董 薇,曹際娟,鄭秋月,吳元華

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,沈陽(yáng)110161;2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧 大連 116001)

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)致敏原小麥的研究

董 薇1,2,曹際娟2,鄭秋月2,吳元華1

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,沈陽(yáng)110161;2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧 大連 116001)

采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)致敏原小麥成分.試驗(yàn)結(jié)果表明:采用小麥管家基因GAG56D和Wx012基因的特異性檢測(cè)引物和探針進(jìn)行檢測(cè)時(shí),26種樣品經(jīng)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增,只有小麥產(chǎn)生陽(yáng)性的熒光信號(hào),其余樣品均不產(chǎn)生熒光信號(hào).靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明:該方法對(duì)小麥致敏原基因的檢測(cè)靈敏度較高,可達(dá)到1 mg·kg-1,符合痕量檢測(cè)要求.

小麥;實(shí)時(shí)PCR;致敏原檢測(cè)

近年來,食物過敏的發(fā)生率正持續(xù)增加,過敏性疾病發(fā)病在全球呈逐年上升趨勢(shì),發(fā)達(dá)國(guó)家超過20%的人受過敏性疾病的困擾[1].致敏原又稱過敏原或變態(tài)反應(yīng)原,是指能夠使人發(fā)生過敏的抗原.美國(guó)和歐盟從2007年開始執(zhí)行新的食品過敏原標(biāo)簽法規(guī),法規(guī)分別要求生產(chǎn)企業(yè)明確標(biāo)明其產(chǎn)品中是否含有8大類和12種主要的食品過敏原,包括小麥、大豆、花生、芹菜、芥末、芝麻和堅(jiān)果,畜禽產(chǎn)品,水產(chǎn)品等.根據(jù)小麥致敏原以及潛在的致敏免疫機(jī)制表明:小麥過敏會(huì)影響皮膚、內(nèi)臟、呼吸道的健康,引起運(yùn)動(dòng)激發(fā)過敏癥、職業(yè)哮喘、鼻炎、接觸性蕁麻疹等.傳統(tǒng)的生物活性檢測(cè)精確度和靈敏度不高,目前采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、消除交叉污染、特異性強(qiáng)、定量結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn).本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù),建立了食品中致敏原小麥成分的快速檢測(cè)方法,為食品致敏原的標(biāo)簽管理、監(jiān)管、檢測(cè)提供了可靠的技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2008年8月在遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行.試驗(yàn)所用小麥、大麥、燕麥、蕎麥、黑麥、白芝麻、糙米、綠豆、玉米、黑大豆、雪豆、泰國(guó)香米、花豆、黑小豆、黃豆、豌豆、飯豆、黑大米、胡蘿卜、大白菜、韭菜、油菜、花生米、高粱、薏米等26份樣品由大連農(nóng)業(yè)科學(xué)院、沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)等多家單位提供,或購(gòu)于大連家樂福超市.Taqman GEx Master PCR酶預(yù)混液購(gòu)于美國(guó)ABI公司.用于DNA提取的主要試劑CTAB緩沖液配制方法如下:55 mmol/L CTAB,1400 mmol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,100 mmol/L Tris,用10 % 鹽酸調(diào)pH至8.0,121℃,高壓滅菌20 min,備用.ABI 7300實(shí)時(shí)熒光PCR儀,核酸蛋白分析儀,臺(tái)式高速冷凍離心機(jī).

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的抽提

采用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(貨號(hào):DV811A)并按其操作說明進(jìn)行抽提樣品DNA.

1.2.2 DNA濃度和純度的測(cè)定

取5 μL DNA溶液加ddH2O梯度稀釋至1 mL,使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測(cè)260 nm和280 nm處的光密度值.DNA的濃度按照公式

計(jì)算獲得.其中C為DNA濃度(μg/μL);A為260 nm處的吸光值;N為核酸稀釋倍數(shù);1OD260nm＝50 μg/mL雙鏈DNA.當(dāng)OD260/OD280比值在1.7～1.9之間時(shí),適宜于PCR擴(kuò)增.

1.2.3 引物和探針設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI上已公布的小麥管家基因GAG56D和Wx012基因的核酸序列,在引物的設(shè)計(jì)上對(duì)小麥管家基因檢測(cè)引物和探針的退火溫度的一致性,GC含量的相似性等因素進(jìn)行了充分的考慮,采用DNAMAN 8.0軟件設(shè)計(jì)了小麥管家基因GAG56D和Wx012基因的引物和探針.序列如下:

檢測(cè)GAG56D基因的引物和探針序列:

正向引物:5′-CAA CAA TTT TCT CAG CCC CAA CA-3′

反向引物:5′-TTC TTG CAT GGG TTC ACC TGT T-3′

探針:5′-FAM-TTC CCG CAG CCC CAA CAA CCG C-Eclipse-3′

檢測(cè)Wx012基因的引物和探針序列:

正向引物:5′-GTC GCG GGA ACA GAG GTG T-3′

反向引物:5′-GGT GTT CCT CCA TTG CGA AA-3′

探針:5′-FAM-CAA GGC GGC CGA AAT AAG TTG CC-Eclipse-3′

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系(體積為 25 μL):10×PCR緩沖液(含Mg2+)5 μL、正反向引物各(10 μmol/L)1 μL、探針(10 μmol/L)1 μL、dNTPs(10 μmol/L)2 μL、Taq DNA聚合酶(2.5 U)0.2 μL、模板DNA(0.1～2 μg)2 μL,水補(bǔ)足至 25 μL.

實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ /10 min ,1個(gè)循環(huán);95℃/15 s,60℃ /1 min,40個(gè)循環(huán),在每次循環(huán)的退火時(shí)收集熒光.檢測(cè)結(jié)束后,根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值判定結(jié)果.

1.2.5 結(jié)果判斷

同時(shí)進(jìn)行的陰性、陽(yáng)性、空白對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果正常,檢測(cè)樣品有明顯的熒光增幅曲線,且Ct值≤35,則判斷樣品中檢出致敏原小麥成分.若檢測(cè)樣品熒光增幅曲線的Ct值在35～40之間,則應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng).如果再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct值仍在35～40之間,可判斷樣品中檢出致敏原小麥成分,否則可判斷樣品中未檢出致敏原小麥成分.

1.2.6 特異性試驗(yàn)

選取與樣品同科同屬的物種,用于待測(cè)樣品的特異性試驗(yàn).

1.2.7 靈敏度試驗(yàn)

將小麥樣品研磨粉碎處理后,按照不同的重量比分別添加到不含小麥致敏原基因的植物為原料的米粉基質(zhì)中,制備成20,10,5,2 ,1,0.5,0.2,0.1,0 mg·kg-1共9個(gè)梯度含量的添加樣品.應(yīng)用本方法分別進(jìn)行檢測(cè),以確定本方法的檢測(cè)靈敏度.

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性分析結(jié)果

采用小麥管家基因GAG56D和Wx012基因引物和探針進(jìn)行檢測(cè),26種樣品經(jīng)Taqman 探針實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增,只有小麥產(chǎn)生熒光信號(hào),其余樣品均未產(chǎn)生熒光信號(hào)(圖1).可見,本研究所采用的小麥管家基因GAG56D和Wx012基因檢測(cè)引物和探針具有很好的特異性.

圖1 小麥特異性檢測(cè)結(jié)果

2.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果表明(圖2),含量分別 為 20mg·kg-1、 10mg·kg-1、5mg·kg-1、2mg·kg-1、1mg·kg-1的小麥過敏原添加樣品均能很好檢出熒光信號(hào),而低于 0.5mg·kg-1以下含量的添加樣品則檢測(cè)不出熒光信號(hào).表明該方法對(duì)小麥致敏原基因的檢測(cè)靈敏度較高,可達(dá)到 1 mg·kg-1.

圖2 小麥致敏原靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)

運(yùn)用本方法共檢測(cè)了 280份實(shí)際樣品.其中檢測(cè)小麥原料樣品73份,陽(yáng)性符合率為100%.檢測(cè)小麥加工制品 95份,陽(yáng)性符合率也為 100%.檢測(cè)嬰兒食品和小食品112份,其中檢出含有小麥致敏原基因的樣品為21份,其余91份樣品未檢出小麥致敏原基因,這些結(jié)果與食品標(biāo)簽的標(biāo)識(shí)相符合.由大量的實(shí)際應(yīng)用結(jié)果可見,應(yīng)用本方法檢測(cè)小麥致敏原基因成分,具有較好的應(yīng)用效果.

3 討論

目前針對(duì)食品致敏原的檢測(cè)方法,主要有體內(nèi)檢測(cè)的皮膚試驗(yàn)和雙盲安慰劑對(duì)照激發(fā)試驗(yàn),體外檢測(cè)的血清IgE試驗(yàn)和組胺釋放試驗(yàn), PCR檢測(cè),以及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法等[1].傳統(tǒng)的體內(nèi)檢測(cè)試驗(yàn)直接檢測(cè)是否存在過敏蛋白質(zhì),由于過敏蛋白質(zhì)通常痕量存在而被食品基質(zhì)掩蓋,造成試驗(yàn)結(jié)果假陰性.DNA比蛋白質(zhì)更耐受熱處理和壓力作用,尤其是對(duì)于一些過敏原很難獲得相應(yīng)的血清抗體.PCR方法中,在熱變性條件下目標(biāo)DNA可以有效提取而不象蛋白提取時(shí)受食物基質(zhì)的影響較大;另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它的穩(wěn)定性,它不象蛋白質(zhì)組成那樣受地理?xiàng)l件和季節(jié)變化的影響.

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)與常規(guī)PCR相比,它具有特異準(zhǔn)確、可有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn).可以通過在PCR擴(kuò)增過程中檢測(cè)產(chǎn)物的熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程.因此我們可以通過實(shí)時(shí)熒光PCR方法更快、更準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品致敏原成分基因,從而判斷食品中是否存在過敏原[2].

本研究采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù),建立了食品中致敏原小麥成分快速檢測(cè)方法,該方法的靈敏度高,檢測(cè)低限可達(dá)到1 mg·kg-1;方法特異性強(qiáng),與對(duì)照組24種樣品無交叉反應(yīng).在實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)中,共檢測(cè)280份樣品,陽(yáng)性符合率為 100%,具有較好的應(yīng)用效果.該方法操作步驟簡(jiǎn)單,檢測(cè)時(shí)限短,結(jié)果判斷準(zhǔn)確,適用于小麥致敏原的快速診斷和大量樣品的檢測(cè).

[1]黃 峙,郭寶江.食品過敏原檢測(cè)與評(píng)價(jià)技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2003,24(8):240～244

[2]HIRD H,LLOYD J,GOODIER R,et al.Detection of peanut using real-time polymerase chain reaction[J].Eur Food Res Technol,2003,217:265～268

Detecting Allergen Wheat in Food by Real-Time PCR

DONG Wei1,2,CAO Ji-juan2,ZHENG Qiu-yue2,WU Yuan-hua1
(1.College of Plant Protection,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China;2.Liaoning Entry-Exit Inspection &Quarantine Bureau,Dalian 116001,China)

To identify wheat in food,a real-time fluorescent PCR assay is performed in this study.The experiment result shows that the primers and probe of GAG56D和Wx012 gene of wheat could specifically identify wheat with 26 kinds of sample.Sensitivities results show that 1 mg·kg-1for wheat of food could be detected,and meet the need of trace amount detection.

wheat;real-time PCR;allergen detection

Q946

A

1672-5298(2010)04-0054-04

2010-09-05

國(guó)家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)課題(2007GYJ036)

董 薇(1978? ),女,沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院博士研究生.主要研究方向:有害生物與環(huán)境安全研究