖2）.

4 討論

在試驗研究中由于提取的粗多糖溶液存在雜質(zhì)，對光吸收值的測定產(chǎn)生一定的影響.因此，在兩項光吸收值測定時設置樣品空白管可去除雜質(zhì)對吸光度的干擾，以提高測定結(jié)果的準確度.

在反應產(chǎn)生羥自由基（·OH）體系中，鄰二氮菲與Fe2+反應生成Fe2+-鄰二氮菲配合物，該配合物在A536nm有最大吸收.而當·OH氧化Fe2+-鄰二氮菲成Fe3+-鄰二氮菲時，就使A536nm最大吸收消失或減弱.當反應體系中存在羥自由基（·OH）清除劑時，此氧化過程受到抑制，A536nm則降低不明顯，故可通過A536nm值比較抗氧化劑清除?OH的能力[13].

本試驗在反應產(chǎn)生羥自由基（·OH）體系中加入一定濃度的青春牡丹多糖溶液后，通過光吸收值的測定和羥自由基清除率的計算發(fā)現(xiàn)：青春牡丹多糖對羥自由基有很好的清除作用.并且隨著多糖濃度的增加，對羥自由基的清除作用增強，且呈明顯的量效關(guān)系.

鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物，這些中間物在320nm波長處有強烈的光吸收，并且中間物的積累在初始的4min范圍內(nèi)與時間成線性關(guān)系.據(jù)此，在初始的時間范圍內(nèi)，中間物光吸收值的大小與時間也呈線性關(guān)系.若鄰苯三酚自氧化體系中有抗氧化劑存在，由于它能催化O2-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，光吸收值降低.

試驗發(fā)現(xiàn)，當鄰苯三酚自氧化體系中加入不同濃度的青春牡丹多糖溶液時，光吸收值降低，說明青春牡丹多糖能催化O2-與H+結(jié)合，從而減少體系中的超氧陰離子自由基.數(shù)據(jù)顯示：青春牡丹多糖在一定的濃度范圍內(nèi)對超氧陰離子自由基有一定的清除能力.

5 結(jié)論

試驗證明青春牡丹多糖在一定的濃度范圍內(nèi)，對羥自由基有較好的清除作用，并且隨著多糖濃度的增加，對羥自由基的清除作用增強，且呈明顯的量效關(guān)系；對超氧陰離子自由基也有清除作用，但清除能力較弱.

青春牡丹多糖能有效清除自由基,說明具有一定的抗氧化作用.具有很好的開發(fā)利用前景.

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