武繼民，汪鵬飛，李志宏，劉永清，袁曉燕

(1. 天津大學材料科學與工程學院，天津 300072；2. 軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生裝備研究所，天津 300161)

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factors，bFGF)是一種具有廣譜作用的促進組織或血管形成生長因子[1-2]．bFGF與其他生長因子一樣，在細胞外基質(ECM)中它是聯(lián)結細胞行為的專一信號因子，在創(chuàng)傷愈合中起到促血管化的主要作用 ，因此bFGF及其制劑的相關應用研究一直是組織工程支架材料、再生醫(yī)學及創(chuàng)傷治療領域最活躍的課題之一．但是，bFGF作為一種堿性多肽[5]，在體內(nèi)擴散快、對熱和酸敏感、易被蛋白酶分解、半衰期短，因此其生物學效應不能得到充分發(fā)揮．如何有效地發(fā)揮 bFGF的生物學效應制約著 bFGF的進一步體內(nèi)應用研究，藥劑學的緩釋技術較好地解決了這個問題．通過微球包埋，使 bFGF與外界的酶解環(huán)境相對隔離，能夠在相當長的時間內(nèi)緩釋藥物并使局部藥物濃度維持在一個相當?shù)乃剑?/p>

通過溶劑揮發(fā)法，以bFGF為藥物、PLGA為高分子載體材料制備 bFGF-PLGA微球，對 bFGF進行控釋釋放研究，取得了較好的實驗結果[5-6]．但是，藥物的微球緩釋技術雖然具有很大的開發(fā)潛力，卻仍存在很多問題．其中藥物體外釋放過程中的突釋問題就是制約微球制劑臨床應用的一個重要因素．膠原作為一種比較理想的天然載體材料，具備作為活性因子載體的基本條件，尤其是膠原海綿在作為組織工程支架或創(chuàng)傷敷料方面頗具優(yōu)勢[7]．筆者通過 bFGFPLGA微球與膠原基質的復合，制備載有 bFGFPLGA微球的膠原海綿，將 bFGF-PLGA微球包埋在膠原海綿表面和內(nèi)部結構當中，能夠很好地解決藥物釋放過程中的突釋問題，同時膠原基質與 bFGF具有生物學上的協(xié)同作用，二者結合能夠更好地發(fā)揮其生物學作用[8]．

1 材料和方法

1.1 試劑與設備

1.1.1 主要試劑

重組人的堿性成纖維細胞生長因子 rh bFGF，70,000,Au/支，北京雙鷺生物制藥有限公司．bFGF標準品，9,800,IU/mL，中國藥品生物制品檢定所．膠原，本實驗室自制．乳酸-羥基乙酸共聚物 poly(lactic-coglycolic acid)，PLGA(75/25)，相對分子質量 5.0×104，山東醫(yī)療器械研究所．聚乙烯醇 PVA，純度96%～98%，水解度 98%，聚合度 1,750±50，中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司．酶聯(lián)吸附免疫法 ELISA試劑盒，Sigma公司．二氯甲烷等其他試劑均為分析純．

1.1.2 主要設備

JSM-6700F型場發(fā)射掃描電鏡(日本)．X-520型高速勻漿機(美國)．78-1型磁力加熱攪拌器(江蘇金壇市富華電器廠)．CR22G型超速冷凍離心機(日本)．Freezone6型真空冷凍干燥機(美國)．DH4000A型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特醫(yī)療器械廠)．SHACA型水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)．MULTISKAN MK3全自動多功能酶標儀(美國)．

1.2 方法

1.2.1 bFGF-PLGA微球和載荷微球膠原海綿的制備

采用溶劑揮發(fā)法制備包埋 bFGF的 PLGA微球．將水溶性的 bFGF溶于生理鹽水中作為內(nèi)水相(W1)，PLGA 溶于二氯甲烷中作為油相(O)，2%的PVA水溶液作為外水相(W2)．(W1/O/W2的體積比為15∶2∶50，油相中 PLGA 濃度 10,mg/mL，)．將 W1逐滴滴入O中，以高速勻漿機在30,000,r/min下乳化1,min形成初乳(W1/O)；待初乳穩(wěn)定后，將初乳液滴入一定體積不同濃度的 PVA水溶液中(W2)，15,000,r/min下攪拌3,min形成復乳(W1/O/W2)．然后將復乳液倒入燒杯中，室溫下磁力攪拌揮發(fā) 3～5,h，過濾，3,500～5,000,r/min離心 15～20,min，去離子水洗滌、過濾后再離心，如此反復操作 3～5遍，直至將多于的PVA清除．將樣品-20,℃冷凍保存至少48,h；冷凍干燥24,h，收集微球粉末待用．

精確稱取定量的 bFGF-PLGA緩釋微球，均勻分散于膠原溶液中，將分散好的膠原凝膠置入直徑6,cm 厚 5,mm 的模具中，于 4,℃下靜置 24,h后，再在-20,℃冷凍 48,h，冷凍干燥 24～36,h，得到載荷bFGF-PLGA微球的膠原海綿．

1.2.2 bFGF-PLGA微球、膠原海綿及載荷微球膠原海綿的形貌觀察

制作相應的掃描電鏡觀察樣品，觀察表面形態(tài)結構，進一步了解微球與膠原海綿的復合情況．

1.2.3 ELISA檢測法及繪制標準曲線

采用雙抗體夾心ELISA法測試，采用抗人bFGF單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 bFGF與單抗結合，加入生物素化的抗人 bFGF抗體(二抗)，它將與結合在單抗上的人的 bFGF結合而形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與二抗的生物素結合，加入TMB顯色．在450,nm處測其吸光度(OD值)，bFGF濃度與OD值呈正比，可通過繪制標準曲線求出標本中bFGF濃度．

做標準曲線時，要扣除標準品稀釋液造成的本底．如果標本用標準品稀釋液稀釋，也要扣除標準品稀釋液造成的本底；如果標本未用標準品稀釋液稀釋，標本不需扣除標準品稀釋液造成的本底．以標準品濃度 600 pg/mL、300 pg/mL、150 pg/mL、75 pg/mL、37.5,pg/mL、18.75,pg/mL、9.38,pg/mL、0,pg/mL 之 OD值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，建立bFGF的標準曲線并得出標準方程(圖略)．然后根據(jù)樣品 OD值在該曲線圖上查出相應bFGF含量．

1.2.4 bFGF-PLGA微球中bFGF的載藥量和包封率測定

稱取20,mg微球，加入2,mL的二氯甲烷中，使其完全溶解，再加入1,mL 0.1,mol/L PBS緩沖溶液(pH=7.2)，充分攪拌、靜置、分液，收集水相凍存，利用ELISA測定樣品OD值．根據(jù)樣品OD值及標準曲線計算待測液中 bFGF的濃度，從而計算出微球中的bFGF含量，即可得微球的載藥量和包封率．

1.2.5 微球及載荷微球海綿的體外釋藥行為測定

精確稱取定量微球及載荷微球海綿置于透析袋中，緊密封口，然后置于 20,mL作為緩釋介質的 PBS緩沖溶液(pH＝7.2)中，37,℃下以100,r/min的速率恒溫恒速振蕩．分別在第 1/2,d、1,d、2,d、3,d、5,d、8,d、12,d、17,d、23,d、30,d、35,d、45,d 定時移去 2 mL 釋放介質于離心管中標號凍存待測并補充同樣體積的新鮮緩沖液．以PBS緩沖溶液為空白對照，ELISA法測吸光度值，檢測bFGF濃度．

式中：m1為微球或載荷微球海綿在緩沖液中溶出bFGF的量；m2為微球或載荷微球海綿中 bFGF的總量．

2 結果與討論

2.1 微球表面形貌

經(jīng) SEM 觀察，bFGF-PLGA微球表面光滑，球形好，且球呈中空狀．膠原海綿內(nèi)壁平滑，有明顯的纖維形態(tài)．如圖1所示．

圖1 bFGF-PLGA微球和膠原海綿的表觀形貌SEM圖Fig.1 SEM images of morphology of bFGF-loaded PLGA microspheres and collagen sponge

2.2 載荷bFGF-PLGA微球膠原海綿的形貌特征

圖 2為不同放大倍數(shù)下載荷微球膠原海綿的電鏡照片．從圖2可以看出，表面呈凸起狀，微球絕大部分包埋于膠原海綿內(nèi)壁．這種進一步包被從形態(tài)上可能避免藥物釋放過程中的突釋期，在一定程度上改善了藥物的體外釋放行為，使釋放更加平穩(wěn)并持續(xù)較長時間．

圖2 不同放大倍數(shù)下載荷微球海綿的形態(tài)結構SEM圖Fig.2 SEM images of morphology of collagen sponge integrated with bFGF-PLGA microspheres in different multiples

2.3 bFGF-PLGA微球載藥量、包封率和體外釋藥性質

經(jīng)檢測和計算，bFGF-PLGA緩釋微球的載藥量和包封率均值分別為0.059 9%± 0.001 9%和79.9% ±2.8%(n＝5)，釋藥行為測定結果見圖3．該載荷bFGF微球的膠原海綿的體外釋藥結果顯示其體外釋藥過程較為穩(wěn)定．膠原海綿載荷微球后，從第 5,d起開始平穩(wěn)釋放直至第 35,d(圖中近乎直線形式)．而微球本身從第 8,d后才平穩(wěn)釋放．bFGF微球載荷在膠原海綿后，bFGF突釋率(突釋率為微球中藥物在第 1,d的累積釋放率，由圖 3可得出相應數(shù)據(jù))為 14.6%，小于微球本身的突釋率 20.0%，證明微球與膠原海綿的復合能夠有效地減小藥物的突釋現(xiàn)象，這與海綿進一步包裹藥物微球有關．

近年來，組織工程研究愈來愈接近臨床應用，而組織工程支架材料是其真正得到規(guī)模應用的根本．像細胞外基質(ECM)的結構與功能那樣，只有在支架材料中載荷穩(wěn)定而又控釋的生長因子，才會對細胞和組織的生存提供理想的環(huán)境．本文所構建的載荷 bFGF-PLGA微球的膠原海綿有望發(fā)展成為一種具有對 bFGF進行中長期緩釋功能的組織工程支架，為研制符合臨床治療需要的中長效注射制劑提供實驗依據(jù)．同時，載荷 bFGF-PLGA微球的膠原海綿支架的研究又為深度創(chuàng)傷敷料的組織修復奠定基礎．bFGF的持續(xù)釋放特點將有效地促進組織再生和血管化過程[9]，期望載荷 bFGF微球的膠原海綿成為理想的組織工程支架材料或創(chuàng)傷修復材料．

圖3 bFGF-PLGA微球及其載荷微球膠原海綿的體外釋藥曲線Fig.3 In vitro release curves of bFGF-loaded PLGA Fig.3 microspheres with and without collagen sponge

3 結 論

(1)bFGF-PLGA微球表面圓滑，載藥量和包封率分別達到 0.059 9%± 0.001 9%和 79.9% ± 2.8%．

(2)bFGF-PLGA微球的膠原海綿緩釋體系中，微球包埋在膠原海綿表面和內(nèi)部結構當中，分散均勻．

(3)bFGF-PLGA微球的膠原海綿，體外釋放藥物比較穩(wěn)定，較之微球本身，其藥物有效緩釋時間更長．通過 bFGF-PLGA 微球與膠原基質的復合，能夠有效解決藥物釋放過程中的突釋問題，突釋率由20.0%降到14.6%．

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