魏 濤,何培新,鄭俊麗

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450002)

鐵棍山藥水溶性多糖的超聲波提取工藝及體外抗氧化活性的研究

魏 濤,何培新,鄭俊麗

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450002)

研究超聲波輔助提取鐵棍山藥水溶性多糖的最佳工藝條件,并對所提取的粗多糖進(jìn)行了體外自由基抗氧化性活性研究.結(jié)果表明,超聲波輔助法的最佳工藝條件為:超聲波功率 800 W,提取溫度 60℃,超聲時(shí)間 30 min,料液比為 1︰30.在此最佳工藝條件下,粗多糖得率為 4.6%.體外抗氧化性試驗(yàn)表明,所提取粗多糖具有清除和OH自由基的能力,其中對清除率達(dá)到 93.75%.

鐵棍山藥;多糖;超聲提取;抗氧化性

0 引言

山藥 (D ioscorea oppositaThunb),又名白菩、土薯、大薯、薯藥,為薯蕷科 (D ioscoreaceae)山藥屬(D ioscroreal),薯蕷科多年生草本植物,營養(yǎng)豐富,具有很高的藥療價(jià)值.《本草綱目》記載:山藥性溫、味甘平、無毒,健脾胃、益肺腎、澀精止瀉;山藥還具有抗衰老、抗氧化、提高應(yīng)激力、增強(qiáng)免疫力、降血脂、抗腫瘤、抗突變等功效[1].近年來的研究表明,山藥中起藥效作用的主要成分是山藥多糖[2-4].目前,山藥多糖的提取主要采用水提法,該方法操作簡便,但浸提周期長,多糖得率低.與傳統(tǒng)水提法相比,超聲波提取法可利用空化作用加速細(xì)胞壁破碎,促進(jìn)多糖溶出,縮短提取時(shí)間.本研究采用超聲波處理的方法,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)得出提取鐵棍山藥多糖的最佳工藝,并研究了山藥多糖在體外對·OH和自由基的清除作用,希望為鐵棍山藥的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供參考數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮鐵棍山藥購自河南省焦作市溫縣.其余試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑.

1.2 儀器與設(shè)備

JY96—Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司;RE—52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;722型紫外可見光分光光度計(jì):上海分析儀器總廠.

1.3 試驗(yàn)方法

鐵棍山藥多糖提取工藝流程:山藥片→70℃熱風(fēng)干燥→粉碎過 40目篩→石油醚脫脂→80%乙醇回流→超聲波輔助水浸提→離心取上清液→Sevage法除蛋白質(zhì)→濃縮→乙醇沉淀、離心 (醇析法)→乙醇洗滌 →低溫干燥 →鐵棍山藥粗多糖.

干燥的鐵棍山藥粉碎,過 40目篩,稱取 5 g山藥粉置索氏提取器中,加入石油乙醚 (60～90℃)150 mL,90℃回流脫脂 5 h;脫脂之后加入80%乙醇,90℃回流 2次 (每次 2 h),除去單糖、多酚、低聚糖和皂苷等小分子物質(zhì);乙醇揮發(fā)后,按照不同的超聲功率、浸提時(shí)間、浸提溫度和料液比進(jìn)行單因素提取.將多次重復(fù)提取的多糖,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮,加 95%乙醇析出多糖,沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后再加 95%乙醇醇析,反復(fù) 3次,將沉淀用無水乙醇洗滌,真空干燥,得山藥水溶性多糖.采用 Sevage法去除提取山藥多糖中的蛋白質(zhì),少量蒸餾水溶解山藥多糖,按粗多糖溶液與氯仿 -正丁醇 (體積比為 4︰1)混合液以體積比5︰1混合,充分振蕩 30 min靜置分層,4 200 r/min離心 15 min,可見凝膠狀的蛋白質(zhì)析出,吸出上清液,進(jìn)行雙縮脲試驗(yàn),檢測有無蛋白,至陰性為止.上清液用再加入 4倍體積的無水乙醇,4℃保持12 h,然后 5 000 r/min離心 15 min,收集沉淀 ,用無水乙醇洗滌 2次,即得脫蛋白山藥多糖.

多糖得率的計(jì)算方法:

粗多糖得率 =粗多糖的質(zhì)量 (g)/山藥粉的質(zhì)量(g).

多糖含量的測定采用苯酚 -硫酸法,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品.

1.4 單因素對山藥多糖提取效果的影響

1.4.1 超聲功率

在提取時(shí)間 30 min,料液溫度 60℃,料液比1︰20的條件下,分別采用表1中各功率,提取山藥多糖.

1.4.2 料液溫度

在超聲功率 600 W,提取時(shí)間 30 min,料液比1︰20的條件下,分別采用表1中溫度,提取山藥多糖.

1.4.3 提取時(shí)間

在超聲功率 600 W,提取溫度 60℃,料液比1︰20的條件下,分別采用表1中提取時(shí)間,提取山藥多糖.

1.4.4 料液比

在超聲功率 600 W,提取時(shí)間 30 min,提取溫度 60℃,分別采用表1中料液比,提取山藥多糖.

表1 _鐵棍山藥多糖提取工藝中各因素與水平_

1.5 多糖抗氧化性測定

1.5.1 山藥多糖對·OH的清除作用

利用 Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH,采用 2-脫氧 -D-核糖法測定山藥多糖對·OH的清除作用:試管中依次加入 0.6 mL KH2PO4-KOH緩沖液 (50 mmol/L,pH 7.4)、0.15 mL一定濃度的多糖溶液、0.15 mL EDTA溶液 (1 mmol/L)、0.15 mL FeCl3(1 mmol/L)、0.15 mL H2O2(12 mmol/L)、0.15 mL 2-脫氧 -D-核糖 (60 mmol/L)和 0.15 mL抗壞血酸(2 mmol/L).然后將試管置于 37℃水浴鍋中水浴 1 h,取出后迅速加入 1.5 mL 25%HCl和 1.5 mL 1%硫代巴比妥酸 (TBA),在沸水中加熱 20 min后取出,冷卻,于 532 nm處測定吸光度值,對照組以蒸餾水代替待測樣品.按照下式計(jì)算清除率:

采用核黃素 -光照法[6]:用磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH 7.8)分別配制 0.1 mmol/L NBT溶液,0.1 mmol/L核黃素溶液,0.1 mol/LL-蛋氨酸溶液.在試管中依次加入 0.075 mL提取多糖樣品、0.3 mL NBT、0.15 mLL-蛋氨酸 ,0.15 mL核黃素和 4.4 mL磷酸鹽緩沖液,混勻,對照組以蒸餾水代替待測樣品.在暗箱光照 30 min之后在560 nm處測定吸光度值.按照下式計(jì)算清除率:

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同單因素條件下提取的山藥多糖含量見圖1.由圖 1可見,溫度的升高有利于山藥多糖的提取,這是因?yàn)榈蜏夭焕谥参锒嗵堑娜芙?溫度達(dá)到 80℃,多糖提取率達(dá)到最大值;提取時(shí)間的延長有利于提取,當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到 90 min后,多糖提取率變化不明顯.隨著超聲功率的增加,山藥多糖提取率不斷提高,達(dá)到 800 W后,多糖提取率趨于穩(wěn)定.在料液比 1︰20以后,增加水量對提取效果的影響很小.

圖1 單因素不同條件下的山藥多糖含量

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間和料液比做 4因素 3水平 L9(34)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

從極差結(jié)果得出影響多糖提取率的因素大小為 RA＞RC＞RD＞RB,即提取溫度 ＞超聲功率 ＞料液比 ＞提取時(shí)間.方差分析結(jié)果表明,提取溫度對山藥多糖提取率影響顯著;超聲功率、提取時(shí)間和料液比對山藥多糖提取率影響不顯著.因此,最佳提取條件為 A2C2D3B1,即超聲功率 800 W,提取溫度為 60℃,提取時(shí)間為 30 min,料液比為1︰30.在此條件下提取山藥多糖提取率為 4.6%.

2.3 山藥多糖對·OH的清除作用

羥自由基的化學(xué)性質(zhì)極為活潑,也是毒性最大的自由基,可以與多種有機(jī)物或無機(jī)物反應(yīng).鐵棍山藥多糖對·OH作用效果見圖 2.隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,·OH的清除率逐步提高,當(dāng)多糖的質(zhì)量濃度為 16 mg/mL時(shí),·OH的清除率達(dá)到53.81%.

圖2 山藥多糖對羥基自由基清除效應(yīng)

2.4山藥多糖對的清除作用

圖3 山藥多糖對超氧陰離子自由基清除效應(yīng)

3 結(jié)論

本研究在超聲波功率、超聲波輔助時(shí)間、提取溫度、料液比各單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)得出了超聲波輔助提取山藥多糖的最佳工藝條件,即超聲波功率 800 W,提取溫度 60℃,超聲時(shí)間 30 min,料液比 1︰30.采用該工藝提取鐵棍山藥多糖,山藥多糖得率為 4.6%,比文獻(xiàn)報(bào)道的高出 3倍多[7-8],提取時(shí)間也縮短 20 min,這主要因?yàn)槌暡ǖ目栈饔谩嵝?yīng)、機(jī)械作用可加速細(xì)胞壁破碎,促進(jìn)胞內(nèi)多糖溶出,縮短了提取時(shí)間.鐵棍山藥多糖具有較好的抗氧化活性,對·OH和自由基的清除率可分別達(dá)到53.81%和93.75%.因此,采用此工藝提取山藥多糖對實(shí)際生產(chǎn)和山藥多糖藥用價(jià)值研究有一定的指導(dǎo)意義,但多糖的純化有待進(jìn)一步研究.

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ULTRASON IC EXTRACTION TECHNOLOGY OFWATER-SOLUBLE POLYSACCHAR IDES FROMD IOSCOREA OPPOSI TATHUNB.CV.TIEGUN AND IN V ITRO ANTI-OXIDANT ACTIV ITY

WEI Tao,HE Pei-xin,ZHENG Jun-li
(School of Food and B ioengineering,Zhengzhou University of L ight Industry,Zhengzhou450002,China)

The paper studied the optimal conditions for ultrasonic-assisted extracting water-soluble crude polysaccharides fromD ioscorea oppositaThunb.CV.Tiegun,and studied the in vitro antioxidant activities of the crude polysaccharides.The results showed that the optimal conditions were as follows:ultrasonic power 800 W,extraction temperature 60 ℃,ultrasonic t ime 30 min,and solid-liquid ratio 1︰30;and the yield of the crude polysaccharides reached 4.6%.The in vitro antioxidant test showed that the crude polysaccharides could scavengeand·OH free radicals,and thescavenging rate reached 93.75%.

D ioscorea oppositaThunb.CV.Tiegun;polysaccharide;ultrasonic extraction;antioxidant activity

TS201.2

B

1673-2383(2010)06-0025-04

2010-09-04

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目 (102102210063);鄭州輕工業(yè)學(xué)院博士科研基金(000544)

魏濤(1980-),男,河南焦作人,講師,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù).