王德彬,彭 焱,覃 瑞,陳 玉

（1.中南民族大學(xué)藥學(xué)院,武漢430074;2.武漢生物制品研究所血液制劑室,武漢 430060;3.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢430074;4.中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,武漢替換為 430074）

鏈球菌制劑預(yù)防性治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖尿病機(jī)理研究

王德彬1,彭 焱2,覃 瑞3,陳 玉4＊

（1.中南民族大學(xué)藥學(xué)院,武漢430074;2.武漢生物制品研究所血液制劑室,武漢 430060;3.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢430074;4.中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,武漢替換為 430074）

為了探討鏈球菌制劑預(yù)防性治療糖尿病的機(jī)理,以純系的自發(fā)性糖尿病NOD小鼠和鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病鼠為動(dòng)物模型,從5周～20周皮下注射鏈球菌制劑0.1 mg/只,對(duì)照組注射等量生理鹽水,觀察其發(fā)病率.至40周時(shí)鏈球菌制劑組均未發(fā)病,而生理鹽水組發(fā)病率為70%.取胰腺組織作病理切片,Fas、FasL染色及胰島β細(xì)胞染色.未發(fā)病鼠無Fas表達(dá),但有FasL的表達(dá);已發(fā)病鼠有Fas的表達(dá);經(jīng)鏈球菌制劑免疫后小鼠有 FasL表達(dá).相同的結(jié)果也出現(xiàn)在以鏈脲霉素（STZ）誘導(dǎo)的遲發(fā)型糖尿病模型鼠中.鏈球菌制劑可能通過改變Fas L/Fas系統(tǒng)在胰腺組織的表達(dá),來預(yù)防性治療糖尿病,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用.

A群溶血性鏈球菌制劑;糖尿病;NOD小鼠;鏈脲霉素

糖尿病是一種急性或慢性的代謝障礙性疾病,主要是由于胰島素的絕對(duì)或相對(duì)缺乏所引起.已有大量事實(shí)證明,無論是1型糖尿病還是2型糖尿病,其發(fā)病均與胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞功能異常有關(guān),尤其是與β細(xì)胞的功能不足有很大關(guān)系.糖尿病已成為人類第5位死亡主因,并且還可能引發(fā)多種并發(fā)癥[1].因此,眾多的中外學(xué)者對(duì)其發(fā)病機(jī)理和治療方法進(jìn)行了積極的研究.糖尿病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,隨著免疫學(xué)研究的逐步深入,證實(shí)凋亡在免疫系統(tǒng)的平衡中是一個(gè)關(guān)鍵因素,凋亡機(jī)制的破壞可能是自身免疫失調(diào)的原因.鏈球菌制劑作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,已廣泛應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療,使用安全,來源豐富.它與國外的A群溶血性鏈球菌OK-432[2]屬同類制劑,能直接殺傷腫瘤細(xì)胞及改善機(jī)體免疫功能,本實(shí)驗(yàn)以糖尿病動(dòng)物為模型,研究鏈球菌制劑在體內(nèi)預(yù)防性治療糖尿病的機(jī)制,為開發(fā)鏈球菌制劑新的適應(yīng)癥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組

選用30只5周齡雌性NOD小鼠（購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）.隨機(jī)分為兩組,一組20只,為實(shí)驗(yàn)組,皮下注射鏈球菌制劑 0.1 mg/只/周,共15周;另一組10只,為對(duì)照組,每周皮下注射等量生理鹽水.所有小鼠喂食普通飼料并自由飲水.另取20只8周齡雌性NOD小鼠（購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）,以300 mg/kg CP（環(huán)磷酰胺）一次性腹腔注射,隨機(jī)分為兩組,每組10只,一組皮下注射鏈球菌制劑0.1 mg/只,連續(xù)注射7 d,另一組皮下注射等量生理鹽水7 d.

1.2 采血方法、血樣處理及血糖測定

采用上海生物制品研究所提供的葡萄糖氧化酶法試劑盒測血糖.小鼠10周齡以后每周監(jiān)測血糖,統(tǒng)計(jì)小鼠發(fā)病率.

1.3 自發(fā)性糖尿病 NOD鼠胰島β細(xì)胞 FAS及

FAS-L免疫組化染色

NOD小鼠開腹,分離胰腺,取胰尾入10%甲醛固定6 h,常規(guī)梯度酒精脫水,透明,浸蠟,包埋,常規(guī)切片脫蠟至水.Insulin Ab-6（INS04+INS05）:晶美公司,對(duì)胰島細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色;采用武漢博士德生物工程有限公司提供的免疫組化染色試劑盒對(duì)胰島β細(xì)胞進(jìn)行 FAS、FAS-L免疫組化染色.

1.4 鏈球菌制劑對(duì)鏈脲霉素誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型糖尿病的治療作用

正常昆明種小鼠（武漢生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,20～22 g）以10 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲霉素,每周1次,連續(xù)5周誘導(dǎo) PBS鼠,血糖檢測結(jié)果表明小鼠血糖在第2周開始升高,在注射5周后發(fā)生遲發(fā)型糖尿病.實(shí)驗(yàn)組1為模型鼠,成模后立即以鏈球菌制劑連續(xù)治療7 d;實(shí)驗(yàn)組2為模型鼠,成模7 d后以鏈球菌制劑連續(xù)治療7 d;實(shí)驗(yàn)組3為模型鼠,成模14 d后以鏈球菌制劑連續(xù)治療7 d;實(shí)驗(yàn)組4為模型鼠,成模21 d后以鏈球菌制劑連續(xù)治療7 d,觀察鏈球菌制劑的治療效果.

1.5 鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病模型鼠胰島β細(xì)胞FAS及FAS-L免疫組化染色

方法同1.3.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 NOD小鼠糖尿病的發(fā)病率

本實(shí)驗(yàn)中用鏈球菌制劑處理的20只雌性NOD鼠直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束（40周）沒有發(fā)病鼠（見表1）,對(duì)照組（10只）于第14周開始出現(xiàn)糖尿病鼠,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)發(fā)病率達(dá)到了70%（7/10）.而注射環(huán)磷酰胺的20只NOD鼠,10只經(jīng)鏈球菌制劑免疫的均未發(fā)病,對(duì)照組10只發(fā)病率達(dá)到了80%（8/10）.說明鏈球菌制劑完全可以預(yù)防NOD鼠糖尿病的自然發(fā)生和環(huán)磷酰胺促發(fā)的糖尿病的發(fā)生.

表1 鏈球菌制劑對(duì)NOD小鼠發(fā)病率的影響Tab.1 Effects of kanserin on incidence of diabetes in female NOD mice

2.2 自發(fā)性糖尿病 NOD鼠胰腺組織胰島β細(xì)胞染色及免疫組化染色

取未發(fā)病鼠、已發(fā)病鼠及經(jīng)鏈球菌制劑免疫后小鼠的胰腺組織作病理切片,每張病理切片均作Fas和Fas-L的單個(gè)染色.

圖1 未發(fā)病NOD鼠的胰島β細(xì)胞Fig.1 The pancreatic isletβcell of non-diabetic NOD mouse（400×）

圖2 已發(fā)病NOD鼠的胰島β細(xì)胞Fig.2 The pancreatic isletβcell of diabetic NOD mouse（400×）

圖3 鏈球菌制劑處理過的NOD鼠胰島β細(xì)胞Fig.3 The pancreatic isletβcell of hemolytic streptococci-treated NOD mouse（400×）

2.2.1 胰島β細(xì)胞染色 鏈球菌制劑對(duì)受損的胰島β細(xì)胞具修復(fù)作用,對(duì)保持胰島β細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、維持正常的生理功能有著重要的作用,在一定意義上阻止了糖尿病的發(fā)生.

2.2.2 胰島β細(xì)胞Fas及FasL染色 未發(fā)病鼠:胰島β細(xì)胞無Fas表達(dá),但表達(dá)FasL.

已發(fā)病鼠:胰島β細(xì)胞有 Fas的表達(dá),周圍有表達(dá)FasL的細(xì)胞浸潤.

鏈球菌制劑免疫后小鼠:胰島β細(xì)胞有 FasL的表達(dá),不表達(dá) Fas.

提示Fas的異常表達(dá)與糖尿病的發(fā)生有關(guān),Fas-FasL途徑是糖尿病發(fā)病過程中β細(xì)胞凋亡的方式之一,也說明了鏈球菌制劑對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用.

2.3 鏈球菌制劑對(duì)鏈脲霉素誘導(dǎo)遲發(fā)型糖尿病鼠

的治療作用

多次注射小劑量STZ后誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生輕度改變,自身被激活的 T淋巴細(xì)胞將胰島β細(xì)胞當(dāng)作靶細(xì)胞進(jìn)行攻擊,從而導(dǎo)致自身免疫過程的發(fā)生,誘導(dǎo)遲發(fā)型糖尿病,該過程類似于人的1型糖尿病.應(yīng)用鏈球菌制劑對(duì)成模小鼠進(jìn)行治療,發(fā)現(xiàn)間隔7 d、14 d注射的兩組各有1只血糖恢復(fù)正常,而成模后馬上注射及間隔21 d注射的,沒有治療效果.

圖4 未發(fā)病NOD鼠胰島細(xì)胞表達(dá)Fas-LFig.4 Expressed Fas-L on islet of non-diabetic NOD mouse（400×）

圖5 已發(fā)病NOD鼠胰島細(xì)胞表達(dá)FasFig.5 Expressed Fas on islet of diabetic NOD mouse（400×）

2.4 取鏈脲霉素誘導(dǎo)遲發(fā)型糖尿病鼠胰島β細(xì)胞免疫組化染色

取正常組、模型組、鏈球菌制劑治療組小鼠胰腺組織Fas及FasL免疫組化染色.

正常組:胰島β細(xì)胞無 Fas表達(dá),但表達(dá)FasL.

模型組:胰島β細(xì)胞有 Fas的表達(dá),周圍有表達(dá)FasL的細(xì)胞浸潤.

鏈球菌制劑治療組:胰島β細(xì)胞有FasL的表達(dá),不表達(dá) Fas.

說明鏈球菌制劑對(duì)STZ誘導(dǎo)的遲發(fā)型糖尿病鼠胰島β細(xì)胞損傷有一定的修復(fù)作用.研究結(jié)果提示,Fas-FasL途徑可能也是STZ誘發(fā)的遲發(fā)型糖尿病鼠胰島β細(xì)胞凋亡的方式之一.

圖6 鏈球菌制劑處理的NOD鼠胰島細(xì)胞表達(dá)Fas-LFig.6 Expressed Fas-L on islet of hemolytic streptococci-treated NOD mouse（400×）

圖7 未發(fā)病鼠胰島細(xì)胞表達(dá)Fas-LFig.7 Expressed Fas-L on islet of non-diabetic mouse（400×）

圖8 以鏈脲霉素誘導(dǎo)的遲發(fā)型糖尿病鼠胰島細(xì)胞表達(dá)FasFig.8 Expressed Fas on islet of delayed diabetic mice with STZ（400×）

圖9 經(jīng)鏈球菌制劑治療的遲發(fā)型糖尿病鼠胰島細(xì)胞表達(dá)Fas-LFig.9 Expressed Fas-L on islet of delayed diabetic mice with STZ by hemolytic streptococci-treated（400×）

3 討 論

3.1 鏈球菌制劑對(duì) NOD小鼠糖尿病的發(fā)病率的影響

NOD鼠是1型糖尿病的動(dòng)物模型[3],楊竹林[4]等從10周齡開始觀察NOD鼠是否有糖尿病（DM）癥狀出現(xiàn),當(dāng)出現(xiàn)多飲、多尿、消瘦等癥狀時(shí),斷尾取血測定血糖值,若連續(xù)2次>11.1 mmol/L,則確定為糖尿病.環(huán)磷酰胺（CP）可選擇性地去除某些抑制性 T細(xì)胞的功能而加速NOD鼠發(fā)病.本實(shí)驗(yàn)表明鏈球菌制劑可以阻止糖尿病的發(fā)生,且早期注射鏈球菌制劑的未發(fā)病NOD鼠血清胰島素水平遠(yuǎn)高于發(fā)病鼠,而胰島素由胰腺β細(xì)胞分泌,提示鏈球菌制劑對(duì)早期受損的胰島β細(xì)胞具有保護(hù)和修復(fù)作用.

3.2 NOD鼠胰腺組織胰島β細(xì)胞染色及免疫組化染色

隨著細(xì)胞組織免疫化學(xué)染色技術(shù)的飛速發(fā)展,在糖尿病機(jī)制的研究中有關(guān)β細(xì)胞形態(tài)學(xué)的探討越來越受到人們的重視[5].本實(shí)驗(yàn)中胰島β細(xì)胞染色結(jié)果顯示,發(fā)病組切片與正常組切片比較,兩者在形態(tài)學(xué)上有很大差異,發(fā)病組胰島數(shù)目少,β細(xì)胞松散排列,分布不規(guī)則.鏈球菌制劑免疫組胰島β細(xì)胞的形態(tài)與未發(fā)病組無大的差別,說明鏈球菌制劑對(duì)NOD鼠β細(xì)胞的形態(tài)有明顯的改善作用.

作為在中樞和周圍淋巴器官選擇淋巴細(xì)胞庫的方式,凋亡機(jī)制的破壞可能是自身免疫失調(diào)的發(fā)病原因.Fas（CD95）屬于腫瘤壞死因子受體家族,FasL和Fas結(jié)合后,通過活化下游的凋亡通路可誘導(dǎo)表達(dá)Fas細(xì)胞的凋亡.本實(shí)驗(yàn)采用 Fas/FasL免疫組化方法對(duì)胰腺組織進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn),未發(fā)病鼠胰島β細(xì)胞在正常情況下表達(dá) FasL,但不表達(dá)Fas;發(fā)病鼠許多細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)可促進(jìn)胰島β細(xì)胞大量表達(dá)Fas,其附近有表達(dá)FasL的細(xì)胞浸潤,說明1型糖尿病β細(xì)胞凋亡與 Fas/FasL通路的活化密切相關(guān),1型糖尿病β細(xì)胞凋亡主要是Fas的異常表達(dá)所致,而胰島內(nèi)細(xì)胞因子的異常也增強(qiáng)了Fas和FasL之間的相互作用.

3.3 鏈球菌制劑對(duì)鏈脲霉素誘導(dǎo)遲發(fā)型糖尿病鼠的治療作用

自Rakieten[6]等文獻(xiàn)6中為1963年首次報(bào)告鏈脲霉素（streptozotocin STZ）有致糖尿病的作用以來,國內(nèi)外有學(xué)者利用不同劑量的STZ來復(fù)制糖尿病模型.STZ為一種廣譜抗菌素,具有抗菌、抗腫瘤的性能,但它同時(shí)具有致糖尿病的副作用[7],對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胰島β細(xì)胞具有高度選擇性的毒性作用,是目前使用最廣泛的糖尿病動(dòng)物模型化學(xué)誘導(dǎo)劑.Junod等[8]通過光鏡觀察表明,STZ能直接破壞胰島的β細(xì)胞,導(dǎo)致胰島功能受損,血糖升高.STZ誘導(dǎo)小鼠糖尿病高血糖狀態(tài)持續(xù)3周以上確定為DM小鼠模型[9].注射小劑量STZ,誘導(dǎo)胰島細(xì)胞發(fā)生輕度改變,炎性細(xì)胞浸潤并釋放細(xì)胞因子,放大細(xì)胞損傷效應(yīng),最終導(dǎo)致遲發(fā)型糖尿病[10-11].本實(shí)驗(yàn)以鏈球菌制劑治療遲發(fā)型糖尿病鼠,剛成模的小鼠因?yàn)槠湟葝u浸潤細(xì)胞主要為炎性細(xì)胞,注射鏈球菌制劑后,激活機(jī)體的淋巴細(xì)胞,增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能,進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng),因而仍然保持高血糖水平.間隔一段時(shí)間后,鏈球菌制劑通過上調(diào) TH2型細(xì)胞因子,從而下調(diào) TH1型細(xì)胞因子,對(duì)輕度受損的胰島β細(xì)胞進(jìn)行修復(fù),從而起到降低血糖的作用.通過免疫組化染色觀察模型鼠與正常鼠及鏈球菌制劑治療鼠的胰島改變及Fas的表達(dá),證明鏈球菌制劑對(duì)STZ造成的糖尿病鼠胰島β細(xì)胞損傷有一定的修復(fù)作用,對(duì)保持胰島β細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、維持正常的生理功能有著重要的作用,在一定意義上防止了糖尿病的發(fā)生.提示促進(jìn)受損胰島β細(xì)胞的修復(fù),保護(hù)胰島β細(xì)胞是鏈球菌制劑治療糖尿病的機(jī)理之一.

需要指出的是,NOD鼠與遲發(fā)型糖尿病鼠雖然都是1型糖尿病動(dòng)物模型,但NOD鼠從患胰島炎到發(fā)生糖尿病,時(shí)間間隔幾個(gè)月,當(dāng)糖尿病確診時(shí),胰島受損已很嚴(yán)重,且體重大為減輕,此時(shí)用鏈球菌制劑治療,可能太晚,這也是鏈球菌制劑對(duì)速發(fā)型糖尿病鼠沒有治療效果的原因.

4 結(jié)論

鏈球菌制劑能阻止NOD鼠糖尿病的自然發(fā)生及環(huán)磷酰胺促發(fā)的NOD鼠糖尿病的發(fā)生,Fas-FasL途徑是糖尿病發(fā)病過程中β細(xì)胞凋亡的方式之一.鏈球菌制劑對(duì)正常胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用,促進(jìn)輕度受損胰島β細(xì)胞的修復(fù)可能是鏈球菌制劑治療糖尿病的機(jī)理之一.鏈球菌制劑對(duì)糖尿病的預(yù)防性治療作用可作為該藥新的適應(yīng)癥可能應(yīng)用于臨床.

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Abstract:To study the effectiveness of Group A hemolytic streptococci on diabetes mellitus in mice model and its possible mechanism.female NOD mice of Group A hemolytic streptococci-treated group were injected with 0.1 mg Group A hemolytic streptococci weekly from 5 weeks to 20 weeks and control group with 0.1ml NS（normal saline）to investigate the incidence.The mice were sacrificed at 40 wk or when diabetes occurred.The pancreatic tissues were routinely processed and underwent Fas and FasL staining with ABC immunohistochemical method,isletβcell stained through insulin Antibody.The incidence of diabetes in the Group A hemolytic streptococci group was zero which obviously less than 70%in the control group..Fas only expressed on islets of the mice suffering from diabetes,whereas Fas ligand expressed on islets of the mice injected with Group A hemolytic streptococci and NS.Similar results in rapid and delayed diabetic experimented models in Kun-ming mice with streptozotoein（STZ）.Group A hemolytic streptococci possessed the therapeutic and preventive effects on diabetic mice,The immune mechanism of Group A hemolytic streptococci treatment is closely related to the expression of Fas ligand/Fas system on the pancreatic tissues.Group A hemolytic streptococci appears to have a immune-regulatory effect on diabetes mice.

Key words:group A hemolytic streptococci;diabete;NOD mice;streptozotoein

Therapeutic and protective mechanism of Group A hemolytic streptococci on diabetes

WANG Debin1,PENG Yan2,Qin Rui3,CHEN Yu4
（1.College of Pharmacy,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074;2.Bolld Preparatious Lab,Wuhan Institute of Biologic Products,Wuhan 430060;3.College of Life Science,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074;4.College of Chemistry and Materials,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074）

R965.1

A

1000-1190（2010）04-0648-05

2010-05-30.

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2006ABA367）.

＊通訊聯(lián)系人.E-mail:chenyuwh888@126.com.